La relación señal-ruido de los datos es una de las consideraciones más importantes para realizar mediciones de difracción de rayos X a partir de microcristales. La línea de haz VMXm proporciona un entorno de bajo ruido y microhaces para tales experimentos. Aquí, describimos los métodos de preparación de muestras para montar y enfriar microcristales para VMXm y otras líneas de haz de cristalografía macromolecular de microenfoque.
Artículo de método
Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline
En este artículo
Resumen
Resumen
El montaje de microcristales (<10 μm) para la criocristalografía monocristatal presenta un desafío no trivial. Se han observado mejoras en la calidad de los datos para los microcristales con el desarrollo de la óptica de la línea de haz, la estabilidad del haz y el tamaño de haz variable que se enfoca de submicron a micras, como en la línea de haz VMXm en Diamond Light Source1. Se obtendrán nuevas mejoras en la calidad de los datos mediante mejoras en el entorno de la muestra y la preparación de la muestra. Los microcristales generan inherentemente una difracción más débil, por lo tanto, mejorar la señal a ruido es clave para recopilar datos de difracción de rayos X de calidad y provendrá predominantemente de reducciones en el ruido de fondo. Las principales fuentes de ruido de fondo de rayos X en un experimento de difracción son su interacción con la trayectoria del aire antes y después de la muestra, el exceso de solución de cristalización que rodea la muestra, la presencia de hielo cristalino y la dispersión de cualquier otra instrumentación de línea de haz o ventanas de rayos X. La línea de haz VMXm comprende instrumentación y un protocolo de preparación de muestras para reducir todas estas fuentes de ruido.
En primer lugar, un entorno de muestra en vacío en VMXm elimina la ruta de aire entre la fuente de rayos X y la muestra. A continuación, los protocolos de preparación de muestras para cristalografía macromolecular en VMXm utilizan una serie de procesos y herramientas adaptadas de cryoTEM. Estos incluyen rejillas de cobre con películas de soporte de carbono perforado, blotting automatizado y robótica de enfriamiento por inmersión que utiliza etano líquido. Estas herramientas permiten la preparación de cientos de microcristales en una sola rejilla crioTEM con un mínimo de líquido circundante en un soporte de bajo ruido. También minimizan la formación de hielo cristalino a partir de cualquier líquido restante que rodea los cristales.
Presentamos el proceso para preparar y evaluar la calidad de los microcristales de proteínas solubles utilizando luz visible y microscopía electrónica de barrido antes de montar las muestras en la línea de haz VMXm para experimentos de difracción de rayos X. También proporcionaremos ejemplos de muestras de buena calidad, así como aquellas que requieren una mayor optimización y estrategias para hacerlo.
Introducción
Una barrera importante para la determinación de estructuras de alta resolución de moléculas biológicas por cristalografía macromolecular (MX) sigue siendo la producción de cristales bien difracantes a un tamaño agradable. Existen muchas estrategias para lograr este objetivo, desde el diseño de la construcción de genes de proteínas recombinantes hasta grandes búsquedas de matrices dispersas de cócteles químicos que pueden generar cristales iniciales2. Para estos últimos, a menudo se da el caso de que el cristalógrafo necesitará optimizar cualquier golpe inicial para obtener cristales con suficiente calidad y tamaño de difracción para estudios de determinación deestructuras 3. A pesar de estas opciones, es posible que algunas moléculas objetivo nunca generen cristales grandes (>10 μm), bien difractantes y, como resultado, el cristalógrafo debe perseverar con sus microcristales y los desafíos que presentan tales muestras. Estos incluyen el montaje adecuado y la crio-protección de los cristales, el manejo de la difracción inherentemente más débil y el aumento de la sensibilidad a la radiación. Los microcristales se forman a partir de menos células unitarias y moléculas que los cristales más grandes y, como tal, la difracción no se amplifica en la misma medida en comparación con los cristales más grandes, lo que resulta en intensidades de difracción inherentemente más débiles. Es importante que la señal de fondo no enmascare estos reflejos, particularmente a mayor resolución donde se pueden perder intensidades de reflexión débiles4. Además, los microcristales son más sensibles al daño por radiación y, a pesar de registrar la difracción a temperaturas de nitrógeno líquido5,es posible que no sea posible recopilar datos completos de un solo cristal, por lo que es necesario recopilar datos de un gran número de cristales para producir un solo conjunto de datos completo6.
La creciente disponibilidad de láseres de electrones libres de rayos X (XFELs) y la evolución de los métodos de cristalografía en serie (SFX)7 han proporcionado rutas para recopilar datos de microcristales más pequeños. Sin embargo, estos son métodos de entrega de muestras a medida, que requieren una cantidad significativa de experiencia en hardware y software, donde los experimentos se limitan a la temperatura ambiente y, por lo general, el consumo de muestras es alto (cientos de microlitros) y aún puede requerir una mayor optimización8. Como tal, los proyectos en los que solo se puede hacer una cantidad limitada de microcristales no son apropiados para SFX.
Mientras tanto, la tecnología de línea de haz de sincrotrón en las últimas décadas ha progresado para producir haces9 más pequeños y estables con un brillo que ha permitido la recopilación de datos de cristales cada vez más pequeños10,11. Las líneas de haz de microenfoque como FMX en NSLS-II e I24 en Diamond Light Source han podido determinar nuevas estructuras a partir de cristales con dimensiones máximas de ~ 3 μm12 y demostrar la capacidad de recopilar datos utilizables de cristales aún más pequeños que miden ~ 1 μm13. La línea de haz debe configurarse con precisión, con una óptica de visualización en el eje excelente y de alta resolución, una esfera mínima de confusión para la rotación de la muestra y un eje de rotación alineado con precisión que coincida con el haz de rayos X. Es importante hacer coincidir estrechamente el perfil del haz de rayos X con el volumen del cristal y asegurarse de que el cristal esté alineado con precisión en el haz de rayos X, un desafío para los cristales <5 μm14. Cumplir con estas condiciones experimentales en la línea de haz es esencial para registrar los datos de mejor calidad de los microcristales.
El aspecto restante y posiblemente el más importante de la recopilación de datos de microcristales es la presentación del cristal al haz de rayos X. Los microcristales a menudo se han montado en soportes de muestra de micromesh, fabricados a partir de poliimida, un material de baja dispersión de rayos X con aberturas tan pequeñas como 10 μm15,16. La malla de poliimida está montada en un pasador estándar que se establece en una base magnética SPINE, lo que la hace compatible con la mayoría de las líneas de haz MX17. El soporte de malla se utiliza para pescar cristales de la gota de cristalización a menudo siguiendo el mismo procedimiento que el montaje de un cristal de 100 μm utilizando un montaje de estilo de bucle estándar. Si bien los cristales pueden distribuirse a través de la malla, una desventaja clave es que la malla y el pasador pueden transportar un volumen relativamente grande de líquido durante la cosecha(Figura 1C,D). Este volumen de líquido, que puede ser muchas veces mayor que los propios cristales, contribuirá al ruido de fondo cuando se ilumine con rayos X. Esta dispersión de fondo puede ser aún más fuerte si el líquido forma hielo cristalino durante el enfriamiento por flash, disminuyendo la relación señal-ruido de intensidades ya débiles dentro de las resoluciones de difracción de hielo. Por lo tanto, es clave que el exceso de líquido se elimine de la muestra, para garantizar que se puedan registrar todas las señales posibles. Este desafío es aún mayor en el caso de los cristales de proteína de membrana formados dentro de la fase cúbica lipídica (LCP), donde el LCP genera una fuerte dispersión de fondo y también es difícil de eliminar de alrededor de los cristales 18.
La nueva línea de haz de microenfoque de cristalografía macromolecular versátil (VMXm) en Diamond Light Source proporciona las condiciones para recopilar datos de cristales que potencialmente miden menos de una micra de tamaño. La línea de haz ha sido diseñada para entregar un perfil de haz que mide 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1,un goniómetro con una esfera de confusión no superior a 60 nm y un entorno de muestra en vacío. Estas características de diseño de la estación final VMXm minimizan la generación de ruido de rayos X de fondo por parte del aparato de línea de haz durante la recopilación de datos con la mayor fuente restante de fondo generada por la muestra14.
Los métodos específicos de preparación de muestras diseñados para la línea de haz VMXm brindan la oportunidad de reducir este fondo y mejorar aún más la señal a ruido de los datos de difracción, maximizando la calidad de los datos que se pueden registrar a partir de microcristales que miden <10 μm. Muchos de los requisitos descritos aquí para la difracción de bajo fondo de microcristales también son comunes a la microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM)19 y la difracción de electrones microcristales (microED)20. Como resultado, muchas de las herramientas que ya se han desarrollado para la preparación de muestras cryoTEM son adecuadas, con algunas adaptaciones, para la preparación de microcristales. En la preparación de muestras para cryoTEM de una sola partícula, las partículas bajo investigación están incrustadas en capas muy delgadas (típicamente <100 nm) de hielo vítreo de tal manera que los electrones pueden transmitir a través de la muestra. La capa uniforme delgada se logra eliminando el exceso de líquido y la vitrificación de la muestra se logra mediante el enfriamiento rápido de la muestra (~ 104 K s-1)21 a través de la inmersión en etano líquido mantenido a ~ 93 K22. Por el contrario, el nitrógeno líquido, tal como se usa rutinariamente para la preparación de muestras de MX, es un criógeno menos eficiente que el etano y tiene una mayor propensión a la formación de hielo cristalino dentro de la muestra21. La formación de hielo cristalino, que puede degradar la difracción y generar ruido de fondo, normalmente se mitiga mediante el uso de compuestos crioprotedores23. Los polímeros de bajo peso molecular como el polietilenglicol (PEG) 400 y el metil-2,4-pentanediol (MPD), azúcares, aceites o sales saturadas se pueden agregar a una alícuota de solución de cristalización en bajas concentraciones24- no existe una solución de "talla única" para seleccionar el crioprotector más apropiado y esto a menudo requiere optimización25 . El cristal también se somete a múltiples manipulaciones durante el proceso de cosecha y crio-protección que puede resultar en daños al cristal, la oportunidad de utilizar etano líquido permite la omisión de este paso y ayuda a proteger la integridad del cristal.
Si bien el etano líquido es un criógeno eficaz para microcristales (<10 μm) debido a la delgadez de la muestra, existen métodos alternativos para prevenir la formación de hielo cristalino, particularmente en cristales más grandes, incluida la reducción del contenido de agua del cristal mediante el uso de un ambiente húmedo estrechamente controlado26, o a través de la absorción del exceso de líquido lejos tanto del bucle como de la superficie del cristal27 , sin embargo, estos nuevamente requieren una mayor manipulación de la muestra. El uso de la eliminación automática de blotting y la congelación por inmersión con etano líquido, como en cryoTEM, juntos eliminan el exceso de solución de cristalización y proporcionan un medio para flashear microcristales fríos de manera controlada mientras se intenta minimizar la manipulación.
Aquí, presentamos un protocolo que puede ser utilizado no solo por los usuarios de la línea de haz VMXm y en otras líneas de haz de microenfoque para recopilar datos de difracción de alta señal a ruido, sino que también puede ser útil para aquellos que preparan muestras de cristal de proteína soluble y proteína de membrana a base de detergente para experimentos microED. Si bien todas las instalaciones para preparar y evaluar muestras están disponibles en VMXm, muchos laboratorios de biología estructural están cada vez más equipados para la preparación de muestras crioTEM. Como resultado, prevemos que algunos usuarios pueden desear utilizar sus propias instalaciones para preparar sus muestras para el tiempo de haz en VMXm.
Protocolo
1. Configuración del equipo
NOTA: Los métodos descritos aquí utilizan un instrumento de congelación por inmersión con un solo brazo secante. Algunos instrumentos están equipados con dos brazos secantes y aconsejamos al usuario que verifique las instrucciones del fabricante para ajustar el instrumento para que solo se use un brazo secante.
- Asegúrese de que un microscopio de luz esté colocado cerca del instrumento de congelación por inmersión, idealmente para que tanto el microscopio como el congelador estén al alcance del usuario.
- Configure y enfríe el congelador automático de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: La temperatura de la cámara de muestra debe establecerse a la temperatura a la que se cultivaron los cristales. No coloque papel secante en la cámara de muestras.
PRECAUCIÓN: El etano líquido es un explosivo altamente inflamable y solo debe usarse en un área bien ventilada, lejos de posibles fuentes de chispas. - Etiquete las cajas de rejilla adecuadamente y enfríe en un pequeño dewar usando nitrógeno líquido.
- Coloque cuidadosamente las rejillas, con la película de carbono hacia arriba, en un soporte apropiado para la descarga de brillo (como un portaobjetos de microscopio de vidrio envuelto en parafilm).
- Rejillas cryoTEM de descarga de resplandor para 25 s a 0,39 mBar, utilizando una corriente de 15 mA. Descarga de resplandor justo antes de que se utilicen las rejillas. Mantenga las rejillas descargadas por resplandor en una placa de Petri cubierta hasta que estén listas; si transcuesta 30 minutos después de la descarga del resplandor, repita la descarga del resplandor.
NOTA: Con el congelador listo y las rejillas preparadas, la atención puede dirigirse a la muestra.
2. Determinación de los parámetros iniciales de borrado
- Establezca la humedad relativa de la cámara de muestra en 90% y el tiempo de borrado en 5 s y asegúrese de que el congelador de inmersión esté configurado para sumergir automáticamente la muestra después de que se complete el borrado.
NOTA: Estos parámetros de arranque son los más adecuados para el congelador leica GP, otros parámetros como la fuerza de borrado están disponibles en el FEI Vitrobot. Sin embargo, en nuestra experiencia, es más probable que la integridad del cristal se mantenga mediante el uso de un solo brazo secante. - Para poder sellar la bandeja de cristalización una vez abierto el pozo de interés, corte una pequeña tira de cinta adhesiva y doble sobre un extremo para crear una pestaña para facilitar la apertura del sello y colocarla cuidadosamente a un lado.
- Abra el sello sobre el pozo de cristalización, incluido el depósito. Trabajando rápidamente, aplique 2-5 μL de solución de reservorio al cristal que contiene la gota para mantener el volumen de líquido en la gota.
- Use la pestaña de cinta para luego volver a secar el pozo y asegurarse de que la gota de cristalización no se seque.
- Mientras mantiene momentáneamente abierta la cinta sobre el pozo de cristalización, transfiera 10 μL de la solución del depósito a un tubo de 0,5 ml para usar en pasos posteriores.
- Vuelve a señar el pozo.
- Coloque un trozo de papel secante precortado en el brazo secante del instrumento de congelación por inmersión.
- Coloque una sola rejilla descargada por resplandor en las pórceps de congelación por inmersión y cargue en el instrumento de tal manera que el lado de carbono se aleje del brazo secante.
- Asegúrese de que la humedad relativa dentro de la cámara de borrado sea del 90%.
- Gire los fórceps para que el lado de la película de carbono se enfrente al brazo secante.
- Usando una pipeta de 2.5 μL, aplique 2 μL de solución de reservorio desde el tubo de 0.5 mL al lado no soportante (cobre brillante) de la rejilla cryoTEM.
- Gire la rejilla de modo que el lado de soporte de carbono esté mirando hacia otro lado del brazo secante y repita el proceso, aplicando cuidadosamente el líquido al lado de soporte de película de carbono de la rejilla. Evite tocar la película de carbono con la punta de la pipeta para no dañar la película de carbono. El líquido debe extenderse a través de la red debido a la carga depositada durante la descarga de resplandor.
- Inicie el proceso de borrado mientras observa la cuadrícula. Un visor está disponible en la Leica GP2 para este propósito.
- Observe si el líquido se extrae de la superficie de carbono de la rejilla durante este tiempo, esto comienza con la mayoría del bolo líquido en la rejilla aplanándose a medida que el líquido es perverso a través de la rejilla. A medida que el líquido en cada cuadrado de la cuadrícula se reduce aún más, se puede observar una onda de "estallido" a través de la superficie de la rejilla. Si se observa este efecto, el borrado se puede detener dentro de los 2-3 s posteriores al final del efecto de estallido. No es necesario sumergir la rejilla de prueba que se puede descartar.
- Si no se observa el llamado efecto 'popping', repita los pasos 2.11-2.14, cada vez extendiendo el tiempo de borrado en 1-2 s hasta que se observe el efecto de estallido justo antes de que el brazo secante se retraiga de la rejilla. Tenga en cuenta esta vez para el paso 3.
NOTA: Es importante que el blotting se detenga tan pronto como se haya producido este efecto de estallido para garantizar que durante el proceso, los cristales no se deshidraten por el exceso de blotting. Utilice la solución de cristalización del depósito para la retrosección y la dilución de la muestra, ya que garantiza que los cristales estén sujetos a una solución consistente, reduciendo el riesgo de desestabilizar los cristales.
3. Cosecha de cristales
- Coloque la placa de cristalización bajo el microscopio de luz y coloque el objetivo bien dentro del campo de visión.
- Coloque una rejilla fresca y descargada por resplandor en las fórceps del congelador de inmersión y monte las fórceps en el congelador de inmersión, con el lado de la película de carbono mirando hacia otro lado del brazo secante.
- Gire los fórceps para que el lado de la película de carbono se enfrente al brazo secante.
- Usando una pipeta de 2.5 μL, aplique 2 μL de solución de reservorio desde el tubo de 0.5 mL al lado no soportante de la rejilla cryoTEM y gire la rejilla de modo que el lado de soporte de la película de carbono esté orientado hacia el puerto de muestra del congelador de inmersión.
- Retire el sello temporal y con la pipeta puesta a 2 μL, aspire suavemente la gota de cristalización repetidamente para suspender los microcristales (es importante no introducir burbujas de aire a la gota).
NOTA: Es fundamental observar este proceso bajo el microscopio de luz para garantizar que los cristales se liberen de cualquier superficie de la piel o la base del pozo. Si los cristales están atascados y no se dibujan con aspiración, se puede usar la punta de la pipeta u otras herramientas de cristalización, como una aguja de acupuntura, para desalojar suavemente los cristales. Dependiendo del tamaño de los cristales y la profundidad de campo del microscopio de luz, a veces es posible ver, usando el microscopio, los cristales que entran en la punta de la pipeta. - Transfiera 2 μL de la suspensión de microcristales aspirados al congelador de inmersión y aplique toda la muestra al lado de carbono de la rejilla cryoTEM.
- Borde durante el tiempo determinado en el paso 2 e inicie inmediatamente la congelación por inmersión. Durante el borrado, observe la aparición de un efecto de onda de estallido a través de la cuadrícula y observe si esto ocurrió completamente a través de la cuadrícula. La presencia de cristales puede afectar el tiempo de borrado inicial, y esto puede necesitar ser ajustado para las rejillas posteriores en 1-2 s.
- Trabajando rápidamente, transfiera la rejilla del etano líquido a la caja de rejilla sumergida en nitrógeno líquido. El etano residual puede convertirse en un sólido blanco opaco en la rejilla cuando ingresa nitrógeno líquido. Para reducir esto, retire la rejilla constantemente del etano líquido, luego transfiera rápidamente al depósito de nitrógeno líquido.
- Una vez que se hayan colocado 4 rejillas en la caja de rejilla, asegure la tapa de la caja con el tornillo y transfiérala a un dewar de espuma de nitrógeno líquido para permitir una evaluación adicional de la muestra con un microscopio electrónico de barrido (SEM) o a un dewar de almacenamiento de nitrógeno líquido utilizando un contenedor de almacenamiento apropiado.
4. Evaluación de la densidad de la muestra mediante microscopía de luz
PRECAUCIÓN: Este método es destructivo. Si hay una disponibilidad limitada de muestra, como solo una o dos gotas de cristalización, se recomienda omitir este paso. Después de la congelación de muestras (paso 3.7) se puede evaluar la distribución de cristales a través de la rejilla.
- Monte una rejilla crioTEM seca a temperatura ambiente en las yercepciones del congelador y coloque las pórceps de lado en el microscopio de luz, con la rejilla en el campo de visión. Establezca un aumento y un enfoque adecuados para que se pueda resolver toda la cuadrícula y los cuadrados de cuadrícula individuales.
- Siga los pasos 3.1-3.7.
- En lugar de transferir la rejilla a la caja de rejilla (paso 3.8), retraiga la rejilla hundida del etano líquido restableciendo el congelador.
PRECAUCIÓN: La rejilla y la muestra se calentarán a temperatura ambiente y no se pueden usar para experimentos de difracción adicionales. - Retire las pórceps del instrumento de congelación por inmersión.
- Mientras sostiene la rejilla dentro de las pórceps, coloque la rejilla bajo el microscopio de luz: el enfoque ya estará aproximadamente establecido.
- Realice un enfoque fino y evalúe la densidad de los cristales a través de la rejilla. Una buena cuadrícula contendrá varios cristales aislados lejos de las barras de la rejilla dentro de cada cuadrado de la cuadrícula y la aglomeración de cristales es mínima.
- Cuando la densidad de los cristales dentro de la rejilla resulte en la aglomeración de cristales con solo unos pocos cristales aislados, diluya aún más la suspensión de cristales con solución reservorio y repita el paso 3. Tenga cuidado al diluir las muestras para que la dilución no resulte en la disolución de los cristales.
- Diluya los cristales en pasos utilizando pequeños volúmenes de 0.5-1 μL.
5. Evaluación de muestras por microscopía electrónica de barrido
NOTA: La preparación de microcristales en rejillas crioTEM se evalúa mejor con una microscopía electrónica de barrido (SEM) en condiciones criogénicas, esto se puede lograr con un SEM equipado con una etapa criogénica. En VMXm, se utiliza un JEOL JSM-IT100 SEM (fuente de tungsteno) con una esclusa de aire Quorum PP3006 y crioesta. Para garantizar un daño mínimo por radiación al ver muestras en VMXm28,29, se utilizan las siguientes configuraciones: voltaje de aceleración de 5 kV; un tamaño de punto de 40 (unidades arbitrarias en el JEOL JSM-IT100); Distancia de trabajo de 10 mm. Las imágenes se graban utilizando el detector de electrones secundario, para la alineación de la muestra y el enfoque se utiliza un tiempo de permanencia de 0,8 μs, mientras que las imágenes de alta resolución de cristales individuales se capturan utilizando un tiempo de permanencia de 16 μs. Es importante antes de cargar una muestra en el SEM que el microscopio esté alineado según las instrucciones del fabricante. Se recomienda que solo se cargue una sola rejilla en el SEM, mientras que las rejillas restantes preparadas con los mismos parámetros se reservan para experimentos de difracción de rayos X.
- Prepare el SEM enfriando la crioescéla de muestra a -180 °C según las instrucciones del fabricante. Siga las instrucciones para cargar las rejillas cryoTEM en el sistema específico disponible.
- Con la muestra cargada en el SEM, encienda el haz de electrones, alinee la muestra y establezca el enfoque utilizando un aumento alto (tiempo de permanencia de 0,8 μs).
- Primero, realice la evaluación inicial con toda la cuadrícula a la vista a bajo aumento (x45). Grabe una imagen con este aumento.
- Aumente el aumento para permitir una inspección más cercana de los cuadrados de cuadrícula individuales, los cristales individuales deben ser observables muy claramente.
- Muévase alrededor de la cuadrícula, capturando imágenes fijas (tiempo de permanencia de 16 μs) de cristales asegurándose de que cumplan con los siguientes requisitos antes de continuar:
- Asegúrese de que las rejillas sean planas y que la película de soporte de carbono esté en gran parte intacta.
- Asegúrese de que haya numerosos cristales individuales con un halo estrecho de líquido vitrificado que rodea el cristal.
- Asegúrese de que los orificios en la película de soporte de carbono sean visibles.
- Asegúrese de que no haya grandes regiones de líquido vitrificado como se define por una apariencia oscura y suave.
- Asegúrese de que haya poco o ningún hielo hexagonal, o hielo superficial disperso por la rejilla.
- Asegúrese de que los cristales se distribuyan uniformemente a través de la película de soporte y no se superpongan.
- En este punto, mida con precisión las dimensiones de una serie de cristales para permitir una correlación precisa del tamaño del haz de rayos X durante experimentos de difracción posteriores.
- Las muestras que se pueden recuperar de manera confiable del SEM y mantenerse a temperaturas criogénicas se pueden usar más tarde para experimentos de difracción de rayos X. Si esto no es posible, deseche estas muestras.
NOTA: Al obtener imágenes tanto de toda la cuadrícula como de microcristales individuales (aproximadamente x45 y x700 de aumento respectivamente), se debe realizar una evaluación sobre si se debe proceder a la línea de haz con rejillas preparadas utilizando los mismos parámetros o si algunos parámetros pueden necesitar ajustes durante el paso 3. Las cuadrículas deben cumplir las pruebas descritas en el paso 5.5. Si las cuadrículas no cumplen estos criterios, se requiere una mayor optimización durante el paso 3 antes de repetir el paso 5.
6. Preparación de la cuadrícula para experimentos de difracción en VMXm
- Enfríe el número requerido de portáns muestras VMXm(Figura 4A)(hasta 5) cargados en el cartucho de muestra (con tapa) con el cargador de muestras en un dewar de espuma grande(Figura 4B)utilizando nitrógeno líquido, esto puede requerir un gran volumen de nitrógeno líquido. El nivel de nitrógeno líquido debe estar justo por encima de la posición de la muestra en el cargador de muestras.
- Preparar circlips y herramientas.
- Coloque las herramientas, incluida la herramienta de recorte, las torceps y las pórceps de muestra VMXm, en los orificios del cargador de muestras para que se enfríen. Puede ser útil organizar un foco sobre el dewar.
- Transfiera rápidamente la caja de rejilla que contiene las rejillas cargadas con microcristales al hueco de la caja de rejilla en el cargador de muestras y desenrosque la tapa de tal manera que esté suelta y giratoria (no la retire).
- Debajo del nitrógeno líquido, retire la tapa del cartucho de muestra con forzas grandes y colóquela debajo del cargador de muestras.
- Utilice las pórceps de muestra VMXm para levantar el soporte de muestras sobre el cargador de muestras, asegurándose de que el soporte esté orientado hacia arriba para que pueda aceptar una rejilla. Cuando esté en la posición correcta, un pequeño pasador en el cargador de muestras se enganchará con el pequeño orificio en el medio del soporte de la muestra.
- Con las forzas finas refrigeradas, levante cuidadosamente la rejilla de la caja de rejilla y transfiérala cerca de la abertura de la rejilla en el soporte de la muestra. Gire la rejilla para que quede plana (no importa hacia dónde se enfrente el lado de la película de soporte).
- Baje suavemente las fórceps para que la rejilla esté lo más cerca posible por encima de la abertura de la rejilla (tenga cuidado de no doblar la rejilla) y suelte la rejilla en la abertura. Si la rejilla no se asienta correctamente, use cuidadosamente las esórceps finas para empujar la rejilla a su posición o golpee suavemente el soporte de la muestra con las pórceps más grandes.
- Coloque rápidamente la herramienta circlip preenfriada sobre la rejilla en la abertura de la rejilla y coloque el circlip presionando el botón. Puede ser útil aplicar 2 depresiones del botón para asegurarse de que el circlip esté correctamente asentado.
- Remásr el nitrógeno líquido para que el nivel esté ~1,5 cm por encima del soporte de la muestra. Con las pinzas de muestra VMXm, levante con cuidado el soporte de muestra cargado hacia arriba y sobre el pequeño pasador en el cargador de muestras y vuelva al cartucho de muestra. Anote el número de posición del portan muestras en el cartucho de muestra.
- Continúe cargando rejillas en los soportes de muestra hasta que se carguen todas las muestras.
- Devuelva las cajas de cuadrícula al dewar de almacenamiento si las muestras permanecen dentro y retire el cargador de muestras del dewar para crear más espacio.
- Reemplace la tapa del cartucho en el cartucho, asegurándose de que el pasador en la parte superior del cartucho se engancha con el orificio de la tapa.
- Enfríe y llene el dewar de la esclusa de aire VMXm con nitrógeno líquido y colóquelo junto al dewar de espuma que contiene el cartucho de muestra cargado.
- Usando la herramienta de cartucho VMXm, engancha cuidadosamente la herramienta en las crestas en el costado del cartucho y levanta rápidamente el cartucho en el dewar de la esclusa de aire.
- Asegúrese de que el nivel de nitrógeno líquido cubra el cartucho.
- Coloque la tapa en el dewar de la esclusa de aire y diríjase a la estación final VMXm con el cartucho de muestra cargado.
NOTA: La carga del cartucho de muestra en la estación final VMXm será realizada por el personal de beamline.
Resultados
El objetivo de este protocolo es lograr microcristales vitrificados con un volumen mínimo de líquido que rodea el cristal que permitan experimentos de difracción de rayos X con una dispersión de fondo mínima para mejorar la señal de difracción. Las imágenes SEM de ejemplo de microcristales preparados en cuadrículas cryoTEM para una dispersión de fondo mínima se muestran en la Figura 1A, B y figura 2. Las rejillas con monocristales distribuidos uniformemente proporcionarán el uso más eficiente de la red, con una buena señal a ruido. Sin embargo, esto generalmente no es posible en toda la cuadrícula y algunas regiones pueden mostrar cierta cantidad de aglomeración(Figura 2A, B). A pesar de esta aglomeración, estos ejemplos todavía muestran un número útil de cristales aislados individuales que proporcionarán difracción de bajo fondo(Figura 5). El nivel de borrado que aún mantiene una dispersión de fondo bajo puede variar. El objetivo es una fuerte manchada tal que los agujeros en la película de soporte de carbono sean claramente visibles pero los cristales permanezcan hidratados (Figura 2C, D). Sin embargo, las rejillas de buena calidad aún pueden mostrar algo de líquido dentro de los orificios de la película de soporte, aunque la posición de los orificios aún debe ser identificable(Figura 2A, B). Es importante destacar que todos estos ejemplos muestran cristales individuales y aislados con un halo vitrificado de líquido que rodea el cristal para mantener la hidratación entre la seta y la congelación por inmersión.
Muchas muestras pueden requerir una mayor optimización(Figura 3),que puede incluir la variación del tiempo de borrado o la concentración de los microcristales. Las rejillas sobrecargadas con cristales demostrarán una eficiencia de borrado reducida y pueden dar lugar a que se registren múltiples redes en imágenes de difracción única(Figura 3A, B). Las condiciones de cristalización más viscosa, como la de la tripsina, que contiene 8% de PEG 4000 y 15% de etilenglicol(Figura 3C),pueden resultar en la necesidad de tiempos de borrado más largos (>10 s). Por el contrario, las condiciones de cristalización con muy baja viscosidad que se borran muy rápidamente, pueden sufrir problemas de distribución debido a la gravedad que causa la sedimentación antes de que ocurra el blotting, lo que resulta en que todos los microcristales se asienten a lo largo de un lado de la rejilla(Figura 3D).
La preparación óptima de las muestras permite explotar todas las capacidades de VMXm para recopilar datos de difracción de rayos X de alta calidad a la resolución más alta posible con alta señal a ruido(Figura 5). Estas muestras se benefician de ser compatibles con el entorno de muestra in-vacuo, lo que resulta en recuentos de fondo promedio muy bajos o nulos en las imágenes de difracción. El uso de etano líquido, sin crioprotedor, da como resultado una ausencia de anillos de hielo(Figura 5),aunque cuando los cristales se encuentran cerca de las barras de la rejilla de cobre, el haz de rayos X puede mirar las barras, lo que resulta en anillos de difracción de polvo de cobre a ~ 2.1 Å y ~ 1.8 Å.
Figura 1: Comparación del montaje de microcristales en soportes de micromesh y rejillas cyoTEM. Micrografías electrónicas de barrido de microcristales congelados de virus poliédricos que miden 2,5 μm de ancho(A, B)5 kV de tensión de aceleración, un tamaño de punto de 39 (unidades arbitrarias) y un tiempo de permanencia de 16 μs. La rejilla está libre de exceso de líquido (A), se observa un estrecho halo de líquido que rodea los cristales (B). Las mismas muestras se montaron en una micromesh (aperturas de 20 μm) antes del enfriamiento por flash en nitrógeno líquido y se observaron utilizando el sistema de visualización en el eje en la línea de haz I24 cara a cara (C) y de lado a lado (D). Las distorsiones ópticas (C) al ver de frente dan una indicación de la extensión del espesor del líquido a través de la micromesh, esto es más claro cuando se ve la micromesh lateral (D). El objetivo rojo en C y D representa la posición y el tamaño del haz de rayos X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos de muestras de buena calidad. Cristales de poliedros (A) observados a través de un solo cuadrado de cuadrícula de ~100 μm. Mientras que algunos de los cristales están ligeramente agrupados y muestran cierta conectividad del líquido circundante, hay una serie de cristales individuales aislados con un pequeño halo de líquido que rodea el cristal. Los cristales de insulina ligeramente más grandes(B)que miden ~ 5 x 5 μm también muestran cierta aglomeración, pero nuevamente hay cristales individuales bien aislados. Los cristales de aguja pueden tener una dimensión muy estrecha y requieren una microperme, como estos cristales de lisozima en forma de aguja(C). Se puede ver una estrecha banda de líquido rodeando estos cristales (halo gris claro). Los microcristales más grandes de hasta decenas de micras también se pueden montar bien en rejillas crioTEM, como estos cristales de proteinasa K de ~ 7 μm(D). Tanto en (C) como en (D) y en menor medida en (A), los orificios de la película de soporte de carbono son claramente visibles, lo que demuestra la presencia de muy poco o ningún líquido. En el ejemplo B, aunque no se observan agujeros vacíos, aún se puede identificar la posición de los agujeros, lo que indica que el líquido solo está llenando los orificios en la película de soporte. En todos estos ejemplos, se puede ver un halo de líquido alrededor del borde del cuadrado de la rejilla (un cuadrado interior redondeado), donde los agujeros tienen una apariencia gris más clara. Esta es una característica común de las rejillas bien preparadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de muestras que requieren una mayor optimización. Las rejillas sobrecargadas con microcristales(A, B)pueden aumentar la dispersión de fondo a medida que las muestras bloquean los orificios en la película de soporte reduciendo la eficiencia de borrado, y con una mayor tensión superficial entre los cristales queda más líquido. Además de una degradación en la señal a ruido que resulta en una pérdida de información, es probable que se registren múltiples celosías. El uso de un tiempo de borrado que no es lo suficientemente largo, o una solución de cristalización altamente viscosa puede resultar en una muestra demasiado húmeda(C),que también produce una baja señal a ruido. Las condiciones de cristalización sin precipitantes, como las de la insulina bovina(D),tienen una viscosidad muy baja. Si bien esto resulta en un tiempo de borrado muy corto, también puede resultar en el movimiento de cristales a través de la rejilla antes y durante el borrado debido a los efectos de la gravedad. Esto generalmente resulta en una rejilla en gran parte vacía con una alta concentración de cristales a lo largo de un borde(D). Puede ser ventajoso agregar un agente viscoso como el etilenglicol a la suspensión de cristales poco antes de aplicarlos a la rejilla para reducir el flujo de cristales y mejorar la distribución de los cristales. Esto también puede alargar el tiempo de borrado, lo que facilita la observación del borrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Herramientas para la carga de muestras en VMXm. Se ha diseñado un conjunto de herramientas a medida para cargar los soportes de muestra VMXm (A). El cargador de muestras(B)tiene espacio para un solo soporte de muestra VMXm, una caja de cuadrícula y almacenamiento de herramientas mientras trabaja. También está diseñado para permitir trabajar justo debajo de la superficie del nitrógeno líquido y permitir que el cartucho de muestra quepa debajo de (B). El dewar de esclusa de aire (C), que se ajusta a la caja de gas nitrógeno de la esclusa de aire en la estación final VMXm, se utiliza para llevar el cartucho de muestra cargado del laboratorio a la cabina experimental de la línea de haz. Para ver las muestras en el SEM fuera de línea, se ha realizado un transbordador a medida(D)compuesto por el portmuestras VMXm sin base para permitir la evaluación en el soporte de muestra que se utiliza en la línea de haz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de difracción a partir de microcristales en VMXm. Una sola imagen de difracción grabada utilizando un detector Pilatus 3 6M en VMXm de un cristal poliédrico de virus de ~ 3 μm montado en una rejilla crioTEM utilizando el método de congelación por inmersión. Se observa difracción más allá de 1,7 Å y se insecua una reflexión (cuadrado azul) a 1,74 Å, lo que demuestra la baja dispersión de fondo, con un alto número de píxeles con recuentos cero. Se agregó etilenglicol a una concentración final de 50% v / v a la suspensión de cristal antes de aplicarlo a la rejilla. La naturaleza de fondo bajo de la posición de la muestra VMXm se demuestra por el fondo constante a través de la imagen, como se muestra por las intensidades trazadas debajo de la línea discontinua azul, incluso cerca del centro del haz. Las intensidades trazadas muestran que el fondo permanece por debajo de 3 recuentos. Se observan dos anillos débiles a 2,15 Å y 1,86 Å que se generan por difracción de polvo del cobre de la rejilla crioTEM. No hay anillos de hielo detectables, lo que demuestra la efectividad de la secante seguida del enfriamiento con etano líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Este protocolo demuestra cómo las herramientas de la preparación de muestras cryoTEM se pueden utilizar para la preparación de microcristales para experimentos de difracción de rayos X en líneas de haz de microenfoque. La instrumentación estándar de la línea de haz se centra alrededor de una muestra montada en un pasador y, aunque se han realizado esfuerzos para proporcionar un soporte de muestra en estos soportes para microcristales, a menudo son difíciles de cargar con la muestra al tiempo que se garantiza que se logre la mayor señal a ruido(Figura 1C, D). Muchas de estas muestras también pueden requerir la optimización de las condiciones de crioprotección para garantizar que la muestra sea vítrea. El método de congelación por inmersión proporciona una manera repetible para eliminar el exceso de líquido y enfriar la muestra en un criógeno eficiente(Figura 1A, B). Mientras que la rejilla se puede montar en una línea de haz estándar con un soporte de pin basado en pinzas, los soportes de muestra VMXm se han diseñado específicamente para aceptar rejillas y mantenerlas por debajo de la temperatura de transición vítrea en un entorno de vacío a través de un enfriamiento conductivo. El entorno de muestra de VMXm permite la recopilación de datos de bajo fondo, donde la muestra es la fuente restante de fondo, y proporciona una microperla que se puede utilizar para hacer coincidir cristales con dimensiones inferiores a 10 μm. Este método de preparación de muestras también se puede utilizar para preparar nanocristales para la difracción de electrones donde también hay un requisito de muy poco exceso de líquido y una muestra vítrea debido a la débil penetración de electrones. Si bien las rejillas cryoTEM son frágiles, las experimentadas en la recolección de cristales en bucles se adaptarán rápidamente al manejo de las rejillas. Con una pequeña cantidad de experiencia, se perderán pocas rejillas durante las etapas de borrado, congelación y carga del protocolo. Sin embargo, los pasos de optimización son críticos para este éxito y una preparación cuidadosa reducirá las posibilidades de perder cristales o reducir la integridad del cristal.
Las rejillas CryoTEM proporcionan un montaje único relativamente grande que puede contener muchos cientos de cristales, mejorando así el rendimiento donde solo puede ser posible registrar una pequeña cuña de datos de difracción. Una sola cuadrícula también puede proporcionar suficientes cristales para determinar la estructura de la proteína, particularmente en cristales de alta simetría. Cuando solo una o dos gotas de cristalización simple han generado microcristales, la eliminación de prueba de la condición de cristalización por sí sola puede ayudar a garantizar que cuando se borran los microcristales, los tiempos utilizados sean lo más cercanos posible a los necesarios para generar muestras iniciales de buena calidad. Los soportes de película de carbono son invisibles para los rayos X y están disponibles con diferentes orificios espaciados, que se pueden usar para adaptarse a una morfología particular. Utilizamos más comúnmente películas de soporte con orificios de 2 μm a un espaciado de 2 μm, pero los agujeros más pequeños con mayor espaciado pueden ser más apropiados para cristales de menos de 2 μm. Otras películas de soporte como las que tienen orificios de 1 μm con un espaciado de 4 μm, así como películas de soporte con orificios de diferentes formas están disponibles, todo lo cual afectará el tiempo de borrado. Un tamaño de malla cuadrada de cuadrícula de 200 (200 cuadrados por pulgada) también proporciona suficiente espacio (~ 100 μm) entre las barras de rejilla de cobre para que el haz de rayos X no interactúe fuertemente con el cobre al tiempo que proporciona suficiente soporte estructural para la película de carbono cargada de cristales. El uso de etano líquido niega la necesidad de crioprotectores, lo que a su vez reduce el requisito de volumen de muestra que se habría utilizado en la optimización de las condiciones de crioprotectores.
Los principales parámetros a optimizar durante el proceso son los tiempos de borrado y la dilución de la muestra. Los tiempos de borrado deben ser lo suficientemente largos como para observar el efecto de "estallido" en toda la rejilla antes de la congelación por inmersión. El exceso de secar podría resultar en la deshidratación de los cristales, sin embargo, el control de la humedad dentro de la cámara de muestra se utiliza para minimizar este efecto. Si bien se sugiere que se utiliza una humedad relativa del 90%, algunas muestras pueden beneficiarse en la optimización de la humedad. La humedad puede afectar la eficiencia de borrado del papel secante que puede saturarse lentamente con agua. Además, el control de la humedad dentro de la cámara de muestra podría utilizarse para mejorar la calidad de difracción de los cristales30. Se recomienda que se realicen pequeños cambios (<5%) en la humedad antes de verificar la integridad de la difracción para garantizar que la calidad de la difracción no se degrade.
La optimización de muestras no preciosas se puede realizar utilizando un microscopio de luz en lugar de un SEM. Aunque destructivo, es útil para evaluar la densidad de los cristales a través de la rejilla y para permitir la toma de decisiones sobre si una muestra debe diluirse o concentrarse para dispersar mejor los cristales a través de la rejilla. Este paso es más útil cuando hay una gran cantidad de cristales disponibles y muestras particularmente altamente concentradas. Se debe evitar la agrupación de cristales(Figura 3),ya que si bien no es un problema significativo si dos cristales se iluminan al mismo tiempo durante la recopilación de datos6,es probable que haya un mayor volumen de líquido que rodea el grupo, reduciendo así la señal a ruido(Figura 5). Si bien es posible observar grandes excesos de líquido a nivel mundial a través de la red utilizando un microscopio de luz, la evaluación del volumen de líquido que rodea los microcristales y la presencia de hielo cristalino solo se puede hacer utilizando un microscopio electrónico equipado con un sistema de transferencia de vacío criogénico y una etapa. A veces, después de la aplicación de los cristales a la rejilla y antes de que se produzca la seque, los cristales en soluciones de baja viscosidad pueden asentarse a lo largo de un borde de la rejilla. Hemos encontrado que la adición de una concentración final del 50% de etilenglicol puede ralentizar el movimiento de los cristales a través de la gota, asegurando una mejor distribución de los microcristales a través de la rejilla, así como proporcionando un mayor control sobre el borrado al aumentar el tiempo de borrado (Figura 3D).
Algunas soluciones de cristalización que contienen agentes precipitantes viscosos, como los PEG de alto peso molecular, pueden resultar difíciles de borrar, lo que requiere tiempos de borrado cada vez más largos (>10 s). En tales casos, puede ser útil reducir el volumen de líquido depositado en la parte posterior de la rejilla, así como el volumen de la solución que contiene el cristal en el lado de la película de soporte de la rejilla. Estrategias como el uso de 2 capas de papel secante o fibras de vidrio también pueden ayudar a secar en estos casos difíciles31.
Si bien esta tubería es adecuada para cristales de proteínas solubles, aquellos que se forman en medios muy viscosos como las proteínas de membrana en LCP presentan un desafío diferente para el cual este protocolo no es adecuado. Sin embargo, están surgiendo estrategias para preparar cristales de LCP en rejillas crioTEM para microED que incluyen la reducción de la viscosidad de las muestras mediante la inducción de un cambio de fase en el LCP. Esto permite que las muestras se apliquen a las cuadrículas de manera similar a la descrita en este artículo. Finalmente, la muestra se puede fresar con un haz de iones enfocado para eliminar el exceso de material no cristalino32,33,34.
En general, esta tubería generalmente tomará de 1 a 2 h (incluido el tiempo de configuración del equipo) desde que la muestra llega a VMXm hasta proporcionar rejillas optimizadas con muestras vitrificadas bien dispersas, dependiendo de la disponibilidad de la muestra, la concentración de cristales y la viscosidad de la solución de cristalización. Estos métodos ya se han empleado con éxito para la preparación de microcristales para experimentos de difracción de rayos X que exploran el daño por radiación en microcristales donde un volumen mínimo de líquido que rodea la muestra era esencial28,35. Cabe señalar que el protocolo se puede aplicar a todas las muestras de microcristales solubles, no solo a las muestras de difracción de pozos que ya han sido optimizadas. Un experimento de cristalización que produce material microcristalino sería tradicionalmente un objetivo para la optimización con el objetivo de obtener cristales más grandes, sin embargo, este método de preparación de muestras y las capacidades de VMXm pueden permitir que se recopilen datos adecuados de dichas muestras sin mayor optimización. Alternativamente, si tales muestras microcristalinas se difractan mal, los datos recopilados de VMXm utilizando este método de preparación de muestras aún podrían actuar como una guía útil para una mayor optimización de las condiciones de cristalización. Las herramientas para preparar rejillas, incluida la descarga de resplandor y la congelación por inmersión, ahora están ampliamente disponibles en institutos de investigación equipados para experimentos cryoTEM y estarán disponibles para muchos usuarios, lo que les permitirá preparar muestras antes del tiempo de haz en VMXm.
Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton y Dave Stuart, de la Universidad STRUBI de Oxford y a Rachel Bolton, de la Universidad de Southampton, por proporcionar amablemente muestras de microcristales para el desarrollo y la demostración de métodos de preparación de muestras para la línea de haz VMXm, además de permitir la puesta en marcha de la línea de haz. Los autores también desean agradecer a iNEXT-Discovery (proyecto número 871037) por la oportunidad y el apoyo en la publicación de este manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Instrumento de congelación por inmersión Cryo-EM automatizado | Leica o ThermoFisher | Varios | |
| Microscopio óptico de sobremesa con fuente de luz | Varios | Varios Cuchilla | |
| /bisturí | Fisher Scientific | Varios | |
| Rejillas de malla CryoTEM Copper 200 con película de soporte de carbono con 2 µ m agujeros | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
| Cajas de almacenamiento de rejilla CryoTEM | Agar Scientific | AGG3727 | |
| ddH2O | n/a | n/a | |
| Suministro de gas etano | n/a | n/a | |
| Etilenglicol | Acros Organics | 146750010 | |
| Portaobjetos de microscopio de vidrio | FisherBrand | 12383118 | |
| Placa de Petri de vidrio | FisherBrand | 455732 | |
| Dispositivo de descarga de brillo | Pelco | 91000S | |
| Varios | |||
| dispositivos de pipeteo | Varios | Varios Cinta | |
| de sellado para placas de cristalización. | Dimensiones moleculares | MD6-01 | |
| Nitrógeno líquido pequeño/mediano dewars | Spearlab | Varios | |
| Herramienta de recorte de anillo de seguridad Sprung | Subangstrom | SCT08 | |
| Whatmann No.1 papel de filtro precortado | Leica | 16706440 |
Referencias
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