Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las terapias celulares adoptivas que utilizan células T receptoras de antígeno quimérico (células CAR-T) han demostrado una eficacia clínica notable en pacientes con neoplasias hematológicas malignas y actualmente se están investigando para varios tumores sólidos. Las células CAR-T se generan mediante la eliminación de células T de la sangre de un paciente y su ingeniería para expresar un receptor inmune sintético que redirige las células T para reconocer y eliminar las células tumorales objetivo. La edición génica de las células CAR-T tiene el potencial de mejorar la seguridad de las terapias actuales de células CAR-T y aumentar aún más la eficacia de las células CAR-T. Aquí, describimos métodos para la activación, expansión y caracterización de células CAR-T dirigidas por CD19 dirigidas por CRISPR humanos. Esto comprende la transducción del vector lentiviral CAR y el uso de ARN guía único (sgRNA) y endonucleasa Cas9 para dirigirse a genes de interés en las células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar universalmente a otras construcciones CAR y genes diana más allá de los utilizados para este estudio. Además, este protocolo discute estrategias para el diseño de ARNg, la selección de ARNg principal y la validación de knockout de genes objetivo para lograr de manera reproducible una ingeniería CRISPR-Cas9 multiplex de alta eficiencia de células T humanas de grado clínico.
Introducción
La terapia con receptores de antígenos quiméricos (CAR)-células T ha revolucionado el campo de las terapias celulares adoptivas y la inmunoterapia contra el cáncer. Las células CAR-T son células T modificadas que expresan un receptor inmune sintético que combina un fragmento de anticuerpo de cadena única específico del antígeno con dominios de señalización derivados de la cadena TCRzeta y dominios coestimuladores necesarios y suficientes para la activación y coestimulación de las células T1,2,3,4 . La fabricación de células CAR-T comienza po....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Las células T humanas se adquirieron a través del Núcleo de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania, que opera bajo los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio con procedimientos operativos estándar establecidos y / o protocolos para la recepción, procesamiento, congelación y análisis de muestras que cumplen con las pautas éticas de MIATA y la Universidad de Pensilvania.
1. Producción de vectores lentivirales
NOTA: Los productos virales se han convertido en defectuosos para la replicación mediante la separación de construcciones de empaque (Rev, gag / pol / RRE, VSVg y plásmido de transferencia) e....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Describimos aquí un protocolo para la ingeniería genética de células T, que se puede utilizar para generar células CAR-T autólogas y alogénicas, así como células T redirigidas TCR.
La Figura 1 proporciona una descripción detallada de las etapas involucradas en el proceso de fabricación de células T editadas por CRISPR. El proceso comienza diseñando sgRNA para el gen de interés. Una vez que los sgRNA se diseñan y sintetizan, se utilizan para hacer complejos RNP con.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí describimos enfoques para editar genes de células CAR-T utilizando la tecnología CRISPR Cas9 y fabricar productos para probar aún más su función y eficacia. El protocolo anterior se ha optimizado para realizar la edición de genes CRIPSR en células T humanas primarias combinadas con células T de ingeniería con receptores de antígenos quiméricos. Este protocolo permite una alta eficiencia de knockout con una variabilidad mínima de donante a donante. La modificación utilizando CRISPR puede mejorar tanto la eficacia com.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones.
Agradecimientos
Reconocemos al Núcleo de Inmunología Humana por proporcionar células T de donantes normales y al Núcleo de Citometría de Flujo en la Universidad de Pensilvania.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Unidad central de nucleofactor 4D: | Lonza | AAF-1002B | |
| : Unidad X de nucleofactor 4D: | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima Ultracentrífuga XPN | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-humano Anticuerpo CD3 | Biolegend | 317322 | clon OKT3 |
| BV711 Anti-humano PD1 | Biolegend | Clon EH12.2H7 | |
| Cas9-Potenciadores de electroporación | IDT 1075915 | ||
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| Kit de aislamiento de células T CD4+ Tecnologías | StemCell | 15062 | |
| Kit de aislamiento de células T CD8+ Tecnologías | StemCell | 15063 | |
| Corning 0,45 micras filtro de vacío/botella | Corning | 430768 | |
| Corning T150 matraz de cultivo celular | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Kit de sangre y tejidos | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Imán | ThermoFisher | 12321D | |
| Suplemento | GlutamaxThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T | celdas ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel y limpieza de PCR | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Célula primaria 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina | ThermoFisher | 10378016 | |
| expresión de pTRPE Plásmido | en casa | ||
| Anticuerpo monoclonal anticuerpo monoclonal anti-ratón FMC63 scFv de conejo, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Tubos de ultracentrífuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| Mezcla de embalaje viral | en casa | ||
| X-Vivo-15 | Media Lonza | BE02-060F |
Referencias
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
