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Artículo de método

Medición de la absorción de glutamato utilizando L-[3H]-glutamato radiomarcado en cortes transversales agudos obtenidos de hipocampo resecado con roedores

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DOI:

10.3791/62292

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2 de octubre de 2021

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1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe una forma fiable y sencilla de obtener cortes transversales del hipocampo agudo ex vivo de ratones y ratas utilizando un picador de tejidos. Los cortes obtenidos de hipocampos resecados se pueden enviar para un análisis de absorción funcional de glutamato para investigar la homeostasis del sistema glutamatérgico.

Resumen

La eliminación de glutamato del espacio extracelular por transportadores dependientes de Na+ de alta afinidad es esencial para garantizar que los mecanismos de conectividad intrínsecos del cerebro funcionen correctamente y se mantenga la homeostasis. El hipocampo es una estructura cerebral única que gestiona las funciones cognitivas superiores, y es objeto de varios estudios sobre enfermedades neurológicas. La investigación de los mecanismos fisiológicos y patológicos en modelos de roedores puede beneficiarse de las preparaciones de cortes agudos del hipocampo (AHS). La AHS tiene la ventaja de proporcionar información fiable sobre la función celular, ya que se conservan la citoarquitectura y los circuitos sinápticos. Aunque las preparaciones de AHS se utilizan comúnmente en los laboratorios de neuroquímica, es posible encontrar algunas diferencias metodológicas en la literatura. Teniendo en cuenta que los protocolos distintivos de preparación de cortes podrían cambiar las regiones del hipocampo analizadas, este protocolo actual propone una técnica estándar para obtener AHS transversal a partir del hipocampo resecado. Este protocolo fácil de realizar puede ser utilizado en modelos experimentales de ratones y ratas y permite varios enfoques ex vivo que investigan la dinámica neuroquímica (en el hipocampo dorsal, intermedio y ventral) en diferentes contextos (por ejemplo, manipulaciones transgénicas) o después de manipulaciones in vivo (por ejemplo, tratamientos farmacológicos o modelos de roedores adecuados para estudiar trastornos clínicos). Después de diseccionar el hipocampo del cerebro del roedor, se obtuvieron cortes transversales a lo largo del eje septo-temporal (300 μm de grosor). Estas AHS contienen distintas partes del hipocampo y se sometieron a una investigación neuroquímica individual (por ejemplo: transportadores de neurotransmisores utilizando sus respectivos sustratos). Dado que el hipocampo presenta una alta densidad de sinapsis excitatorias, y el glutamato es el neurotransmisor más importante del cerebro, el sistema glutamatérgico es un objetivo interesante para los fenómenos observados in vivo. Por lo tanto, el protocolo actual proporciona pasos detallados para explorar la absorción de glutamato en AHS ex vivo utilizando L-[3H]-glutamato. El uso de este protocolo para investigar la función del hipocampo puede ayudar a comprender mejor la influencia del metabolismo del glutamato en los mecanismos de neuroprotección o neurotoxicidad.

Introducción

El hipocampo, una estructura cerebral enterrada en lo profundo del lóbulo temporal medial de cada hemisferio, donde se encuentran las funciones cognitivas altas, es una de las entidades más estudiadas del sistema nervioso central (SNC). La función del hipocampo está fuertemente relacionada con la memoria declarativa y espacial. Esta estructura también desempeña un papel en el comportamiento emocional y en la regulación de las funciones hipotalámicas 1,2,3,4. Desde que se confirmó, en esta región tienen lugar importantes mecanismos de formación y almacenamiento de la memoria y el campo comenzó a investigar en profundidad la región del hipocampo. En consecuencia, el uso de modelos animales que se asemejan a los trastornos cerebrales humanos relacionados con las funciones del hipocampo, como la enfermedad de Alzheimer, la epilepsia, la depresión mayor y el estrés, sigue creciendo.

En los roedores, el hipocampo es una estructura de forma curva que comienza cerca del tabique medial hacia la corteza temporal ventral. A lo largo de su eje longitudinal, el hipocampo se puede dividir en tres regiones diferentes, cada una relacionada con un circuito específico1. La parte superior constituye el hipocampo dorsal/septal, la parte inferior constituye el hipocampo ventral/temporal, y el área entre ellos se considera el hipocampo intermedio. Existe una extensa literatura que cubre las diferencias en las proyecciones celulares a cada parte, así como reportes de aspectos cognitivos específicos procesados por cada 5,6. En cuanto a su organización interna, las regiones del hipocampo pueden ser separadas por sus áreas funcionales. El área de Cornu ammonis (CA) se subdivide en CA1, CA2 y CA3 y se extiende a través de la parte superior del hipocampo, por encima del giro dentado (DG) y el subículo, que son las partes más internas del hipocampo (Figura 1). Las sinapsis localizadas en estas regiones sufren un continuo reordenamiento, mostrando procesos neurogénicos y plásticos a lo largo de la vida3. Varios estudios ya han demostrado que distintas manipulaciones experimentales en el hipocampo dan lugar a discapacidad cognitiva7. En cuanto a la valoración de las alteraciones bioquímicas y moleculares, las técnicas que utilizan cortes agudos de cerebro son una excelente herramienta para mejorar el conocimiento sobre diferentes aspectos del hipocampo.

Debido a su precisión y reproducibilidad, muchos estudios que exploraron aspectos de los fenómenos relacionados con la neurotransmisión (actividad, absorción o liberación de enzimas) utilizaron AHS transversal del hipocampo resecado obtenido por picador de tejido 8,9,10,11,12. Esta técnica de corte seguida de una evaluación de la absorción es adecuada para experimentos neuroquímicos sofisticados que requieren que se conserve la actividad transportadora del tejido del hipocampo. Para ello, es preferible el empleo de un picador de tejidos, ya que es más rápido que el vibratomo y proporciona el AHS en un momento adecuado para su uso experimental con la precisión adecuada.

La neurotransmisión excitatoria en el cerebro se lleva a cabo mediante el glutamato, el neurotransmisor más abundante, incluso en el hipocampo, que depende en mayor medida de la señalización del glutamato13,14. Esta abundancia de neurotransmisores está estrictamente controlada en el entorno extracelular. Sin embargo, dentro de las vesículas intracelulares puede alcanzar hasta 100 mM15. Una vez liberado en la hendidura sináptica, el glutamato no se metaboliza y necesita ser eliminado para evitar la excitotoxicidad, generalmente desencadenada como respuesta a una sobrecarga de glutamato14,16. El único mecanismo que separa la toxicidad de la señalización normal es el transporte dependiente del sodio a través de la actividad de proteínas localizadas en las membranas plasmáticas de, principalmente, células gliales 14,17,18,19. Estos transportadores [GLAST (EAAT1) y GLT-1(EAAT2)] regulan estrechamente los niveles de glutamato extracelular y pueden ser modulados por una amplia gama de factores, como la transcripción del ADN, el empalme y la degradación del ARNm, la síntesis y orientación de proteínas, la actividad de transporte de aminoácidos y las actividades de los canales iónicos 20,21,22,23. En consecuencia, su actividad se puede medir mediante el transporte de un sustrato radiomarcado, como el glutamato.

El uso de sustratos radiomarcados representa un método preferible para cuantificar la actividad del transportador, ya que permiten rastrear mecanismos dinámicos como el transporte a través de las membranas celulares. Además de su alta sensibilidad y especificidad, las ventajas de los experimentos con radiotrazadores incluyen su simplicidad y su pequeño costo en comparación con las tecnologías de la competencia, como la espectrometría de masas24. Además, al utilizar solo pequeñas cantidades de trazador, los niveles fisiológicos de los sustratos no se alteran, lo que proporciona una imagen más representativa del escenario real de la actividad metabólica.

La disponibilidad de enfoques experimentales ex vivo es fundamental para apoyar la investigación básica sobre la identificación de nuevas dianas moleculares y las actividades de descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, considerando la relevancia de la absorción de glutamato para la homeostasis del sistema glutamatérgico y el alto predominio de sinapsis glutamatérgicas en el hipocampo, este protocolo demuestra cómo evaluar la actividad de absorción de glutamato de un método rápido y fácil de reproducir utilizando AHS transversal del hipocampo resecado. Este ensayo utiliza L-[3H]-glutamato radiomarcado, que permite comparaciones cuantitativas y una visualización clara de los resultados, y puede modificarse para su uso con sustratos específicos o personalizados, en una amplia gama de condiciones de reacción25.

Los cortes agudos de cerebro presentan muchas ventajas y se han utilizado para apoyar el cambio de función bajo manipulaciones farmacológicas y genéticas 26,27,28. Su uso se beneficia de lo siguiente: (i) la conservación de la funcionalidad neuroquímica y las interacciones célula a célula; (ii) la posibilidad de realizar numerosas manipulaciones farmacológicas y genéticas para investigar las vías subyacentes a las funciones neuronales y gliales; iii) control preciso del entorno extracelular; y (iv) buen acceso experimental a diferentes áreas del hipocampo (como CA1, CA3 o DG), que se mantienen en el mismo corte dependiendo del método de corte. Teniendo en cuenta que los protocolos distintivos de preparación de cortes podrían cambiar las regiones del hipocampo expuestas, este protocolo propone una técnica estándar para obtener AHS transversal a partir del hipocampo resecado. Este protocolo fácil de realizar puede ser utilizado en modelos de roedores y puede permitir varios enfoques ex vivo que investigan la dinámica neuroquímica en diferentes contextos o después de manipulaciones in vivo29,30 (Figura 2).

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Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética local (aprobación del proyecto # 33732/CEUA-UFRGS). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar las molestias y el número de animales utilizados en los experimentos.

1. Preparación de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS)

  1. En un vaso de precipitados de 1 L, agregue aproximadamente 0,5 L de agua estéril o bidestilada y comience a agitar vigorosamente en un agitador magnético. Agregue los siguientes componentes de HBSS (en mM): 137 NaCl, 0.63 Na2HPO4, 4.17 NaHCO3, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 0.41 MgSO4, 0.49 MgCl2, 5.55 D-Glucosa (ver Tabla 1).
  2. Ajuste el pH a 7,4 con NaOH o HCl antes de añadir 1,26 mM deCaCl2 para evitar precipitaciones. Agregue esta sal muy lentamente y bajo agitación. Elevar un volumen de 1 L con agua estéril o bidestilada. Este tampón se utilizará para lavar el tejido y mantener la peste equina en un estado viable durante el experimento. Proporcionará iones inorgánicos mientras mantiene un pH fisiológico y una presión osmótica.
    NOTA: La adición de cationes divalentes se realiza después de la valoración del pH para evitar la precipitación.
  3. Separe dos fracciones diferentes de HBSS: una se mantendrá en un baño de agua a 37 °C y se utilizará durante el paradigma de absorción, mientras que la otra se mantendrá helada (4 °C) y se utilizará para lavados antes y después del experimento.
    NOTA: Es posible preparar soluciones madre de cada sal y mantenerlas congeladas hasta su uso, almacenarlas en el congelador (-20 °C) y utilizarlas en unas pocas semanas.

2. Preparación de HBSS sin sodio

  1. Antes de mezclar los componentes para el HBSS sin sodio, prepare de antemano otras dos soluciones: Glucamina-HCl (137 mM) y Glucamina-HEPES (4,17 mM). Mezcle las concentraciones equimolares de base NMDG y HCl para obtener la solución de glucamina-HCl. Realice el mismo procedimiento con ácido libre de 2.0 M HEPES para obtener la solución NMDG-HEPES (ver Tabla 2).
  2. En un vaso de precipitados de 0,5 L, agregue aproximadamente 0,2 L de agua estéril o bidestilada y comience a agitar vigorosamente en un agitador magnético. Agregue los siguientes componentes tampón (en mM): 137 Glucamina-HCl, 4.17 Glucamina-HEPES, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 1.26 MgSO4, 0.41 MgCl2 y 5.55 D-Glucosa (ver Tabla 2).
  3. Ajusta el pH a 7,4 con KOH o HCl y sigue removiendo. Añadir 1,26 mM de CaCl2 muy lentamente y bajo agitación. Lleve la solución a un volumen de 0,3 L con agua estéril o bidestilada.
    NOTA: Este tampón se utilizará para medir la absorción de glutamato no dependiente de sodio, lo que permitirá medir la absorción de glutamato pasivo/no específico. Después del experimento, este parámetro se resta de la absorción total de glutamato para determinar la absorción dependiente del sodio.
  4. Después de la preparación, este tampón puede almacenarse en el congelador (-20 °C) y utilizarse posteriormente en experimentos posteriores. Lo mismo ocurre con las soluciones NMDG.
  5. Durante el experimento, mantenga siempre frío el HBSS sin sodio.

3. Organizar el material para la disección del hipocampo de ratas

  1. Organice el área de disección junto al lavabo antes de comenzar el experimento. Coloque una guillotina específica para ratas (para ratones, será posible usar tijeras afiladas) en el fregadero para mantener limpio el banco.
  2. Coloque los instrumentos quirúrgicos y otros materiales para la extracción del cerebro y la disección del hipocampo en el orden de uso y lo más cerca posible de donde se necesitan (consulte la Tabla de materiales). Coloque la placa de Petri en una cubeta de hielo. Además, tenga a mano una bolsa de plástico para desechar el cadáver.
  3. Prepare ambas soluciones de HBSS a la concentración recomendada para su uso. El HBSS sin sodio se puede congelar y descongelar antes del experimento.
    1. Separe el HBSS que contiene sodio en dos porciones distintas, como se recomendó anteriormente: una calentada a 37 °C y otra a 4 °C que se utilizará para la disección. Descongele el HBSS sin sodio y manténgalo a 4 °C.
  4. Para inducir la anestesia, utilice isoflurano31 al 3%. Antes de comenzar el experimento, asegúrese de verificar la ausencia de reflejo corneal y estimulación nociceptiva de la pata trasera.
    NOTA: Tenga cuidado de elegir el medicamento anestésico adecuado, ya que no debe interferir con ningún parámetro que esté bajo investigación. Para este protocolo, se recomienda el uso de anestésico inhalante (por ejemplo, isoflurano)32.

4. Eutanasia de la rata

  1. Eutanasiar al roedor utilizando los métodos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), así como por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicaciones de los NIH No. 8023, revisada en 1978).
  2. Con una guillotina, decapita a la rata inmediatamente antes de la primera vértebra cervical.
  3. Coloque la cabeza sobre una toalla de papel limpia humedecida con solución salina fría. Extraer completamente el cuero cabelludo con la tijera quirúrgica talla S, así como el músculo cutáneo con el objetivo de exponer completamente las suturas en la superficie superior del cráneo. Inicie este procedimiento con cuidado, comenzando cerca del hueso occipital y continuando posteriormente hasta el hueso nasal.
    NOTA: En caso de que el modelo experimental sea de ratones, utilice unas tijeras afiladas para quitar la cabeza. Asegúrese de cortar justo detrás del cráneo para excluir el exceso de tejido.

5. Extracción del cerebro de rata

  1. Realice la extracción del cerebro lo más rápido posible. Con un alicate de hueso adecuado, haz un solo corte entre ambos orificios uniendo ambos orificios en el cráneo de la rata. Después, coloque una punta de la tijera quirúrgica tamaño S en el foramen magnum y haga un solo corte lateral en el cráneo. Repita para el otro lado.
  2. Corte las placas del cráneo desde la placa occipital, luego a lo largo de la sutura de la línea media de las placas parietales y, finalmente, hasta la placa frontal hacia la nariz. Asegúrese de que la cabeza del roedor esté firmemente sujeta y que la presión se dirija lejos del cerebro para evitar dañar el tejido que se encuentra debajo.
    NOTA: Es de vital importancia que la presión se dirija lejos del cerebro para evitar dañar el tejido que se encuentra debajo. En ratas y ratones jóvenes, es posible cortar el cráneo con pequeñas tijeras quirúrgicas.
  3. Retire suavemente las placas occipital y parietal de ambos hemisferios con una espátula o pinzas. Inspeccione cuidadosamente cualquier duramadre que pueda estar adherida a los huesos del cráneo y estirada a través de la superficie del cerebro.
  4. Extraiga el cerebro inmediatamente con la espátula delgada de doble punta y coloque suavemente todo el cerebro en una placa de Petri helada cubierta con papel de filtro. Con la pipeta de plástico Pasteur, humedézcalo con una solución salina helada. Inmediatamente comience a diseccionar los hipocampos de ambos hemisferios cerebrales como se explica a continuación.
  5. Reseca cuidadosamente el cerebelo de todo el cerebro con la hoja de bisturí #11. Con el fin de separar completamente los hemisferios cerebrales, se pasa una hoja de bisturí a través de la fisura intrahemisférica. Con la pipeta de plástico Pasteur, humedézcala con tampón HBSS helado con frecuencia para mantener el tejido húmedo y conservado.
  6. Tome cada hemisferio por separado, reseque el tronco encefálico y el mesencéfalo de la corteza suprayacente con unas tijeras de iris. Con cuidado, con la tijera quirúrgica corte el tronco encefálico/mesencéfalo/tálamo, mientras con un cepillo fino empuja hacia abajo y tira de estas estructuras cerebrales. A continuación, será posible observar el hipocampo (superficie medial) y el ventrículo lateral. La corteza con el hipocampo ahora debería estar libre del tronco encefálico.

6. Disección de hipocampos de ratas

  1. Para resecar el hipocampo, coloque un hemisferio cerebral en el plano coronal con la corteza parietal hacia abajo. En este momento, es posible observar las fibras blancas de fimbria que forman una hipérbola poco profunda en la parte inferior del hipocampo.
  2. Con mucho cuidado, con la mano no dominante, ancle el tejido cerebral con pinzas finas. Con la mano dominante, coloca otras pinzas debajo de la punta caudal del hipocampo.
  3. Anclando los tractos mediales de materia blanca, coloque las pinzas completamente debajo del hipocampo para separarlo suavemente del resto del cerebro. Aplique presión mientras mueve la segunda punta ligeramente anterior y lateralmente. Si se hace correctamente, el hipocampo debe aterrizar en el papel de filtro.
  4. Para terminar la disección del hipocampo, retire el tejido sobrante con las mismas pinzas (por lo general, los restos de la corteza, los vasos sanguíneos y la sustancia blanca). Repita la misma metodología para el segundo hemisferio.
  5. Una vez que se hayan extraído ambos hipocampos, transfiéralos a una placa de Petri con HBSS colocados en la cubitera y transfiéralos al área de la mesa de corte sobre la cuchilla en el picador de tejidos. Asegúrese de identificar correctamente las áreas dorsal y ventral si la investigación requiere analizarlas por separado.
    NOTA: Es importante distinguir siempre las partes ventral y dorsal del hipocampo durante la disección. Al hacerlo, el extremo anterior estará mirando hacia arriba33. Esta parte del hipocampo es ligeramente más delgada que el extremo posterior.

7. Preparación de las lonchas

NOTA: Mientras coloca el material quirúrgico en el banco (sesión 2), prepare el picador de tejido para obtener el corte transversal del hipocampo resecado.

  1. Ajuste los parámetros en el picador de pañuelos antes de su uso. El picador puede cortar rodajas de 100 a 400 μm; Ajústelo a 300 μm. Además, se recomienda un rango de 60-80 golpes por minuto, ya que mantiene la integridad del tejido durante el procedimiento de corte.
  2. Después de todos los procedimientos realizados en la sesión 2, una vez que los hipocampos fueron resecados del cerebro y colocados sobre el papel de filtro humidificado con solución salina fría sobre un soporte liso de polipropileno, alinee cada hipocampo en el papel de filtro antes de someterlos al procedimiento de picado.
  3. Coloque el hipocampo a la vez en la mesa de corte circular de acero inoxidable desde la picadora de tejidos, perpendicular a las cuchillas de corte para obtener las rodajas transversales del hipocampo a lo largo del eje septo-temporal. Antes de comenzar el proceso de picado, humedezca ligeramente la cuchilla con alcohol isopropílico. Este procedimiento evita que el tejido se pegue a la hoja, lo que permite un corte más suave y preciso.
  4. Después de encender el equipo, la cuchilla del brazo de corte se levantará y se dejará caer, cortando el tejido en el grosor seleccionado. Este es un proceso rápido y, normalmente, el tejido se cortará correctamente después de un minuto. Es posible picar más de un hipocampo al mismo tiempo si se mantienen adecuadamente separados en la mesa de corte.
  5. Para separar las rebanadas, tome cada muestra cortada del picador de pañuelos con cuidado con la espátula de doble punta y sumérjala en una placa de Petri con solución salina helada. Con dos cepillos finos, pellizque suavemente el hipocampo y separe las rodajas. Tenga cuidado de mantener la integridad de la rebanada durante este proceso.
    1. Realice este experimento por triplicado, por lo tanto, seleccione 6 cortes de cada muestra: 3 cortes para la absorción total de glutamato y 3 para la absorción inespecífica.
  6. Con el cepillo, transfiera suavemente cada rebanada de la placa de Petri a una placa de 24 pocillos que contenga: (i) 1 ml de HBSS; y (ii) 1 mL de HBSS libre de sodio. Identificar el pocillo/placa con los grupos experimentales correspondientes y realizar el análisis al menos por triplicado.
    NOTA: Debido a un problema de tiempo limitado, si el experimento se realiza por triplicado, limita el número de animales/grupos a solo 6 a la vez (un hipocampo por animal en 5 minutos de absorción). Esto significa que el L-[3H]-glutamato se administrará cada 15 s hasta que se incuben todas las rodajas. Para detener la reacción, se debe observar el mismo intervalo para garantizar que todas las muestras se expongan a un período de incubación de 5 minutos.

8. Ensayo de captación de glutamato

  1. Durante la estabilización de los cortes en el tampón respectivo (HBSS o HBSS sin sodio), prepare la solución que contiene radiactivo diluyendo L-[3H]-glutamato en agua estéril hasta una concentración final de 4,5 μCi/mL en un volumen final que permita 20 μL por corte más algún exceso, lo que evitará la falta de aporte radiactivo al final del lote, ya que será necesario cuantificar cuántas desintegraciones por minuto (DPM) se ofrecieron a cada corte al principio.
    NOTA: Para cada placa de 24 pocillos, se recomienda preparar 500 μL de 4,5 μCi/mL de L-[3H]-glutamato debido al tiempo total de incubación necesario para la absorción de L-[3H]-glutamato (5 min) y el tiempo para pipetear cada alícuota de 20 μL (0,33 μCi en cada pocillo), como se explica a continuación. La concentración de caldo de L-[3H]-glutamato suele ser de 1,0 mCi/mL, por lo que se prepara una dilución 1:200 para aplicar sobre las lonchas.
  2. Después de 15 minutos de preincubación en HBSS, retire completamente el tampón con una pipeta Pasteur y reemplácelo agregando a las rodajas 280 μL de uno de los siguientes: (i) HBSS regular (37 °C) para una absorción total; o (ii) HBSS sin sodio (4 °C) para la absorción inespecífica. Es importante tener en cuenta que la absorción total debe realizarse en una placa calefactora a 37 °C, mientras que la absorción inespecífica se realiza en hielo.
  3. Prepare un temporizador y establezca el comienzo del experimento al agregar una entrada de 20 μL en el primer pocillo que contiene una rebanada. Espere de 15 a 20 s (dependiendo del número de rodajas en la placa) y agregue la entrada radiactiva al siguiente pocillo y así sucesivamente hasta el final de los pocillos que contienen rebanadas. Distribuir 20 μL de entrada en todos los pocillos considerando siempre el tiempo total de incubación (5 min).
  4. Una vez que se llene cada uno de los pocillos que contienen rodajas en el plato, espere a que la primera rebanada complete 5 minutos de incubación con L-[3H]-glutamato. A continuación, retire inmediatamente el medio de incubación y colóquelo en un matraz adecuado para los residuos radiactivos.
  5. Inmediatamente después de la extracción, agregue rápidamente 300 μL de HBSS helado y retírelo suavemente. Repita este procedimiento dos veces más en cada pocillo, completando tres lavados para cada rebanada. Asegúrese de utilizar el HBSS sin sodio para lavar las lonchas dedicadas a la medición de la absorción inespecífica. Después de lavar todas las lonchas de la placa, añada 300 μL de NaOH 0,5 M a cada pocillo y guarde la placa protegida con parafilm a 4 °C durante la noche.

9. Recuento del L-[3H]-glutamato radiactivo

  1. Al día siguiente, etiquete tantos tubos como rodajas en el experimento y recoja el contenido del pocillo en cada tubo. Asegúrese de que las rodajas estén completamente solubilizadas en la solución de lisis. Si es necesario, homogeneizar la muestra con una aguja de calibre 26 acoplada a una jeringa de 1 mL.
  2. Añadir 1,2 mL de líquido de centelleo a un volumen final de aproximadamente 1,5 mL y homogeneizar todas las muestras en un vórtice antes de leerlas en un contador de centelleo durante 60 s cada una.
    NOTA: Asegúrese de que los parámetros de detección estén configurados en tritio y que el resultado se entregue en DPM.

10. Cálculos

  1. Convierte los resultados dados por el contador de centelleo en la radiactividad emitida por el reactivo atrapado dentro del corte y representa la cantidad de glutamato absorbido. Deduzca el valor obtenido para la absorción inespecífica del resultado obtenido con el HBSS regular. Un μCi equivale a 2,22×106 DPM.
  2. Conociendo la cantidad de μCi y la concentración original de [3H]L-glutamato (información que generalmente se proporciona en el matraz o la hoja de datos del reactivo), calcule el L-[3H]-glutamato capturado por cada corte.

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Resultados

La captación de glutamato es uno de los mecanismos más importantes que controlan la neurotransmisión en el cerebro. El hipocampo, específicamente, es un lugar crítico en la señalización del glutamato, siendo un centro importante que conecta la memoria, la cognición y las emociones en el cerebro. Siguiendo el protocolo, se utilizaron ratas Wistar macho adultas para generar resultados representativos. Los animales fueron anestesiados con isoflurano al 3% hasta que quedaron inconscientes. Después de diseccionar el cerebro, ...

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Discusión

El protocolo presentado muestra una evaluación de la absorción de glutamato fácil de realizar utilizando cortes del hipocampo. Los resultados demuestran que la AHS absorbe regularmente alrededor de 60 fmol de L-[3H]-glutamato radiomarcado, que el grosor del corte (cantidad de proteína) no influyó en la absorción de L-[3H]-glutamato (datos no mostrados), y que las partes dorsal, intermedia y ventral del hipocampo exhibieron rendimientos similares cuando se obtuvieron...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reciben apoyo financiero del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología en Excitotoxicidad y Neuroprotección [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] y [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#11 hoja de bisturíSwann-Morton525
vidrio de 100 mmProveedores
110 mm de diámetro Filtro WhatmanSigma AldrichWHA1001110
42,5 mm de diámetro Filtro WhatmanSigma AldrichWHA1001042
placa de cultivo celular de 24 pocillosFalcon353047
BeckerProveedores
Cuchillas para la picadora de tejidosWilkinson3241
Rongeur de huesoErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Ácido aspárticoPerkinElmerNET581001MC 11,3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-glucosaSigma AldrichG8270
N-metil-D-glucaminaSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Tijeras de irisErwin Guth8,00,040
IsofluranoCristalia (Sã o Paulo, Brasil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Ácido glutámicoPerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Pipeta Pasteur de plásticoProveedores
comunesLíquido de centelleoPerkinElmer1200.437 para 1 x 5 litrosOptiphase HiSafe 3
Tijeras quirúrgicas pequeñasErwin Guth8,00,040
Pinzas pequeñasErwin Guth6,00,131
Discos de corte de repuesto para la picadoraProveedores
Tijeras estándarErwin Guth8,00,010
Cepillos finos ( tamaño 0 o 2)Proveedores
Espátula delgada de doble puntaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180
placa de Petri decomunescomunescomunescomunes

Referencias

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