Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Inn Chuan Ng; Li Zhang; Narelle Nichola Yi Ying Shen; Yun Ting Soong; Chan Way Ng; Phoebe Kang Sheing Koh; Yan Zhou; Hanry Yu

doi:10.3791/62289

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

5.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/62289

⸱

5 de abril de 2021

Inn Chuan Ng^*¹ , Li Zhang^*² , Narelle Nichola Yi Ying Shen³ , Yun Ting Soong⁴ , Chan Way Ng⁵ , Phoebe Kang Sheing Koh¹ , Yan Zhou³ , Hanry Yu¹^,³^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Physiology & The Institute for Digital Medicine (WisDM), National University of Singapore, ²College of Agriculture and Biology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, ³Mechanobiology Institute, National University of Singapore, ⁴Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A*STAR, ⁵NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, ⁶CAMP, Singapore-MIT Alliance for Research and Technology

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Resumen

Los hepatocitos primarios son ampliamente utilizados en la investigación básica sobre enfermedades hepáticas y para pruebas de toxicidad in vitro. El procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para el aislamiento primario de hepatocitos es técnicamente desafiante, especialmente en la canulación de la vena porta. El procedimiento también es propenso a la contaminación ocasional y las variaciones en las condiciones de perfusión debido a dificultades en el montaje, la optimización o el mantenimiento de la configuración de perfusión. Aquí, se presenta un protocolo detallado para un procedimiento mejorado de perfusión de colagenasa de dos pasos con control de perfusión multiparamétrico. Los hepatocitos primarios de rata se aislaron de manera exitosa y confiable tomando las precauciones técnicas necesarias en los pasos críticos del procedimiento, y reduciendo la dificultad operativa y mitigando la variabilidad de los parámetros de perfusión a través de la adopción de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura y monitoreo y sistema de alarma en tiempo real. Los hepatocitos primarios de rata aislados exhiben consistentemente una alta viabilidad celular (85% -95%), rendimiento (2-5 x 10⁸ células por rata de 200-300 g) y funcionalidad (actividad de albúmina, urea y CYP). El procedimiento se complementó con un sistema de perfusión integrado, que es lo suficientemente compacto como para instalarse en la campana de flujo laminar para garantizar un funcionamiento aséptico.

Introducción

Los hepatocitos primarios son herramientas importantes para la investigación básica relacionada con el hígado, el tratamiento de enfermedades y la aplicación, como las pruebas de drogas. El estándar de oro actual para el aislamiento primario de hepatocitos es el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos ^1,2,3 introducido por Seglen en la década de 1970⁴. Sin embargo, este procedimiento es técnicamente desafiante y tiene una alta tasa de fracaso cuando es realizado por cirujanos novatos. Incluso cuando una perfusión se considera exitosa, se ....