Artículo de método

Un método de inoculación fácil y flexible para evaluar con precisión los fenotipos de infección por mildiú polvoriento de Arabidopsis y otras plantas

DOI:

10.3791/62287

⸱

9 de marzo de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland, 2Department of Nutrition and Food Science, University of Maryland College Park, 3Department of Plant Sciences and Landscape Architecture, University of Maryland College Park

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo para construir un sistema simple de distribución de esporas que consiste en una caja de inoculación con una malla de ~ 50 μm y una cámara de plástico transparente. Esto se puede utilizar para inocular uniformemente las plantas con esporas de mildiú polvoriento, lo que permite una evaluación precisa y reproducible de los fenotipos de enfermedades de las plantas en estudio.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reducción de las pérdidas de cultivos debido a enfermedades fúngicas requiere una mejor comprensión de los mecanismos que rigen la inmunidad de las plantas y la patogénesis fúngica, lo que a su vez requiere una determinación precisa de los fenotipos de enfermedades de las plantas tras la infección con un patógeno fúngico en particular. Sin embargo, el fenotipado preciso de la enfermedad con patógenos fúngicos biotróficos no cultivables, como el mildiú polvoriento, no es fácil de lograr y puede ser un paso limitante de la velocidad de un proyecto de investigación. Aquí, hemos desarrollado un sistema de fenotipado de enfermedades seguro, eficiente y fácil de operar utilizando la interacción Arabidopsis-mildiú polvoriento como ejemplo. Este sistema consta principalmente de tres componentes: (i) una caja de inoculación de madera equipada con una tapa extraíble montada con una malla de acero inoxidable o nylon de poros de ~ 50 μm para inocular un plano de plantas con esporas de hongos, (ii) una cámara de plástico transparente con una pequeña abertura frontal para minimizar el escape de esporas mientras se realiza la inoculación en el interior, y iii) un método de distribución y desplazamiento de esporas para una inoculación uniforme y eficaz. Los protocolos descritos aquí incluyen los pasos y parámetros para hacer la caja de inoculación y la cámara de plástico a bajo costo, y una demostración en video de cómo usar el sistema para permitir una inoculación uniforme con esporas de mildiú polvoriento, mejorando así la precisión y la reproducibilidad del fenotipado de la enfermedad.

Introducción

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El mildiú polvoriento es una de las enfermedades más comunes e importantes de numerosos cultivos alimentarios y plantas ornamentales1. Los estudios de las enfermedades del mildiú polvoriento han sido muy populares, como lo demuestran más de 10,500 publicaciones como resultado de la búsqueda con "mildiú polvoriento" como palabra clave en Web of Science (a partir de noviembre de 2020). De hecho, el mildiú polvoriento (representado por Blumeria graminis) es considerado uno de los 10 principales patógenos fúngicos por la revista Molecular Plant Pathology2. La cuantificación de la susceptibilidad a enfermedades es un paso necesario en la caracterización de los genes de las plantas que contribuyen a la resistencia o susceptibilidad a las enfermedades, o la identificación funcional de genes efectores candidatos en el mildiú polvoriento. Sin embargo, el fenotipado confiable de la enfermedad es mucho más difícil con el mildiú polvoriento en comparación con la mayoría de los otros patógenos fúngicos, en parte porque, a diferencia de las esporas de estos últimos, las esporas de especies de mildiú polvoriento (como Golovinomyces cichoracearum UCSC1 según nuestra experiencia de laboratorio) muestran una viabilidad reducida después de pasar por un proceso de suspensión de agua 3,4 . La inoculación inadecuada y/o desigual de plantas de ensayo con un patógeno particular del mildiú polvoriento puede dar lugar a resultados de fenotipado inexactos.

Se informaron varios métodos de inoculación para estudios de mildiú polvoriento. Estos incluyen (i) cepillado de esporas directamente de las hojas infectadas para probar plantas5, (ii) pulverización de una suspensión de esporas para probar plantas6, (iii) soplado de esporas utilizando una torre de sedimentación operada por vacío a las plantas en la parte inferior de la torre7, y (iv) entrega de esporas mediante el uso combinatorio de una membrana de malla de nylon y vibración basada en el sonido8 . El método de cepillado de esporas (o desempolvado) es fácil de realizar pero de naturaleza desigual, por lo que puede no ser preciso para la evaluación cuantitativa. La pulverización de esporas es conveniente y uniforme, pero como se indicó anteriormente puede resultar en una germinación deficiente de las esporas4. Los dos últimos (es decir, iii-iv) son métodos muy mejorados capaces de lograr una inoculación uniforme; Sin embargo, ambos no son flexibles para ajustar su capacidad de inoculación en términos del número de plantas a inocular en un solo evento, por lo que cualquiera de los aparatos no es trivial, y su operación está restringida a áreas de laboratorio donde hay un vacío y / o fuente de electricidad.

Nuestro laboratorio ha estado trabajando con la interacción planta-mildiú polvoriento durante más de 20 años 9,10. Durante la última década, probamos una serie de métodos de inoculación y recientemente desarrollamos un método de inoculación de mildiú polvoriento simple pero efectivo. Este método de cepillado de esporas basado en malla puede garantizar una inoculación uniforme, y es simple y escalable, por lo que debe ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio que trabaje con mildiú polvoriento.

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Protocolo

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1. Hacer una caja de inoculación estándar con una tapa superior extraíble montada con una malla

  1. Compre un rollo de malla de membrana de nylon de 50 μm o malla de acero inoxidable de 48 μm (recomendado) en las tiendas. Asegúrese de pedir suficiente para cortar en múltiples piezas de 14 pulgadas x 26 pulgadas para reemplazar la malla desgastada.
  2. Compre un tablero de fibra de densidad media o madera contrachapada de densidad media de 1/4 de pulgada x 2 pies de 2 pies x 4 pies, y corte dos de 24-1/2 pulgadas x 10 en pedazos y dos de 12 pulgadas x 10 en pedazos para hacer una caja de inoculación. Utilice 8 abrazaderas de esquina para apoyar los cuatro lados.
    NOTA: Si está orientado hacia el lado ancho del recinto, el lado izquierdo de 12 pulgadas x 10 pulgadas está unido permanentemente y el lado derecho de 12 pulgadas x 10 pulgadas es una puerta extraíble sostenida en su lugar por cuatro ganchos magnéticos (Figura 1A, B).
  3. Coloque cuatro llaves de esquina de 2 pulgadas dos en cada esquina interior del lado izquierdo, a una pulgada de la parte superior y una pulgada de la parte inferior, marque y perfore un agujero. Use tornillos para fijar permanentemente el lado corto izquierdo a dos lados largos (delantero y posterior). La distancia interna entre los dos lados largos debe ser de 12 pulgadas y no de 11-1/2 pulgadas.
  4. Con las abrazaderas de esquina todavía en su lugar y la alineación adecuada de la puerta derecha, marque y perfore la ubicación de las 4 trampas magnéticas para mantener la puerta desmontable correcta en su lugar. Instale una perilla de botón en la puerta. La parte superior de la puerta queda atrapada debajo de la tapa superior (Figura 1A, B).
  5. Para hacer una tapa superior extraíble con una malla, corte la clavija cuadrada larga de madera en 2 juegos de 26 pulgadas y 12-3/4 pulgadas. Pegue y clave las cuatro piezas de tal manera que quepan alrededor de la caja: las dimensiones interiores del marco son un poco más grandes que las dimensiones exteriores de la caja, ya que la malla de la pantalla se unirá a este marco.
  6. Corte la malla de la pantalla a un poco menos de 14 pulgadas x 26 pulgadas. No permita que la pantalla sobresalga más allá del marco para evitar bordes afilados. Tenga ayuda para estirar la pantalla en el marco. Sujete la malla con el marco mediante abrazaderas (Figura 1C) y use una pistola grapadora con las grapas adecuadas para asegurar la pantalla al marco.
  7. Corte dos juegos de clavijas cuadradas de madera más cortas (21 pulgadas y 9 pulgadas) y use tornillos para intercalar firmemente la malla a lo largo del marco usando las 4 piezas más cortas de clavija cuadrada de madera (Figura 1C, D).

2. Hacer una cámara de inoculación

  1. Compre láminas de acrílico transparente y artículos de ferretería en las tiendas apropiadas. Corte una ventana de apertura de 7 pulgadas x 20 en la hoja de acrílico frontal de la caja, como se muestra en la Figura 2C.
  2. Ensamble los lados izquierdo y derecho, frontal (con ventana) y láminas de acrílico traseras en una caja usando 8 abrazaderas de esquina como se muestra en la Figura 2A. Asegúrese de que las medidas internas de la cámara sean iguales a las dimensiones de la hoja superior.
    NOTA: El lado derecho está ahí para soporte y no se unirá a las hojas delanteras o traseras. Es 1/2 pulgada más corto que las otras hojas a propósito. Este lado derecho se convertirá en una puerta de "solapa" de "bajada" sostenida en su lugar por una bisagra en ángulo recto en la parte inferior y dos trampas magnéticas en la parte superior como se muestra en la Figura 2C, D.
  3. Utilice llaves de esquina para asegurar los paneles juntos (Figura 2B, C). Mantenga los aparatos ortopédicos en su lugar, marque con un marcador de sharpie, perfore el punzón central y luego perfore el agujero.
    NOTA: Perforar acrílico es diferente de perforar cualquier otra cosa, no fuerce o el lado del orificio opuesto al taladro puede agrietarse. Use remaches o tornillos. No apriete demasiado los tornillos o el acrílico puede agrietarse con el tiempo.
  4. Gire la carcasa en su parte trasera y retire las 4 abrazaderas de esquina y coloque la hoja superior en su lugar. Marcar y perforar.
  5. Instale la bisagra de ángulo recto, hecha de una abrazadera angular de 3/4 pulgadas. Use una tuerca de bloqueo de retención de nylon como varilla de bisagra. No apriete, deje un espacio para que la puerta gire sobre esta bisagra.
  6. Marque, perfore centralmente, perfore y fije los dos imanes magnéticos de la puerta con tornillos de cabeza de bandeja # 6-32x3 / 4 ". Luego fije las placas de cierre con tornillos de cabeza plana #6-32x3/8", vea la Figura 2C, D.

3. Inoculación de plantas en pisos

  1. Prepare esporas frescas de oídio como inóculos (p. ej., oídio de Arabidopsis Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Cultivar plantas mutantes 11 de Arabidopsis inmunocomprometidas en una cámara de crecimiento (22 °C, 65% de humedad relativa durante 6-8 semanas) e inocular una o media plana de plantas pad4-1 para acumular suficientes esporas frescas de mildiú polvoriento (Figura 3A).
  2. Cultive las plantas para determinar los fenotipos de infección en estándar 11 en x 21 en x 2.5 en pisos.
    NOTA: Las plantas de Arabidopsis cultivadas en días cortos (8 h de luz, 16 h de oscuridad; 22 °C) durante seis a ocho semanas son buenas para las pruebas de infección con mildiú polvoriento.
  3. Cuando se disponga de esporas frescas de mildiú polvoriento de plantas infectadas a los 8-10 días después de la inoculación (dpi), mueva un plano de plantas para la prueba de infección a la caja de inoculación dentro de la cámara de inoculación (Figura 1B,2C).
  4. Corte 15-20 hojas de Arabidopsis muy infectadas (o 4-6 rosetas infectadas, dependiendo del tamaño de la hoja / roseta y el nivel de inoculación), deje que las hojas se sequen si hay agua condensada.
  5. Agarre 1-2 hojas o una roseta con un par de pinzas largas con una mano y mire las hojas boca abajo. Luego, coloque ambas manos a través de la abertura de la cámara y golpee suavemente el brazo de los fórceps con un par de tijeras mientras mueve lentamente las hojas / roseta por encima de la malla montada en la caja de inoculación (Figura 3B). Repita esto hasta que se usen todas las hojas o rosetas.
    NOTA: Las esporas maduras se desprenderán fácilmente de los conidióforos de las hojas infectadas. Trate de desalojar las esporas de la malla de la manera más uniforme posible.
  6. Use uno o dos cepillos finos de abanicos-licuadores para cepillar suavemente las esporas a través de la malla (Figura 3C). Asegúrese de cepillar toda la superficie de la malla en diferentes direcciones durante cuatro o más veces para maximizar la distribución uniforme de las esporas en las plantas en el fondo de la caja de inoculación (Figura 3D). Golpee suavemente la malla varias veces con los cepillos para sacudir las esporas que están atrapadas en la malla.
  7. Deje que las esporas se asienten durante medio minuto. Luego, saque el plano que contiene las plantas inoculadas de la caja de inoculación. Cubra el piso con una cúpula de plástico y colóquelo en una cámara de crecimiento (22 °C, 65% de humedad relativa). El fenotipado de la enfermedad se puede realizar a 5, o de 8 a 12 dpi 12.

4. Inocular las plantas con cajas de inoculación más pequeñas

NOTA: En los casos en que se vayan a inocular menos plantas, todavía se puede utilizar la caja de inoculación estándar. Asegúrese de colocar las plantas en el centro de la caja. Desaloje y cepille las esporas en el área de la malla que cubre las plantas para asegurarse de que todas las plantas estén inoculadas mientras se guardan los inóculos. Alternativamente, y preferiblemente, se pueden usar cajas de inoculación más pequeñas (como se describe a continuación).

  1. Convierte las cajas de cartón en una caja de inoculación. Simplemente retire los lados superior e inferior de la caja, pegue la esquina con cinta adhesiva para reafirmarla si es necesario y monte una malla de 50 μm del tamaño adecuado en la parte superior pegando o grapando (Figura 4A, B).
  2. Mueva el plano que contiene las plantas dentro de la cámara de inoculación, coloque la caja de inoculación más pequeña en la parte superior del plano para cubrir las plantas.
  3. Desaloje y cepille las esporas como se describió anteriormente.

5. Inocular hojas desprendidas en placas de Petri

NOTA: En los casos en que (i) las esporas frescas de mildiú polvoriento son muy limitadas y/o (ii) las plantas deben mantenerse limpias mientras que los fenotipos de la enfermedad y/o la localización subcelular de proteínas en las células infectadas deben evaluarse, las hojas desprendidas se pueden utilizar para la infección en placas de MS-agar.

  1. Haga una mini caja de inoculación que sea solo un poco más grande que una placa de Petri.
  2. Prepare placas de agar medio Murashige y Skoog (MS) de 1/2 fuerza (1.5%). Agregue tiabendazol (40 mg / L) para reducir la contaminación por moho si es necesario. Conservar los platos a 4 °C en nevera hasta su uso.
  3. Corte una o dos hojas completamente expandidas de la base del pecíolo para cada planta individual a probar. Inserte el pecíolo de las hojas desprendidas en medio de agar en un ángulo de ~ 30 °.
    NOTA: Cada placa puede contener 20-40 hojas dependiendo del tamaño de las hojas y la placa utilizada (Figura 4C).
  4. Inocular las hojas dentro de la cámara de inoculación como se describió anteriormente. Mueva la placa con la tapa a una cámara de crecimiento.
  5. Corte una pequeña sección de una hoja y verifique la localización subcelular de las proteínas en puntos de tiempo específicos.
  6. Para evaluar los fenotipos de infección, transfiera las hojas a una placa de MS-agar aséptica fresca a 4 o 5 dpi. Corte la base del pecíolo antes de insertar las hojas en el medio de agar fresco. Evaluar los fenotipos de la enfermedad a 8 o 9 dpi.

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Resultados

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Aquí, presentamos un nuevo método de inoculación de esporas de mildiú polvoriento que es fácil de preparar, operar y ajustar. La Figura 1 muestra el montaje de la caja de inoculación estándar con énfasis en la marca de la tapa extraíble montada con una malla de membrana de 50 μm. La figura 2 muestra el montaje de la cámara de inoculación. La Figura 3 ilustra los pasos clave del proceso de inoculación utilizando este sistema.

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Discusión

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Nuestro método de inoculación basado en caja mallada tiene varias ventajas sobre otros métodos de inoculación. En primer lugar, puede lograr una distribución uniforme de las esporas si se opera correctamente, como se demuestra en la Figura 5. En segundo lugar, el uso de malla de ~ 50 μm, más el desplazamiento de esporas mediante el suave movimiento de las hojas infectadas puede reducir la infección de las plantas por trips u otros insectos que infectan las plantas que están presentes en las ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Los autores desean agradecer a F. Coker y C. Hooks por el mantenimiento de la instalación de crecimiento de la planta, y a Jorge Zamora por la ayuda técnica asociada con la fabricación de la caja y la cámara de inoculación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  48 y micro; Pantalla de malla de rejilla de acero inoxidable M; Tamaño: 24" x 48"  AmazonNAPara hacer la tapa de una caja de inoculación
#6-32 x ¾ " tornillos de máquina, arandelas planas y tuercas Home DepotNAPara hacer una cámara de inoculación
#6-32 tuerca de seguridad de nylon galvanizado (paquete de 4)Home DepotNAPara hacer una cámara de inoculación
#6-32x3/8" Tornillos de máquina de cabeza plana Phillips, arandelas planas y tuercas Home DepotNAPara asegurar placas de retención de puertas magnéticas
#8-32x1/2" tornillos de máquina, arandelas planas y tuercasHome DepotNAPara asegurar tirantes de esquina y bisagras de puerta
Lámina enmascarada de película acrílica extruida transparente de 0.250 de espesor;   Tamaño: 17 y frac12; " X 20"Plásticos profesionalesSACR.250CEFPara la fabricación de una cámara de inoculación
de 0,250 de espesor de lámina enmascarada de película acrílica extruida transparente; Tamaño: 18" x 20"    Plásticos Profesionales  SACR.250CEFPara la fabricación de una cámara de inoculación
0,250 espesor de lámina enmascarada de película acrílica extruida transparente; Tamaño: 18" x 30"  Professional PlasticsSACR.250CEFPara la fabricación de una cámara de inoculación
0,250 de espesor de lámina enmascarada de acrílico extruido transparente; Tamaño: 20" x 29 y frac12; "Professional PlasticsSACR.250CEFPara hacer una cámara de inoculación
1-5/8" puerta de gabinete cierre magnético blancoHome DepotModelo #P110-WPara hacer una cámara de inoculación
" acero galvanizado abrazadera de esquina (8-Pack) Home Depot  Modelo #13611 Para hacer una caja y una cámara de inoculación
Abrazadera de esquina de 3"Herramientas de carga portuariaSKU 63653, 1852, 60589Para hacer la cámara de inoculación
Abrazadera de esquina galvanizada de acero de 3/4 "  (paquete de 4)Home DepotModelo #13542Para hacer una caja y cámara de inoculación
Manijas de puerta de servicio ligero galvanizadas de 4-7/8"Home DepotModelo #15184Para hacer una caja de inoculación
Batidora de ventilador fino pincelesMichaels StoreM10472846 Para la inoculación
Clavija cuadrada de madera Kelleher de 3/4" x 3/4" x 36"  Home DepotNAPara hacer la tapa de una caja de inoculación
Tableros de fibra de densidad media (1/4" x 2' x 4');  Home DepotModelo# 1508104Para hacer una caja de inoculación
Cubreobjetos de vidrio redondos con un 500 µ m gridibidi USA Inc.10816Para determinar la densidad de esporas
de de 2

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
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