Cuádruple-Checkerboard: Una modificación del tablero de ajedrez tridimensional para el estudio de combinaciones de drogas

Resumen

Este protocolo describe cómo estudiar todas las combinaciones posibles que se pueden obtener entre cuatro fármacos en un solo experimento. Este método se basa en el ensayo estándar de micro dilución de placas de 96 pozos y el cálculo de concentraciones inhibitorias fraccionadas (FICs) para evaluar los resultados.

Resumen

El concepto de terapia de combinación de fármacos se está volviendo muy importante principalmente con el aumento drástico de la resistencia a los medicamentos. El tablero de ajedrez cuádruple, también llamado tablero Q, tiene como objetivo maximizar el número de combinaciones posibles que se pueden obtener entre cuatro fármacos en un experimento para minimizar el tiempo y el trabajo necesarios para lograr los mismos resultados con otros protocolos. Este protocolo se basa en la técnica de micro dilución simple donde los fármacos se diluyen y se combinan en varias placas de 96 pozos.

En el primer conjunto de placas de 96 pozos, se agrega caldo Muller-Hinton seguido del primer medicamento requerido (por ejemplo, cefotaxima aquí) para diluirlo en serie. Una vez realizado el primer paso, se utiliza otro conjunto de placas de 96 pozos para diluir el segundo fármaco (por ejemplo, Amikaci), que se transferirá eliminando un volumen específico de fármaco 2 y se colocará en los pozos correspondientes en el primer conjunto de placas de 96 pozos que contiene el fármaco uno. El tercer paso se realiza mediante la adición de las concentraciones requeridas de la tercera droga (por ejemplo, Levofloxacina), a las placas apropiadas en el conjunto inicial que contiene la combinación de la droga 1 y 2. El cuarto paso se realiza mediante la adición de las concentraciones requeridas de la cuarta droga (por ejemplo, Trimetoprima-sulfametoxazol) en las placas apropiadas en el primer conjunto. Luego, se preparará y agregará el inóculo bacteriano E. coli ESBL.

Este método es importante para evaluar todas las combinaciones posibles y tiene una gama más amplia de posibilidades para ser probado además para pruebas in vivo. A pesar de ser una técnica agotadora que requiere mucho enfoque, los resultados son notables y ahorran tiempo donde se pueden probar muchas combinaciones en un solo experimento.

Introducción

Con el aumento de la resistencia debido al uso excesivo y mal uso de los antibióticos^1,2, la necesidad de desarrollar nuevos fármacos y agentes para tratar las infecciones bacterianas se ha vuelto crucial. Los nuevos enfoques, como el desarrollo de nuevos fármacos, son muy importantes para superar la crisis de resistencia. Sin embargo, la industria farmacéutica no está interesada en desarrollar nuevos agentes antimicrobianos. Además, si se desarrollan nuevos fármacos, las bacterias seguirán evolucionando y desarrollando resistencia contra estos nuevos fármacos^3,

Protocolo

1. Pasos de preparación

1. Preparar caldo Muller-Hinton (MHB) añadiendo 25 g de caldo MH a 1 L de agua destilada y mezclar. Autoclave a 121 °C durante 2,5 h. Luego, guarde los medios en autoclave a temperatura ambiente o en la nevera.
2. Subcultivo de las bacterias en cuestión (E. coli ESBL) en el medio de agar utilizando el método de rayas de cuatro cuadrantes e incubar durante la noche a 37 °C.
   1. Usando un lazo estéril, tome una colonia y esparcir en la primera mitad de la placa de agar MacConkey haciendo rayas paralelas cercanas.
   2. Usando el lazo, extienda las bacterias en el segundo cuadrante rayándolas desde el primer cuadran....

Resultados

La Figura 2A representa los resultados obtenidos mediante la combinación de Cefotaxima y Amikacina con concentraciones específicas de Levofloxacina y Trimetoprima-sulfametoxazol. Podemos ver en la parte izquierda de la figura las cuatro placas que se presentan esquemáticamente con las concentraciones de los fármacos en la parte derecha de la figura. Las flechas representan los pozos de la interfaz Crecimiento/sin crecimiento. Los pozos de colores son los pozos que contienen el crecimiento. N.......

Discusión

El método quadruple checkerboard se asemeja al checkerboard y al checkerboard tridimensional en su protocolo. Sin embargo, se deben tener en cuenta ciertos pasos cruciales para evitar errores durante el experimento.

Asegúrese de probar para el MIC de cada droga contra el aislante probado antes de comenzar el protocolo para saber cuáles son las concentraciones que se necesitan para comenzar las diluciones con para la droga 1 y la droga 2 que necesitan ser diluidas en serie en las placas. Con re.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1000 y micro; L puntas	Citotest	4330000402
200 µ Puntas L	Citotest	4330-0013-17
Tubo de centrífuga de 50 mL	corning	430828	Para la preparación de fármacos 3 y 4
5 mL de poliestileno de fondo redondo Tubo	Falcon	352058	Para 0,5 MacFarland Preparación de inóculo bacteriano
Placas de Petri de 90 mm	JRZ Plastilab		Como lecho para las soluciones que se van a añadir con la pipeta multicanal
Placas de 96 pocillos	corning	3596	Para la dilatación en serie y la combinación de fármacos
Bactrim 200, 40 mg (Trimetoprim-sulametoxazol	Por CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, Francia	10177403	Fármaco 4
Ceforano, 1 g (Cefotaxima)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Fármaco 1
Densitómetro
. Coli Cepa BLEE	Recuperada como cepa medicinal del Saint-George Hospital Líbano		Cepa bacteriana
Mac Conkey + agar violeta cristal	BIO-RAD	64169508	Para la fabricación de placas de agar utilizadas para el subcultivo
de miacina 500 mg/2 mL (amikacina)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Caldo Müller-Hinton	BIO-RAD	69444	Para la fabricación de medios bacterianos
Pipeta multicanal	Thermo Scientific	GJ54761	Para la dilución y adición en serie de medios, bacterias y medicamentos
Cinta
Pipetas monocanal	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	Para la adición de medios, bacterias y fármacos
Tavanic, 500 mg (Levofloxacina)	sanofi aventis	221937/2009	Fármaco 3

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