Este protocolo describe la metodología para el seguimiento no invasivo de células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos in vivo con una plataforma clínicamente disponible.
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Artículo de método
Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígeno quimérico (CAR) han mostrado resultados sin precedentes en ensayos clínicos fundamentales para pacientes con neoplasias malignas de células B o mieloma múltiple (MM). Sin embargo, numerosos obstáculos limitan la eficacia y prohíben el uso generalizado de terapias de células T con CAR debido al tráfico deficiente y la infiltración en los sitios tumorales, así como la falta de persistencia in vivo. Además, las toxicidades potencialmente mortales, como el síndrome de liberación de citoquinas o la neurotoxicidad, son las principales preocupaciones. La obtención de imágenes y el seguimiento eficientes y sensibles de las células T con CAR permiten la evaluación del tráfico, la expansión y la caracterización in vivo de las células T con T y permiten el desarrollo de estrategias para superar las limitaciones actuales de la terapia con células T con CAR. Este artículo describe la metodología para incorporar el simportador de yoduro de sodio (NIS) en células T CAR y para imágenes de células T CAR utilizando tomografía por emisión de tetrafluoroborato-positrón [18F] ([18F]TFB-PET) en modelos preclínicos. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones CAR y genes diana además de los utilizados para este estudio.
Introducción
La terapia con células T (CAR T) receptoras de antígeno quimérico es un abordaje rápidamente emergente y potencialmente curativo en neoplasias hematológicas malignas1,2,3,4,5,6. Se informaron resultados clínicos extraordinarios después de la terapia con células T CAR T (CART19) dirigida por CD19 o antígeno de maduración de células B (BCMA)CAR2. Esto llevó a la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) a la aprobación de ....
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Protocolo
El protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic, el Comité Institucional de Bioseguridad y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.
1. Producción de células T NIS+ BCMA-CAR
NOTA: Este protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic (IRB 17-008762) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC Bios00000006.04).
- Producción de lentivirus que codifican BCMA-CAR, NIS y proteína fluorescente verde luciferasa (GFP).
NOTA: Un constructo BCMA-CAR de segunda generación fue sintetizado de novo (ve....
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Resultados
La Figura 1 representa los pasos para generar células T NIS+BCMA-CAR. El día 0, aísle los PBMC y luego aísle las células T por selección negativa. Luego, estimule las células T con perlas anti-CD3 / CD28. El día 1, transduzca células T con lentivirus NIS y BCMA-CAR. En los días 3, 4 y 5, cuente las células T y alimente con medios para ajustar la concentración a 1.0 × 106 / ml. Para las células T transducidas por NIS, agregue 1 μg/ml de puromicina para seleccionar las cé.......
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Discusión
Este artículo describe una metodología para incorporar NIS en células T CAR e imágenes de células T CAR infundidas in vivo a través de [18F]TFB-PET. Como prueba de concepto, las células T NIS+BCMA-CAR se generaron a través de la transducción dual. Recientemente hemos informado que la incorporación de NIS en las células T CAR no perjudica las funciones y la eficacia in vivo de las células T CAR y permite el tráfico y la expansión de las células T CAR30. A med.......
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Divulgaciones
SSK es un inventor de patentes en inmunoterapia car con licencia para Novartis (a través de un acuerdo entre Mayo Clinic, la Universidad de Pensilvania y Novartis) y Mettaforge (a través de Mayo Clinic). RS, MJC y SSK son inventores de patentes en el campo de la inmunoterapia CAR que están autorizadas a Humanigen. SSK recibe fondos de investigación de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs y Lentigen. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte a través de la canalización K2R (SSK) de Mayo Clinic, el Centro de Medicina Individualizada (SSK) de Mayo Clinic y la Fundación Predolin (RS). Las figuras 1, 2 y 4 se crearon con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja de calibre 22 | Covidien | 8881250206 | |
| jeringa de insulina de calibre 28 | BD | 329461 | |
| placa de 96 pocillos | Corning | 3595 | |
| Anti-humano (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | El anticuerpo ETNL se une al C-terminal citosólico del NIS |
| Anti-humano BCMA, clon 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Anticuerpo Flow |
| Anti-humano CD45, clon HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Anticuerpo |
| Flow Anti-ratón CD45, clon 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Anticuerpo Flow |
| Anti-conejo IgG R | & D | F0110 | Anticuerpo secundario para la construcción BCMA-CAR con tinción de NIS, |
| IDT de segunda generación | , Coralville, IA | ||
| BD Kit de solución de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| CD3 Anticuerpo monoclonal (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Sistema CytoFLEX B5-R3-V5 | Citómetro de flujo | Beckman Coulter | C04652 |
| Sulfóxido de dimetilo | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Jeringas Desechables con Puntas Luer-Lok | BD | 309646 | |
| D-Luciferina, Sal de Potasio | Oro Biotecnología | LUCK-1G | |
| D-PBS (Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) | Gibco | 14190-144 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (concentrador de partículas magnéticas) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Imán | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit de aislamiento de células T | humanas STEMCELL Technologies | 17951 | perlas magnéticas de selección negativa; 17951RF incluye puntas y tampón |
| Suero fetal bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| Cabra anti-ratón IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon Escáner PET/CT de modalidad múltiple | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| Isoflurano líquido | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
| IVIS Lumina S5 Sistema de imagen | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS® Sistema de imágenes Spectrum In Vivo | PerkinElmer | ||
| Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua fijable, para excitación de 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Nalgene Filtro de vacío de flujo rápido de 500 ml, 0,22 uM, estéril | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| Filtro de vacío Nalgene Rapid-Flow de 500 mL, 0,45 uM, estéril | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Laboratorio de Jackson | : 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | , CRL-3273 | línea celular de mieloma múltiple |
| pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | vector lentiviral que codifica luciferasa-GFP |
| , penicilina-estreptomicina-glutamina (100x), | líquido Gibco | 10378-016 | |
| software PMOD, | PMOD | PBAS y P3D | |
| Investigación innovadora derivada del plasma del suero humano AB agrupado | IPLA-SERAB-H-100ML | ||
| diclorhidrato de puromicina | MP Biomedicals, Inc. | ||
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Separador de células totalmente automatizado |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | tubos de separación en gradiente de densidad |
| Azida de sodio, 5% (c/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| Matraz T175 | Corning | 353112 | |
| Terrell (isoflurano, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero | Lonza | 04-418Q |
Referencias
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al.
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Reimpresiones y permisos
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