Artículo de método

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

DOI:

10.3791/62328

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13 de noviembre de 2021

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1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

En este artículo

Resumen

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Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Resumen

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Los estudios de genómica funcional del sistema inmune requieren manipulaciones genéticas que impliquen tanto la eliminación de genes diana como la adición de elementos a proteínas de interés. La identificación de las funciones génicas en modelos de líneas celulares es importante para el descubrimiento de genes y la exploración de los mecanismos intrínsecos de las células. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de células inmunes como las células T y las líneas celulares de macrófagos utilizando knock-in mediado por CRISPR / Cas9 son difíciles debido a la baja eficiencia de transfección de estas células, especialmente en un estado de reposo. Para modificar los genes en las células inmunes, la selección de resistencia a los medicamentos y los vectores virales se utilizan típicamente para enriquecer a las células que expresan el sistema CRIPSR / Cas9, lo que inevitablemente resulta en una intervención indeseable de las células. En un estudio anterior, diseñamos reporteros fluorescentes duales acoplados a CRISPR / Cas9 que se expresaron transitoriamente después de la electroporación. Esta solución técnica conduce a la rápida deleción de genes en las células inmunes; sin embargo, la eliminación de genes en células inmunes como las células T y los macrófagos sin el uso de la selección de resistencia a los medicamentos o vectores virales es aún más desafiante. En este artículo, mostramos que mediante el uso de la clasificación celular para ayudar a la selección de células que expresan transitoriamente construcciones CRISPR / Cas9 dirigidas al locus Rosa26 en combinación con un plásmido donante, se puede lograr un knock-in de genes tanto en células T como en macrófagos sin enriquecimiento de resistencia a los medicamentos. Como ejemplo, mostramos cómo expresar ACE2 humano, un receptor del SARS-Cov-2, que es responsable de la actual pandemia de Covid-19, en macrófagos RAW264.7 mediante la realización de experimentos en cadena. Tales células de knock-in de genes pueden ser ampliamente utilizadas para estudios mecanicistas.

Introducción

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Las células inmunes son críticas para la defensa contra los patógenos. Tanto la inmunidad innata como la adaptativa son necesarias para el aclaramiento de los infecciosos y el mantenimiento de la homeostasis tisular1,2. Los modelos de líneas celulares son herramientas esenciales para comprender los fundamentos moleculares del sistema inmune de los mamíferos; se utilizan en ensayos funcionales in vitro, como los que modelan la activación de células T humanas, y en la determinación de la función de los factores genéticos en la activación o amortiguación de las respuestas inmunes3,4. Es importante tener en cuenta que el sistema inmune de los mamíferos es enormemente heterogéneo y, lo que es igualmente importante, un gran número de moléculas controlan la diferenciación, la migración y la función de una célula determinada de tipo5,6.

Las herramientas de edición del genoma Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 permiten la manipulación genética de tipos celulares específicos, lo que facilita la anotación funcional de genes de manera precisa7,8. Varios protocolos publicados han descrito la entrega de CRISPR/Cas9 en forma de complejos de ARN guía Cas9 conocidos como ribonucleoproteínas (RNPs) en células HEK293, líneas celulares Jurkat, células T primarias9,10,macrófagos11,12,13,células madre14,y otras15,16. En estos protocolos, el etiquetado genético se suele conseguir fusionando una etiqueta fluorescente con proteínas endógenas17,18. Sin embargo, se han hecho pocos intentos de utilizar reporteros fluorescentes duales, que son compatibles con la clasificación de una sola célula, para facilitar los experimentos de knock-in19,20, particularmente en células inmunes.

Los análisis mecanicistas en profundidad destinados a comprender las funciones de un nuevo factor genético en las células inmunes generalmente requieren la eliminación específica del tipo celular de un gen, experimentos de rescate genético e idealmente la identificación de sus interactores. A pesar de que se han publicado métodos para la optimización de la deleción genética de genes en células inmunes9,15,21,se han reportado muchos menos métodos para introducir alelos en cadena con funciones versátiles para comprender la respuesta inmune. Por lo tanto, en este protocolo pretendemos describir en detalle un protocolo eficiente y altamente reproducible para expresar una proteína de interés (POI) en el locus de puerto seguro Rosa26 en líneas celulares inmunes humanas y murinas. Diseñamos un sistema reportero de dos colores para enriquecer las células transfectadas con plásmidos que expresan CRISPR/Cas9 (DsRed2) y una plantilla de ADN recombinante (EBFP2), que se puede aislar mediante clasificación celular. Siguiendo este protocolo, obtuvimos múltiples líneas knock-in de la línea de células T humanas Jurkat y el macrófago murino RAW264.7 para análisis funcionales de proteínas poco estudiadas.

A modo de ejemplo, mostramos en este protocolo cómo obtener macrófagos RAW264.7 que expresan de forma estable ace2 humana (un receptor del SARS-Cov-2)22. Debido a que las células inmunes innatas están involucradas en la patogénesis deCovid-19 23,24 y la ACE2 humana se considera un receptor importante requerido para la entrada viral en las células antes de la replicación, los macrófagos con knock-in de ACE2 humano pueden servir como una herramienta útil para estudios mecanicistas de multiplicación viral dentro de los macrófagos. Paralelamente, también presentamos un ejemplo de knock-in de un gen en el locus humano ROSA26 para expresar la proteína RASGRP1, que se fusionó en su extremo amino con una afinidad Twin-Strep-tag (OST). Las células T son células diana clave en las terapias inmunitarias, y un número creciente de estudios se han centrado en la manipulación de su capacidad de respuesta al cáncer25,26. Como se sabe que Rasgrp1 es una molécula de señalización clave aguas abajo del receptor de células T y sus interactores no están bien dilucidados27, el modelo de knock-in OST-RASGRP1 proporciona la base para identificar interactores que regulan la respuesta de las células T a los tumores y la infección. En conjunto, estas herramientas se pueden utilizar para estudios de Covid-19 y el descubrimiento de nuevas moléculas que interactúan con Rasgrp1.

Protocolo

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1. Diseño y construcción de plásmidos de sgRNAs dirigidos al locus Rosa26

  1. Guía de diseño de ARN alrededor del sitio de inserción deseado
    1. Asegúrese de que el sitio de inserción para los experimentos de knock-in del ratón Rosa26 (en adelante designado como mRosa26)se encuentra en el primer intrón de mRosa26; este sitio ha sido utilizado en estudios previos28,29. Para los experimentos de knock-in en células humanas, asegúrese de que el sitio de inserción reside en el locus humano ROSA26 (en adelante, hROSA26), que ha sido identificado como el homólogo humano de mRosa2630.
    2. Utilizar las secuencias genómicas de especies de ratones y humanos obtenidas de Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) y Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html), respectivamente. Copie 50 pares de bases (pb) de la secuencia genómica del locus mRosa26 o hROSA26 en cada lado flanqueando el sitio de inserción deseado.
    3. Guía de diseño de ARN utilizando la herramienta web en línea CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Pegue los 100 pb de secuencia de entrada de 1.1.2. Seleccione dos ARN guía con una puntuación de alta especificidad, una puntuación de alta eficiencia y una baja actividad fuera del objetivo. Además, elija guías de ARN con puntuaciones de Doench más altas y evite las etiquetadas como "Ineficientes"32.
      NOTA: Las herramientas de diseño CRISPR alternativas también son valiosas y están disponibles públicamente, por ejemplo, la herramienta de diseño Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). Para aumentar la frecuencia de las células mutadas por knock-in mediadas por CRISPR/Cas9, seleccione dos ARN guía cerca del sitio de inserción deseado cuando sea posible33.
    4. Para el locus mRosa26, utilice dos ARN guía adyacentes designados como mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') y mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figura 1A). Para el locus hROSA26, utilice dos ARN guía adyacentes, a saber, hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') y hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figura 1B).
      NOTA: Las actividades de edición del genoma de mR26-sg1 y mR26-sg2 y las de hR26-sg1 y hR26-sg2 se evaluaron en células RAW264.7 y células Jurkat, respectivamente (Ver Archivo Complementario, Figura S1).
  2. Clonación de vectores de expresión CRISPR que contienen sgRNA dirigido al locus Rosa26
    1. Sintetizar oligos hacia adelante y hacia atrás para un ARN guía (Ver Archivo Complementario).
      NOTA: Es preferible agregar un nucleótido 'G' al inicio de la secuencia guía, lo que ayuda con la expresión impulsada por el promotor U6. Por ejemplo, para clonar el mencionado mR26-sg1, el oligo delantero es CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT y el oligo inverso es AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. La G adicional en el oligo delantero y su complemento en el oligo inverso se indican en negrita.
    2. Clonar oligos sintéticos correspondientes a los ARN guía en el vector de expresión CRISPR todo en uno pX458-DsRed2 generado en nuestro trabajo anterior21 (Figura 1C)utilizando el protocolo general para la clonación de ARNg desarrollado por Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); sin embargo, omita el paso de purificación del gel y purifique el vector digerido utilizando un kit de purificación de PCR (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: En protocolos anteriores, se realizó la purificación en gel del vector digerido por BbsI; sin embargo, este paso lleva mucho tiempo. En el presente protocolo, el producto digerido se purifica utilizando un kit de purificación de PCR y se utiliza directamente para la reacción de ligadura aguas abajo, que generalmente produce colonias positivas con una eficiencia comparable.
    3. Transformar 10 μL del producto de ligadura (paso 1.2.2) en 50 μL de células competentesde Escherichia coli DH5α de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elija al azar tres colonias de una placa de agar LB con ampicilina (100 μg / ml) e inocule cada una en 3 ml de LB medio con ampicilina para cultivar durante la noche.
    4. Utilice 1 ml del cultivo bacteriano nocturno para la secuenciación de Sanger y mantenga el resto a 4 °C hasta que se confirme que la construcción es correcta: pDsR-mR26-sg1 y pDsR-mR26-sg2 para el locus knock-in mRosa26, y pDsR-hR26-sg1 y pDsR-hR26-sg2 para el locus hROSA26.
    5. Preparar una alta concentración de ADN plásmido (aproximadamente 2 μg/μL) con un kit maxiprep para la purificación de plásmidos de grado de transfección (ver Tabla de Materiales).

2. Diseño y construcción de vectores de orientación como plantillas de recombinación homólogas

  1. Diseñar una plantilla de reparación dirigida a homología
    1. Diseñar un vector de orientación para expresar constitutivamente el POI utilizando un casete de expresión optimizado a partir de un estudio previo29,que incluye un promotor híbrido CAG, un sitio de restricción AscI que permite la clonación del ADNc del POI, un reportero IRES-EBFP2 y una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (bGH-polyA)(Figura 1B y Archivo Suplementario).
    2. Diseñar brazos de homología (HA) que compartan homología con las secuencias genómicas del locus mRosa26 o hROSA26. Incluya ~1 kb del HA de 5' correspondiente a la secuencia genómica aguas arriba desde el sitio de inserción deseado a la izquierda del casete de expresión. Del mismo modo, incluya ~ 1 kb del HA de 3' correspondiente a la secuencia genómica aguas abajo desde el sitio de inserción a la derecha del casete de expresión.
      NOTA: El casete de expresión se inserta lo más cerca posible de los sitios de escisión CRISPR/Cas934. Para evitar el recorte del alelo objetivo por CRISPR/Cas9, incorpore cambios de nucleótidos en la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) (5'-NGG-3') en el vector de orientación34,35.
    3. Para permitir la linealización del vector de orientación, inserte un sitio EcoRI único justo aguas arriba del HA de 5' y un sitio BamHI único justo aguas abajo del HA de 3'.
    4. Haga que un proveedor comercial sintetice los vectores de destino y los designe como pKR26-iBFP y pKhR26-iBFP para mRosa26 y hROSA26 knock-in, respectivamente.
  2. Construir un vector de segmentación como una plantilla de reparación dirigida por homología
    1. Para expresar el POI, obtenga la secuencia de ADNc (secuencia codificante) del navegador del genoma de Ensembl y elija la transcripción que posea la secuencia de proteínas más larga. Por ejemplo, el ADNc del gen humano ACE2 es ACE2-202 ENST00000427411.2 y el ADNc del gen RASGRP1 humano es RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Sintetizar el ADNc del POI con la ayuda de un proveedor comercial. También es posible clonar el ADNc mediante amplificación por PCR (no descrito aquí). Coloque la secuencia GGCGCGCCACC (5' - 3'), que incluye un sitio de restricción AscI (cursiva y negrita) y un sitio de inicio de traducción de consenso de Kozak (subrayado), inmediatamente antes del codón de iniciación ATG del CDNA y otro sitio de restricción AscI (5'- GGCGCGCC -3') después del codón de parada del CDNA.
    3. Digiera la secuencia sintetizada con AscI y purifique utilizando un kit de purificación de PCR diseñado para purificar fragmentos de ADN después de la digestión de restricción, siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
    4. Ligar el inserto de ADNc purificado en el vector de columna vertebral linealizado AscI pKR26-iBFP o pKhR26-iBFP utilizando la ligasa de ADN T4 siguiendo las instrucciones del fabricante.
    5. Verifique el vector de orientación final, pKR26-POI-iBFP o pKhR26-POI-iBFP, mediante secuenciación. Utilice maxiprep para purificar las construcciones verificadas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    6. Digiera el vector de destino utilizando EcoRI o BamHI y purifique el producto de digestión utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacene el vector de orientación linealizado (~0,8 μg/μL) a -20 °C hasta la electroporación.

3. Electroporación de macrófagos y líneas celulares T

  1. Preparar cultivos celulares para electroporación
    1. Prepare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% como medio de crecimiento completo para las células T de Jurkat. Prepare el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con 10% de FBS para el cultivo de macrófagos RAW264.7. Suplementar todos los medios de crecimiento completos con 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep) excepto los medios utilizados para la incubación posterior a la transfección antes de la clasificación celular.
    2. Realizar subcultivo de celdas T RAW264.7 y Jurkat de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Ver Tabla de Materiales). Al subcultivar células RAW264.7, use solución de tripsina-EDTA (0.25%) para separar las células. Utilice FBS suplementado con DMSO al 10% (v/v) como medio de criopreservación para células RAW264.7 y Jurkat.
    3. Recolectar células a 250 × g durante 5 min para macrófagos RAW264.7 y 90 × g durante 8 min para células T Jurkat. Luego lavar con 5-10 mL de 1× DPBS (sin iones Ca2+ o Mg2+). Quite el DPBS.
    4. Resuspend el pellet celular usando 2 mL de 1× DPBS. Utilice 10 μL de células y mezcle con un volumen igual de azul de tripano al 0,2% para estimar el recuento de células y la viabilidad.
      NOTA: Asegúrese de que el cultivo celular tenga >90% de viabilidad el día de la transfección.
    5. Para un solo experimento de knock-in, realice la electroporación con puntas de nucleofyección de 10 μL con cinco repeticiones. Calcule el volumen necesario para 2.0 × 106 celdas y glet las celdas por centrifugación. Lave de nuevo el pellet celular con 1× DPBS como se describe en el paso 3.1.3.
      NOTA: Cuando se utilizan puntas de nucleofección de 10 μL, se necesitan 4,0 ×10 5 celdas por electroporación. En consecuencia, prepare al menos 2.0 × 106 células para un experimento de knock-in.
    6. Preparar una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de medio de crecimiento completo (preparado en la etapa 3.1.1) por pozo sin pluma/estreptococo y precalentarlo en una incubadora de 37 °C.
  2. Electroporación de componentes CRISPR/Cas9 y el vector de orientación
    1. Encienda el sistema de electroporación. Utilizar parámetros de electroporación optimizados en un estudio previo21:1.400 V/20 ms/2 pulsos para macrófagos RAW264.7 y 1350 V/20 ms/2 pulsos para células T Jurkat.
    2. Teniendo en cuenta la pérdida de muestra debido al pipeteo, prepare una mezcla de electroporación de 55 μL en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml que contenga 2,5 μg de cada vector CRISPR/Cas9, 2,4 μg del vector de orientación linealizado y el tampón de resuspensión R.
      NOTA: Para ahorrar tiempo, la mezcla de electroporación se puede preparar durante la centrifugación (paso 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 celdas (preparado en el paso 3.1.5) en la mezcla de electroporación de 55 μL del paso 3.2.2.
    4. Aspire la mezcla celda/electroporación a partir del paso 3.2.3 utilizando una punta de nucleofyección de 10 μL con una pipeta.
      NOTA: Durante el pipeteo, evite introducir burbujas de aire, que pueden causar fallas de electroporación.
    5. Agregue la muestra a un tubo lleno de 3 ml de Buffer E del kit de electroporación.
    6. Aplique los parámetros de electroporación para los dos tipos de celdas como se describe en el paso 3.2.1.
    7. Transfiera la muestra a un podo de la placa de 24 pomos con medio precalentado del paso 3.1.6.
    8. Repita los pasos 3.2.4-3.2.7 para las otras cuatro repeticiones, así como para los controles de vector de destino solo y vector de expresión CRISPR.
      NOTA: Cambie la punta y el tubo de nucleofection cuando cambie a un tipo de célula/ADN plásmido diferente.
    9. Culta las células transfectadas durante 48-72 h para permitir la recuperación después de la electroporación y la expresión de los componentes CRISPR / Cas9 antes del análisis de citometría de flujo o la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Examinar la expresión de DsRed2 utilizando un microscopio fluorescente equipado con un canal rojo a las 24 horas después de la transfección.
      NOTA: Un beneficio del monitoreo de células fluorescentes DsRed2 es que se puede estimar la eficiencia de la electroporación y predecir la idoneidad para una mayor clasificación de celdas.

4. Clasificación celular para aislar las células putativas

  1. Antes de la clasificación FACS, lave las células transfectadas una vez con el medio de crecimiento completo. Células de pellets por centrifugación como se describe en el paso 3.1.3 y resuspend el pellet en 500 μL de medio fresco.
  2. Configure el clasificador de celdas (ubicado en un gabinete de bioseguridad) con una boquilla de 85 μm y un bajo caudal. Seleccione el modo de "celda única" para clasificar y pruebe la eficiencia y precisión de la clasificación de celda única clasificando 20-30 celdas en la cubierta de la microplaca de 96 pozos. Una gota localizada en el centro de cada pozo indica la configuración adecuada del instrumento.
  3. Transfiera la suspensión celular del paso 4.1 a tubos FACS estériles y agregue SYTOX Red Dead Cell Stain a una concentración final de 1 nM.
  4. Analice muestras en el clasificador de celdas. SYTOX Red y EBFP2 son excitados por un láser de 405 nm y detectados por los canales V450/BV421 y APC, respectivamente. DsRed2 es excitado por un láser de 488 nm y detectado por el canal PE. Utilice células no transfectadas y células positivas individuales EBFP2 y DsRed2 como controles para la compensación espectral.
  5. Clasificar 10 células individuales en cada pozo de una microplaca de 96 pozos que contenga 150 μL por pozo de medio de crecimiento completo precalentado. Utilice microplacas de fondo redondo para cultivar líneas celulares de suspensión como las células T de Jurkat y microplacas de fondo plano para macrófagos RAW264.7 adherentes.
    NOTA: La clasificación de 10 células por pozo es una estrategia optimizada para mejorar la supervivencia celular y minimizar el número de microplacas de 96 pozos que deben sembrarse y el número de muestras que deben examinarse mediante citometría de flujo y genotipado; si se clasifica solo una célula por pozo, se requiere la siembra de más microplacas para aumentar las posibilidades de obtener células correctamente editadas.

5. Detección y validación de células en cadena positivas

  1. Detección de células knock-in candidatas por citometría de flujo
    1. Incubar las células desde el paso 4.5 durante 10-15 días y agregar un medio de crecimiento completo cada 3 días para reemplazar el líquido perdido por evaporación. Para las células T de Jurkat, transfiera las células cultivadas en la placa inferior redonda de 96 pozos a una placa de fondo plano para optimizar la proliferación celular.
    2. Transfiera las células clasificadas expandidas a placas de 48 pozos para una mayor expansión.
    3. Cuando las células están cerca de la confluencia, utilice la mitad del cultivo para detectar la expresión de EBFP2 mediante citometría de flujo(Figura 3). Normalmente, la mitad del cultivo en una placa de 48 pozos después del crecimiento confluente equivale a 0.5-1.0 × 105 células, lo cual es adecuado para el análisis de una muestra por citometría de flujo.
    4. Transfiera las células restantes a placas de 24 pozos para una mayor proliferación.
    5. Mantenga las poblaciones de células candidatas que poseen un alto porcentaje de células EBFP2 positivas para experimentos de genotipado adicionales.
      NOTA: Debido a que 10 células se clasifican en cada pozo de la microplaca de 96 pozos, es posible que las células knock-in crezcan con células que no expresan el gen knock-in. Por lo tanto, es normal realizar una ronda adicional de clasificación celular para separar las células EBFP2 positivas de las células negativas.
  2. Detección de células candidatas mediante PCR y secuenciación
    1. Recolectar 2 × 105 células candidatas. Extraer el ADN genómico utilizando un kit de preparación de ADN (Ver Tabla de Materiales).
    2. Para verificar que se ha producido una reparación precisa dirigida por homología (HDR) en el locus mRosa26 en lugar de en sitios aleatorios en el genoma de las células knock-in candidatas, realice PCR con cebadores que abarquen cada lado de los HA(Figura 4). Elija un cebador ubicado en la región genómica fuera del vector objetivo (oligo externo) y otro cebador ubicado dentro del vector objetivo (oligo interno).
      NOTA: Se utiliza un diseño similar para verificar HDR en el locus hROSA26. Los cebadores de PCR también se pueden diseñar fácilmente para detectar la inserción de la secuencia POI. Además, los genotipos de alelo de tipo salvaje y knock-in se pueden detectar simultáneamente mediante PCR de tres cebadores (Ver Archivo Complementario, Figura S2).
    3. Clonar los productos de PCR positivos utilizando un kit de clonación rápida (ver Tabla de Materiales). Transformar la mezcla de reacción en células competentes con DH5α.
    4. Elija aleatoriamente de 8 a 10 colonias bacterianas individuales por transformación y secuencia los productos de PCR del paso 5.2.3 mediante secuenciación de Sanger.
  3. Validación de células knock-in positivas mediante análisis de inmunoblot y purificación de afinidad
    NOTA: Las células candidatas se someten a análisis de inmunoblot para la validación de la inserción del POI, o purificación de afinidad (AP) para estudios de interacción proteína-proteína.
    1. Realice análisis de inmunoblot de acuerdo con las instrucciones del fabricante de anticuerpos. Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el uso de anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios.
    2. Someta los lisados de las células de knock-in que expresan el POI marcado con OST a AP utilizando perlas de Strep-Tactin Sepharose siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
    3. Detectar quimioluminescencia mediante un imager.

Resultados

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Siguiendo el protocolo descrito anteriormente para realizar experimentos knock-in en el locus mRosa26 utilizando macrófagos murinos RAW264.7, diseñamos un vector dirigido para expresar ACE2 humano, un receptor para el virus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando un diseño similar, generamos células T Jurkat humanas con la entrada de la proteína de fusión RASGRP1 marcada con OST(Figura 2C). Después de la transfección de tres plásmidos, dos de los cuales se utilizaron para la expresión de CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 y pDsR-mR26-sg2 para mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 y pDsR-hR26-sg2 para el knock-in hROSA26) y otro utilizado como plantilla de ADN para la recombinación homóloga (EBFP2), las células positivas dobles que expresan dos reporteros fluorescentes se clasificaron en una placa de 96 pozos. De las celdas RAW264.7 clasificadas usando el modo de clasificación de una sola celda, el 0.91% fueron DsRed2+ EBFP2+, pero 10 celdas se recolectaron en cada pozo(Figura 2B). Las células T de Jurkat tuvieron una mayor eficiencia de transfección, y el porcentaje de células doblemente positivas fue del 7,91% en este experimento representativo, demostrando un knock-in exitoso de la proteína de fusión OST-RASGRP1(Figura 2D).

En el siguiente paso, se utilizó la citometría de flujo para detectar los pozos candidatos con células EBFP2 positivas. Los histogramas representativos mostraron que había poblaciones obvias EBFP2 positivas (Figura 3). Es notable que las células knock-in no expresaron DsRed2 cuando se realizó la citometría de flujo dos semanas después de la clasificación celular.

Para la discriminación de knock-ins precisas e inserciones aleatorias, el ADN genómico de las células EBFP2 positivas se probó aún más mediante la realización de PCR con cebadores que reconocen la secuencia genómica externa a los HA del vector objetivo y la región específica dentro del casete de expresión(Figura 4A y 4B). El análisis de secuencia de estos productos de PCR confirmó la aparición de HDR en el sitio objetivo de mRosa26 (Figura 4C). Se puede aplicar la misma estrategia de genotipado para validar la inserción precisa del casete de expresión en el locushROSA26 de las células T de Jurkat.

Para obtener una población pura de células RAW264.7 que expresan hACE2, clasificamos aún más las células y validamos la presencia de los reporteros fluorescentes después de la expansión utilizando células de tipo salvaje como controles(Figura 5A). Las células expandidas fueron EBFP2 positivas, y la proteína hACE2 fue fácilmente detectable en macrófagos murinos RAW264.7(Figura 5B y 5C). Del mismo modo, validamos la expresión de reporteros fluorescentes y la proteína OST-RASGRP1 en células T Jurkat humanas después del cribado y una segunda ronda de clasificación celular(Figura 6A y 6B). Además, la purificación por afinidad de la proteína OST-RASGRP1 se realizó utilizando perlas disponibles comercialmente. Encontramos una mayor cantidad de proteína RASGRP1 en los lisados celulares totales de las células de Jurkat knock-in que en las de las células de tipo salvaje; Se utilizaron células Jurkat knockout RASGRP1 como controles(Figura 6C). Después de la purificación utilizando la etiqueta OST, solo las muestras de knock-in tenían RASGRP1 detectable(Figura 6D).

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Figura 1. Estrategia de orientación génica para generar líneascelulares knock-inmRosa26 / hROSA26 que sobreexpresan una proteína de interés. (A) Las secuencias de ORIENTACIÓN de ARN guía específicas de mRosa26y los motivos adyacentes del protoespaciador (PAM) en el sitio de inserción deseado se indican en letras azules y rojas, respectivamente. Cas9 normalmente escinde 3-4 pb aguas arriba de la secuencia PAM, que se indica con flechas verdes. El vector de orientación se utiliza como plantilla para la reparación dirigida por homología (HDR) que conduce a la inserción precisa del casete de expresión en el genoma del ratón o humano. Cada una de las secuencias de 1 kb aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo deseado se utiliza como brazos de homología (HA) de 5' y 3' en el vector de orientación. Los HA están separados por un casete de expresión que consiste en un promotor CAG, la secuencia de ADNc de la proteína de interés (POI) con una etiqueta OST, un reportero IRES-EBFP2 y una señal bGH-polyA (pA). El sitio de restricción AscI se utiliza para la clonación del POI, y EcoRI y BamHI se utilizan para la linealización del vector de destino. La estrategia para el knock-in mediado por CRISPR/Cas9 en el locus hROSA26 es similar. (B) Diagrama del locus humano ROSA26. Las secuencias de segmentación hR26-sg1 y hR26-sg2 se indican en letras azules y las secuencias PAM correspondientes en rojo. (C) Esquema para el vector de expresión CRISPR todo en uno pX458-DsRed2, que contiene un casete de expresión de sgRNA impulsado por U6 humano y un casete reportero fluorescente Cas9-T2A-DsRed2. Dos sitios de restricción BbsI permiten la clonación del ARN guía. U6: promotor humano de la ARN polimerasa III U6; sgRNA, un ARN quimérico de guía única; CBh, un promotor híbrido de pollo β-actina; NLS: señal de localización nuclear; T2A, péptido auto-empalmante del virus Thosea asigna 2A; bGH-pA, señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Clasificación de una sola célula de células RAW264.7 y Jurkat transfectadas con vectores CRISPR/Cas9 y vectores de destino para la recombinación homóloga. Vectores dirigidos utilizados para la expresión génica estable en células RAW264.7 (A) y Jurkat (C).  Diagramas citométricos de flujo representativos de macrófagos RAW264.7 de ratón (B) y células T de Jurkat humanas (D) transfectadas con vectores CRISPR/Cas9 que expresan el reportero DsRed2 y el vector objetivo que expresa el reportero EBFP2. Las células que co-expresan DsRed2 y EBFP2 fueron sometidas a clasificación celular y cultivadas para su expansión; los números adyacentes a las áreas delineadas indican el porcentaje de células en cada puerta, y las células no transfectadas se utilizaron como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Cribado de células knock-in mediante la detección de la expresión de EBFP2. Análisis citométrico de flujo de EBFP2+ y DsRed2+ RAW264.7 macrófagos (A) y células T de Jurkat (B) 14 días después de la electroporación. En los histogramas, la intensidad de fluorescencia (FI) de las celdas EBFP2+ o DsRed2+ se muestra en el eje X y el recuento de eventos en cada canal de fluorescencia se muestra en el eje Y. (A) La expresión de EBFP2 y hACE2 fue impulsada por el mismo promotor en el locus Rosa26 en macrófagos murinos RAW264.7. (B) En las células de Jurkat, la expresión de OST-RASGRP1 está vinculada a la expresión de EBFP2 en el locus humano ROSA26. A los 14 días después de la electroporación, el análisis citométrico de flujo reveló casi cero células DsRed2+ entre las células clasificadas. Las células de tipo salvaje (WT) se utilizaron como control negativo, y KI significa células knock-in. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Detección de células candidatas mediante PCR y secuenciación. (A) Estrategia para la generación de células knock-in hACE2. Las posiciones de los cebadores de PCR utilizados para distinguir el HDR preciso y la inserción aleatoria se indican mediante flechas verdes. (B) El genotipado por PCR de cinco células candidatas (#4, #15, #22, #25 y #43) que fueron identificadas mediante cribado de citometría de flujo para la expresión de EBFP2 como se ejemplifica en la Figura 3,mostró que tanto la unión 5' (1472 pb) como la unión 3' (1472 pb) que abarcan los brazos de homología eran correctas. M, escalera de ADN; WT, el control RAW264.7 de tipo salvaje; H2O, control negativo. (C) La secuenciación de Sanger de los productos de PCR de B reveló una incorporación exitosa del casete de expresión de hACE2 en el locus mRosa26 sin mutaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Validación de la incorporación exitosa del cassette de expresión hACE2 en el locus mRosa26 en macrófagos RAW264.7. (A) Se utilizaron macrófagos WT RAW264.7 como control negativo para el análisis citométrico de flujo. (B) Para separar las células EBFP2 positivas de las células negativas, se realizó una ronda adicional de clasificación celular para obtener una población compuesta por casi 100% células EBFP2+ knock-in, designadas como células ki hACE2. También se examinó la expresión de DsRed2 para garantizar que el plásmido CRISPR/Cas9 no estuviera integrado en el genoma de los macrófagos RAW264.7. En los histogramas, la intensidad de fluorescencia (FI) de las celdas EBFP2+ o DsRed2+ se muestra en el eje X y el número de eventos en cada canal de fluorescencia se muestra en el eje Y. (C) Detección de la expresión de hACE2 mediante análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos monoclonales antihumanos ACE2 de conejo. Se observó la expresión de hACE2 en células de múltiples pozos (#4, #15, #22, #25 y #43). Se utilizaron macrófagos WT RAW264.7 como control negativo y GAPDH como control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. Validación de la incorporación exitosa del casete de expresión OST-RASGRP1 en el locus hROSA26 en células T de Jurkat. (A) Las células T WT Jurkat se utilizaron como control negativo para el análisis citométrico de flujo. (B) Las subpoblaciones EBPF2+ de células Jurkat se enriquecieron con rondas adicionales de clasificación celular y se expandieron; estas células fueron designadas como células OST-RASGRP1 KI. Las células knock-in fueron analizadas por citometría de flujo y no guardaron el vector que expresa DsRed2. En los histogramas, la intensidad de fluorescencia (FI) de las celdas EBFP2+ o DsRed2+ se muestra en el eje X y el recuento de eventos en cada canal de fluorescencia se muestra en el eje Y. (C) Detección de la expresión de OST-RASGRP1 en dos células knock-in independientes (#1 y #2) mediante análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos anti-RASGRP1. Las células WT Jurkat y RASGRP1-knockout Jurkat se utilizaron como controles y β-actina como control de carga. (D) Se utilizó la purificación de afinidad mediada por OST para validar la expresión de OST-RASGRP1 utilizando células knockout RASGRP1 como control negativo. Análisis de immunoblot de cantidades iguales de proteínas de lisatos celulares que fueron sometidas a purificación de afinidad en perlas de Strep-Tactin Sepharose (purificación de afinidad) o analizadas directamente (lisatos totales) y sondeadas con anticuerpos RASGRP1 o GAPDH (control de carga). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discusión

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En nuestros experimentos, demostramos cómo realizar la edición en cadena en células inmunes desde el diseño de la construcción hasta la detección y validación de células en cadena utilizando células T Jurkat humanas y macrófagos murinos RAW264.7 como ejemplos. Tanto las líneas celulares de células T como las de macrófagos son resistentes a la transfección36,37; sin embargo, el problema de la baja eficiencia de la entrega de CRISPR / Cas9 se puede superar con la ayuda de reporteros fluorescentes junto con la clasificación celular. Este protocolo es adecuado para experimentos de rescate de genes y experimentos de interacción proteína-proteína, pero no se puede aplicar al estudio de secuencias de ADN reguladoras, como los sitios de unión de factores de transcripción porque el protocolo se desarrolló para la modificación en cadena del locus Rosa26.

Los reporteros fluorescentes duales ayudaron a la edición en cadena CRISPR / Cas9
Aplicamos con éxito un sistema de reportero fluorescente dual para expresar transitoriamente conjuntos independientes de vectores CRISPR/Cas9 en células inmunes, lo que resultó en la eliminación de grandes fragmentos de ADN en estudios previos21. Diseñamos una herramienta de orientación CRISPR / Cas9 utilizando la proteína fluorescente DsRed2 como reportero y una proteína fluorescente adicional espectralmente distinta para rastrear la entrega de la plantilla de ADN para la modificación en cadena. Para hacer factible la modificación del alelo knock-in, utilizamos el reportero de proteínas fluorescentes EBFP2, que no tiene derrame espectral con la RFP (DsRed2 en nuestro caso), para monitorear la transfección del ADN del donante que sirve como plantilla durante la recombinación homóloga. Para optimizar el casete que expresa el POI y el reportero fluorescente, se introdujo una secuencia IRES para obtener proteínas independientes. En nuestro estudio anterior, observamos que los aminoácidos residuales del enlazador P2A o T2A que quedaban después de la escisión post-transcripcional afectaban la localización de proteínas en la superficie celular. La secuencia IRES no deja tales aminoácidos residuales. Como se describió en un estudio anterior, el IRES dio lugar a niveles más altos del reportero fluorescente, tras la expresión de la proteína Cas9 impulsada por el promotor CAG38.

Plásmido TODO EN UNO CRISPR/Cas9
En estudios previos se han descrito diversos formatos y combinaciones del sistema CRISPR/Cas9, como la transfección Cas9 como ARNm o proteína junto con sgRNAs sintetizados químicamente39. Los complejos CRISPR/Cas9 RNP también se han entregado a células de mamíferos; esta estrategia ofrece las ventajas de un inicio más temprano de la actividad de las nucleasas y una vida media más corta; sin embargo, el etiquetado de los RNP es menos rentable en comparación con la construcción de plásmidos todo en uno. En nuestros estudios previos, encontramos que el uso de la clasificación de células individuales para aislar aquellas células raras que expresan CRISPR / Cas9 (DsRed2 positivo) y la proteína knock-in (EBFP2 positivo) es mucho menos complicado que el uso de la entrega de RNP, y es fácil preparar los plásmidos. Es cierto que este protocolo se basa en la clasificación de una sola célula. Pero nuestro protocolo es fácil de realizar y produce modificaciones exitosas con alta reproducibilidad.

Expresión de un POI del locus Rosa26
Hay múltiples informes en la literatura que describen métodos para etiquetar proteínas endógenas con reporteros fluorescentes utilizando CRISPR / Cas9 edición40,41,42. Las ventajas del etiquetado endógeno son que es factible determinar la localización subcelular y realizar un seguimiento in vivo de la proteína endógena. Sin embargo, se pueden encontrar problemas si no es posible diseñar un ARN guía CRIPSR apropiado en el locus endógeno. Aquí desarrollamos un método alternativo de knock-in mediante la incorporación de POI-IRES-EBFP2 en el locus de puerto seguro genómico Rosa26,que supera las limitaciones de encontrar guías adecuadas para posicionar etiquetas endógenas.

Resumimos algunos puntos clave que deben considerarse durante los experimentos para garantizar la reproducibilidad técnica. Primero, el clasificador celular debe tener un láser violeta de 405 nm para la excitación de EBFP2 y un láser azul de 488 nm o, alternativamente, un láser amarillo de 561 nm para la excitación de DsRed2. Con tales configuraciones, EBFP2 y DsRed2 se pueden detectar sin derrame espectral, lo que puede conducir a resultados falsos positivos. En nuestros experimentos, la proporción de células DsRed2+ EBFP2+ doble positivo fue tan baja como 0.9%; por lo tanto, la protección de la población adecuada fue esencial para el éxito de los experimentos. Se realizó una segunda ronda de clasificación para gatear las células positivas EBFP2+, seguida de la validación por PCR. Además, para la detección de proteínas knock-in, es preferible introducir una etiqueta de proteína como OST u otro tipo de etiqueta. La eliminación del gen antes de los experimentos de knock-in del locus Rosa26 proporciona una buena oportunidad para evaluar si el anticuerpo tiene una especificidad deseable. Cuando la especificidad del anticuerpo no es suficiente, la detección de la proteína knock-in debe realizarse después del pulldown a través de la etiqueta de proteína. Finalmente, durante el cribado FACS de las células que expresan el alelo knock-in, la intensidad de EBFP2 se puede utilizar para evaluar si dos copias o una copia del alelo knock-in está presente.

Aplicaciones
En este protocolo describimos la modificación knock-in de RASGRP1, una molécula clave implicada en la activación de las células T27. Primero obtuvimos células Jurkat RASGRP1-knockout que se pueden utilizar para estudios de pérdida de función, y generamos células Jurkat adicionales que expresan OST-RASGRP1 en el locus hROSA26. Las células jurkat son la línea celular humana más utilizada para estudiar la biología de las células T43. Debido al éxito de la inmunoterapia en la prevención del agotamiento de las células T en pacientes con cáncer, los inmunólogos y biólogos del cáncer tienen un gran interés en modificar las células de Jurkat para estudios funcionales de moléculas candidatas. También es digno de mención que la línea celular T de Jurkat se usa comúnmente para la disección de las vías de señalización, pero existen limitaciones para usar esta línea celular, ya que las células de Jurkat son pobres productoras de IFN-γ tras la estimulación44. Estudios previos utilizaron tanto la modificación endógena del locus45 como la ingeniería genética en el locus46 de hROSA26 para realizar experimentos en cadena en células Jurkat humanas. Ambas estrategias tienen sus propias ventajas; al modificar el locus endógeno, la proteína se expresa presumiblemente a un nivel "fisiológico". La modificación en cadena en el locus hROSA26 produce resultados predecibles porque se evita el empalme alternativo de ARNm, y la abundancia de la proteína modificada también es fácilmente detectable. Otros puertos seguros genómicos, como el sitio del virus adenoaso asociado 1(AAVS1)y el receptor de quimiocinas (motivo CC) 5(CCR5)47,48 merecen más exploración.

En nuestro estudio anterior, cuando Vav1-OST se expresó a niveles más altos en el locus Rosa26 de ratón en células RAW264.7, que son células macrófagos de uso muy frecuente, pudimos detectar su interacción con moléculas Vav3 poco expresadas debido a los altos niveles de proteína de cebo y la alta eficiencia de la purificación de afinidad OST13. También describimos experimentos knock-in para establecer una línea celular de macrófagos que expresa de manera estable hACE2, un receptor para SARS-CoV-2, en el que se garantiza una expresión abundante. En la base de datos de secuenciación de ARN unicelular, ace2 murino se expresa en macrófagos pulmonares, y el modelo celular genético que expresa hACE2 que desarrollamos podría ser útil para estudios de macrófagos durante la infección por SARS-CoV-2.

Otras consideraciones
Este protocolo está diseñado para identificar células knock-in que expresan un POI con la ayuda de análisis citométricos de flujo de un reportero fluorescente, en nuestro caso el reportero EBFP2. Sin embargo, cuando se dispone de anticuerpos de etiquetado superficial detectables por FACS para una proteína de superficie49,no es necesario utilizar el sistema reportero50. Las líneas celulares de células T y macrófagos, así como los ejemplos de proteínas marcadas con OST utilizadas para estudios de interactomas, se utilizan principalmente para estudios de señalización, y la mayoría de estas moléculas de señalización se localizan en el citosol o núcleos de las células. Por lo tanto, un reportero fluorescente puede ser necesario para la identificación de células knock-in deseables.

Es importante señalar que este protocolo fue desarrollado para líneas celulares, y la aplicación a células inmunes primarias como células T, monocitos/macrófagos no fue validada. Debido a la capacidad limitada de las células para proliferar, no recomendamos este protocolo para su uso con células inmunes primarias. Como el reportero fluorescente EBFP2 se expresó bajo el mismo promotor que el gen knock-in o POI utilizando un elemento IRES, no observamos células que expresaran el reportere fluorescente en ausencia del gen knock-in. Sospechamos que la recuperación de las células fluorescentes que expresan proteínas depende en gran medida del éxito de la recombinación homóloga. Como se informó en un estudio anterior, es tedioso clasificar, expandir e identificar las células knock-in correctas mediante la clasificación de una sola célula cuando la eficiencia de knock-in es muy baja42, lo que también explica por qué necesitábamos clasificar las células a granel para mejorar la tasa de éxito.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la instalación central de citometría de flujo de la Universidad Médica de Xinxiang. El desarrollo de dicha tecnología ha sido apoyado por las subvenciones de NSFC 81601360 a LZ, 81471595 y 32070898 a YL. El trabajo también cuenta con el apoyo del Comité Educativo de la Fundación de Henan No. 21IRTSTHN030.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Amersham Imager 600Ge HealthcareImágenes de quimioluminiscencia
Ampicilina, sal de sodioMP Biomedicals194526
Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRPTecnología de señalización celular7074con dilución 1/5000
Anticuerpo anti-RasGRP1, clon 10.1MerckMABS1461.0 μ g/mL de concentración de trabajo
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actina (D6A8) Tecnologíaseñalización8457con dilución 1/1000
BamHI-HFNueva Inglaterra BioLabsR3136S
BbsI-HFNueva Inglaterra BioLabsR3539S
Celómetro Mini Contador de células automatizadoNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Células competentesTakara9057
DMSO (dimetilsulfóxido)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Kits de tejidosQiagen69506reactivo de cultivo celular
DPBS (10X), sin calcio, sin magnesioThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con alto contenido de glucosaHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipado con cabina
Citómetro de flujo FACS CantoBD Biosciences
Falcon 5 ml poliestireno tubo de ensayo de fondo redondoBD Biosciences352003
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo versión 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP  Tecnologíade señalización celularde conejo 5174con una dilución de 1/1000
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, HRPThermoFisher Scientific31430con una dilución de 1/5000
Immobilon ECL Ultra Western HRP SustratoMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ Membrana de PVDFMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Sulfato de kanamicinaMP Biomedicals194531
polvo de agar LBThermoFisher Scientific22700041
Pipeta multicanal (30-300 μ L)Eppendorf, o similar
Sistema de transfección de neónThermoFisher ScientificMPK5000
Sistema de transfección de neón, 10 μ L kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Tubos de centrífuga estériles cónicosThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Carga rápida de arranque en caliente® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)para plantilla de alto porcentaje de GC
PageRuler Escalera de proteínas preteñida, 10 a 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Punta de pipeta 0.1-20µ lEppendorf, o similar0030 075.005
Punta de pipeta 2-200µ lEppendorf, o similar0030 075.021
Punta de pipeta 50-1000µ lEppendorf, o similar0030 075.064
Kit Maxi de plásmidoQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Kit de purificaciónQiagen28104purificar plásmido de la digestión de restricción
Q5 Arranque en caliente Alta fidelidad 2X Master MixNueva Inglaterra BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Anticuerpo anti-ACE2 recombinante [EPR4435(2)]Abcamab108252en dilución 1/1000
RPMI 1640 MedioHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Perlas de SepharoseIBA Lifesciences2-1201-010
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
SYTOX&comercio; Tinción roja de células muertas, para excitación de 633 o 635 nmThermoFisher ScientificS34859
T4 ADN ligasaNew England BioLabsM0202S
T4 Polinucleótido quinasaEngland BioLabsM0201S
Solución de azul de tripano, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
solución de tripsina-EDTA (0,25 %), con rojo de fenolThermoFisher Scientific25200056
ZOE Generador de imágenes de células fluorescentesBio-Rad
Microtubos de 1,5 mL, PCR-cleanEppendorf o similar0030 125.215
Placas de pocillos múltiples con tratamiento TC transparente de 24 pocillosCorning3524
Microplacas de poliestireno de fondo plano transparente de 96 pocillos tratadas con TCCorning3599
Microplaca de 96 pocillos con tratamiento TC de fondo redondo transparenteCorning3799
de celular mAb de conejo de bioseguridad mAb New

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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