El protocolo presentado aquí describe una tubería completa para analizar los datos del transcriptoma de secuenciación de ARN desde lecturas sin procesar hasta análisis funcionales, incluidos los pasos de control de calidad y preprocesamiento para enfoques analíticos estadísticos avanzados.
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Artículo de método
Análisis de transcriptoma de alto rendimiento para investigar las interacciones huésped-patógeno
En este artículo
Resumen
Resumen
Los patógenos pueden causar una amplia variedad de enfermedades infecciosas. Los procesos biológicos inducidos por el huésped en respuesta a la infección determinan la gravedad de la enfermedad. Para estudiar tales procesos, los investigadores pueden utilizar técnicas de secuenciación de alto rendimiento (RNA-seq) que miden los cambios dinámicos del transcriptoma del huésped en diferentes etapas de la infección, los resultados clínicos o la gravedad de la enfermedad. Esta investigación puede conducir a una mejor comprensión de las enfermedades, así como a descubrir posibles objetivos farmacológicos y tratamientos. El protocolo presentado aquí describe una tubería completa para analizar los datos de secuenciación de ARN desde lecturas sin procesar hasta análisis funcionales. La tubería se divide en cinco pasos: (1) control de calidad de los datos; (2) mapeo y anotación de genes; (3) análisis estadístico para identificar genes expresados diferencialmente y genes coexpresados; (4) determinación del grado molecular de la perturbación de las muestras; y (5) análisis funcional. El paso 1 elimina los artefactos técnicos que pueden afectar a la calidad de los análisis posteriores. En el paso 2, los genes se mapean y anotan de acuerdo con los protocolos de biblioteca estándar. El análisis estadístico en el paso 3 identifica genes que se expresan diferencialmente o coexpresan en muestras infectadas, en comparación con las no infectadas. La variabilidad de la muestra y la presencia de posibles valores biológicos atípicos se verifican utilizando el enfoque de grado molecular de perturbación en el paso 4. Finalmente, el análisis funcional en el paso 5 revela las vías asociadas con el fenotipo de la enfermedad. La tubería presentada tiene como objetivo apoyar a los investigadores a través del análisis de datos de ARN-seq de estudios de interacción huésped-patógeno e impulsar futuros experimentos in vitro o in vivo , que son esenciales para comprender el mecanismo molecular de las infecciones.
Introducción
Los arbovirus, como el dengue, la fiebre amarilla, el chikungunya y el zika, se han asociado ampliamente con varios brotes endémicos y se han convertido en uno de los principales patógenos responsables de infectar a los humanos en las últimas décadas1,2. Las personas infectadas con el virus chikungunya (CHIKV) a menudo tienen fiebre, dolor de cabeza, erupción cutánea, poliartralgia y artritis3,4,5. Los virus pueden subvertir la expresión génica de la célula e influir en varias vías de señalización del huésped. Recient....
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Protocolo
Las muestras utilizadas en este protocolo fueron aprobadas por los comités de ética tanto del Departamento de Microbiología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo como de la Universidad Federal de Sergipe (Protocolos: 54937216.5.0000.5467 y 54835916.2.0000.5546, respectivamente).
1. Instalación de escritorio de Docker
NOTA: Los pasos para preparar el entorno de Docker son diferentes entre los sistemas operativos (SO). Por lo tanto, los usuarios de Mac deben seguir los pasos enumerados como 1.1, los usuarios de Linux deben seguir los pasos enumerados como 1.2 y los usuar....
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Resultados
El entorno informático para los análisis de transcriptomas se creó y configuró en la plataforma Docker. Este enfoque permite a los usuarios principiantes de Linux utilizar sistemas de terminal Linux sin conocimientos de gestión a priori. La plataforma Docker utiliza los recursos del sistema operativo host para crear un contenedor de servicios que incluye herramientas de usuarios específicos (Figura 1B). Se creó un contenedor basado en la distribución Linux OS Ubuntu 20.04 y se configuró comp.......
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Discusión
La preparación de las bibliotecas de secuenciación es un paso crucial para responder a las preguntas biológicas de la mejor manera posible. El tipo de transcripciones de interés del estudio guiará qué tipo de biblioteca de secuenciación se elegirá e impulsará los análisis bioinformáticos. Por ejemplo, a partir de la secuenciación de un patógeno y la interacción del huésped, de acuerdo con el tipo de secuenciación, es posible identificar secuencias de ambos o solo de las transcripciones del huésped.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
HN es financiado por la FAPESP (números de subvención: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 y 2013/08216-2) y CNPq (313662/2017-7).
Estamos particularmente agradecidos a las siguientes becas para becarios: ANAG (Proceso FAPESP 2019/13880-5), VEM (Proceso FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Proceso FAPESP 2020/05284-0), APV (Proceso FAPESP 2019/27146-1) y, RLTO (Proceso CNPq 134204/2019-0).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Laboratorio de Biología de Sistemas Computacional | CEMiTool | 1.12.2 | Descubrimiento y análisis de módulos de genes de coexpresión de forma totalmente automática, al tiempo que proporciona un informe HTML fácil de usar con gráficos de alta calidad. |
| EdgeR Bioconductor (Mantenedor: Yunshun Chen [yuchen en wehi.edu.au]) | 3.30.3 | Análisis de expresión diferencial de perfiles de expresión de RNA-seq con replicación biológica | |
| EnhancedVolcano | Bioconductor (Mantenedor: Kevin Blighe [kevin en clinicalbioinformatics.co.uk]) | 1.6.0 | Gráficos de volcanes listos para publicación con coloración y etiquetado mejorados |
| FastQC | Babraham Bioinformatics | 0.11.9 | Tiene como objetivo proporcionar una forma sencilla de realizar algunas comprobaciones de control de calidad en los datos de secuencia sin procesar procedentes de la secuenciación de alto rendimiento |
| FeatureCounts | , Instituto de Investigación Médica Walter y Eliza Hall | 2.0.0 | Asignar lecturas de secuenciación mapeadas a características genómicas especificadas |
| MDP | Laboratorio de Biología de Sistemas Computacionales | 1.8.0 | El grado molecular de perturbación calcula las puntuaciones de las muestras de datos del transcriptoma en función de su perturbación de los controles |
| R | R Core Group | 4.0.3 | Lenguaje de programación y entorno de software libre para computación estadística y gráficos |
| División | de Bioinformática STAR, Instituto de Investigación Médica Walter y Eliza Hall | 2.7.6a | Alineador diseñado para abordar específicamente muchos de los desafíos del mapeo de datos de RNA-seq utilizando una estrategia para tener en cuenta las alineaciones empalmadas |
| Bowtie2 | Universidad Johns Hopkins | 2.4.2 | Herramienta ultrarrápida y eficiente en memoria para alinear lecturas de secuenciación con secuencias de referencia largas |
| Trimmomatic | THE USADEL LAB | 0.39 | Tareas de secuencia de adaptador de recorte para datos de extremo emparejado y de extremo único de Illumina |
| Obtener Docker | Docker | 20.10.2 | Creación de un entorno bioinformático reproducible y predecible (https://docs.docker.com/get-docker/) |
| WSL2-Kernel | Windows | NA | https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel |
| Get Docker Linux | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/ |
| Docker Linux Repository | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository |
| MDP Sitio web | Laboratorio de Biología de Sistemas Computacional | NA | https://mdp.sysbio.tools |
| Enrichr Sitio web | de MaayanLab | NA | https://maayanlab.cloud/Enrichr/ |
| webCEMiTool | Laboratorio de Biología de Sistemas Computacionales | NA | https://cemitool.sysbio.tools/ |
| gProfiler | Grupo de Bioinformática, Algorítmica y Minería de Datos | NA | |
| https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost goseq | Bioconductor (Mantenedor: Matthew Young [my4 en sanger.ac.uk]) | NA | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html |
| SRA Estudio | NCBI NCBI | NA https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/ |
Referencias
- Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).
- Burt, F. J., et al. Chikungunya virus: an update o....
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Reimpresiones y permisos
