El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.
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Artículo de método
Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional
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Resumen
Resumen
La metástasis es una de las principales causas de muerte por cáncer. A pesar de las mejoras en las estrategias de tratamiento, el cáncer metastásico tiene un mal pronóstico. Por lo tanto, nos enfrentamos a una necesidad urgente de comprender los mecanismos detrás del desarrollo de la metástasis y, por lo tanto, de proponer tratamientos eficientes para el cáncer avanzado. Los cánceres metastásicos son difíciles de tratar, ya que las biopsias son invasivas e inaccesibles. Recientemente, ha habido un interés considerable en las biopsias líquidas que incluyen tanto el ácido desoxirribonucleico circulante (ADN) libre de células como las células tumorales circulantes de sangre periférica y hemos establecido varias líneas celulares tumorales circulantes de pacientes con cáncer colorrectal metastásico para participar en su caracterización. De hecho, para caracterizar funcionalmente estas células raras y mal descritas, el paso crucial es expandirlas. Una vez establecidas, las líneas de células tumorales circulantes (CTC) se pueden cultivar en condiciones de suspensión o adherentes. A nivel molecular, las líneas CTC se pueden utilizar para evaluar la expresión de marcadores específicos de interés (como la diferenciación, las células madre epiteliales o cancerosas) mediante análisis de inmunofluorescencia o citometría. Además, las líneas ctC se pueden usar para evaluar la sensibilidad a los medicamentos a las quimioterapias estándar de oro, así como a las terapias dirigidas. La capacidad de las líneas ctc para iniciar tumores también se puede probar mediante inyección subcutánea de CTC en ratones inmunodeficientes.
Finalmente, es posible probar el papel de genes específicos de interés que podrían estar involucrados en la diseminación del cáncer mediante la edición de genes CTC, mediante ácido ribonucleico de horquilla corta (shRNA) o Crispr / Cas9. Por lo tanto, los CTC modificados se pueden inyectar en bazos de ratón inmunodeficientes, para imitar experimentalmente parte del proceso de desarrollo metastásico in vivo.
En conclusión, las líneas CTC son una herramienta valiosa para futuras investigaciones y para la medicina personalizada, donde permitirán predecir la eficiencia del tratamiento utilizando las mismas células que originalmente son responsables de la metástasis.
Introducción
A pesar de las recientes mejoras en el diagnóstico precoz del cáncer y en la estrategia terapéutica, más del noventa por ciento de la morbilidad por cáncer todavía se debe a la metástasis1. El proceso metastásico es una cascada de varios pasos que comienza con el desprendimiento local de las células del tumor primario y su entrada en el torrente sanguíneo donde se convierten en células tumorales circulantes (CTC) para finalmente colonizar sitios distantes como el hígado y los pulmones, en el caso del cáncer colorrectal (CCR)2. Recientemente, ha habido una creciente atención a las biopsias líquidas, que son una herramient....
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Protocolo
Todos los protocolos in vivo fueron aprobados por las agencias de ética animal.
1. Amplificación CTC en condiciones de cultivo 3D
- Para cultivar CTCs en suspensión, primeros CTC de semilla en pocillos de una placa ultra-Low Attachment (ULA) de 24 pocillos a la concentración máxima de 5 células/μL y en 1 mL de medio M12 (es decir, DMEM-F12 avanzado suplementado con 2 mM l-glutamina, 100 Unit/mL de penicilina y estreptomicina, suplemento de N2, factor de crecimiento epidérmico de 20 ng/mL y factor de crecimiento de fibroblastos de 10 ng/mL10).
- Para permitir la formación de esferas y ....
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Resultados
Tanto las expresiones EpCAM como CD26 observadas por IF (Panel derechode laFigura 1A) y FACS(Figura 1B)respectivamente, indican que la línea CTC es epitelial y muestran una de las características de CSC10. Este rasgo epitelial se puede caracterizar aún más por la tinción con anticuerpos dirigidos contra otros marcadores epiteliales y mesenquimales. De este modo, podría ser posible saber aproximadamente dónde está la línea.......
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Discusión
El protocolo descrito anteriormente se utilizó inicialmente para la caracterización funcional de ctC colorrectal, pero se puede usar para otros tipos de cáncer como el cáncer de mama y se puede adaptar para modelos de ratón.
El factor limitante real es el número de CTC presentes en la muestra de sangre y la eficiencia de la técnica utilizada para aislarlos y expandirlos. Se han descrito varias técnicas de aislamiento ctc basadas en propiedades específicas de CTC como el Parsortix, un dispositi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto de investigación en el laboratorio Pannequin fue apoyado por una beca de investigación del SIRIC: Beca « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Las tesis doctorales de Guillaume Belthier y Zeinab Homayed fueron apoyadas por la liga anticancerígena/Ligue contre le Cancer. El salario de Céline Bouclier fue financiado por la "región Occitania". Gracias a Julian Venables por la edición en inglés.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad de células luminiscentes | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal | Corning | 354230 | |
| Costar 24 pocillos Claro Fondo plano Fijación ultrabaja múltiple Placas de Pozo,Corning | 3473 | ||
| Histiogel Espécimen Medio | LabStorage | HG-4000 | |
| EGF Humano, grado premium | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| FGF-2 humano, grado premium | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Suplemento | Gibco | ||
| Penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Referencias
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al.
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Reimpresiones y permisos
