Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.

Resumen

El trasplante de células de la retina es un enfoque terapéutico prometedor, que podría restaurar la arquitectura de la retina y estabilizar o incluso mejorar las capacidades visuales de la retina degenerada. Sin embargo, el progreso en la terapia de reemplazo celular actualmente enfrenta los desafíos de requerir una fuente estándar de retinas humanas estandarizadas y de alta calidad. Por lo tanto, se necesita un protocolo fácil y estable para los experimentos. Aquí, desarrollamos un protocolo optimizado, basado en un método de autoorganización con el uso de moléculas exógenas y reactivo A, así como la escisión manual para generar los organoides tridimensionales de la retina humana (RO). La RO derivada de células madre pluripotentes humanas (PSC) expresa marcadores específicos para los fotorreceptores. Con la adición de COCO, un antagonista multifuncional, la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de fotorreceptores aumenta significativamente. El uso eficiente de este sistema, que tiene los beneficios de las líneas celulares y las células primarias, y sin los problemas de abastecimiento asociados con estas últimas, podría producir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Por lo tanto, la diferenciación de PSC a RO proporciona una plataforma óptima y biorelevante para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y el trasplante celular.

Introducción

Las células madre pluripotentes (PSC) se caracterizan por su auto-renovación y capacidad para diferenciarse en todo tipo de células somáticas. Por lo tanto, los organoides derivados de PSC se han convertido en un recurso importante en la investigación de la medicina regenerativa. La degeneración retiniana se caracteriza por la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) y epitelio pigmentario de la retina. El reemplazo de células retinianas podría ser un tratamiento alentador para esta enfermedad. Sin embargo, no es factible obtener retinas humanas para la investigación y terapia de enfermedades. Por lo tanto, los organoides retinianos (RO) derivados de PSCs, que re....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESCs H9 se obtuvieron del Instituto de Investigación WiCell y se modificaron genéticamente para la línea celular marcada con tdTomato.

1. Generación de ROs humanas

1. Cultive los hESCs en condiciones libres de alimentador.
   1. Cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de 0,1 mg/ml de reactivo A (tabla de materiales) a 37 °C durante al menos media hora siguiendo las instrucciones del fabricante. Descongelar una alícuota de 1x10⁶ hESCs.
      NOTA: Prepare 3 ml de reacti....

Resultados

La ilustración esquemática muestra el protocolo de diferenciación para mejorar las células precursoras con COCO (Figura 1). Desde PSC hasta ROs, numerosos detalles podrían causar variaciones en los resultados. Se recomienda registrar cada paso e incluso el número de catálogo y el número de lote de cada medio para rastrear todo el procedimiento.

En este documento, proporcionamos imágenes de campo brillante para los días 6, 12, 18 y 45 (Figura 2.......

Discusión

La diferenciación de organoides retinianos es un método deseable para la generación de amplias células funcionales de la retina. La RO es un compuesto de diferentes células de la retina, como células ganglionares, células bipolares y fotorreceptores, generados por células madre pluripotentes hacia la retina neural 4,5,8,9. Aunque se pueden cosechar RO confluentes, lleva mucho tiempo, lo que pue.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R& D Systems	3047-CC-050	DAN Familia de dominios de antagonistas de
BMP DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo 15575020
Suero Fetal Bovino (FBS), Calificado para Células Madre Embrionarias	Humanas Industria Biológica	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Agregación celular en 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reactivo A	BD 356231		Matrigel en 1.1.1
Reactivo B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs medio basal en 1.1.2
Reactivo C	Gibco	12563-011	TrypLE Express en 1.2
Reactivo D	Roche	11284932001	DNasa I , en 1.2
Ácido retinoico	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Suplemento 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Suplemento (100X), Líquido, suplente en medum III
Taurina	Sigma	T-8691-25G
Tripsina-EDTA (0.25%), rojo fenol	Disociación de organoides Gibco	25200056	2.1.3
Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Inhibidor de Wnt
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049