Summary
В этой статье описывается подробный протокол использования датчиков натяжения на основе ДНК для визуализации рецепторных сил, приложенных иммунными клетками. Этот подход может отображать рецепторные силы >4,7 пН в режиме реального времени и может интегрировать силы с течением времени.
Abstract
Механические силы, передаваемые на стыке между двумя соседними клетками и на стыке между клетками и внеклеточным матриксом, имеют решающее значение для регуляции многих процессов, начиная от развития и заканчивая иммунологией. Поэтому разработка инструментов для изучения этих сил на молекулярном уровне имеет решающее значение. Наша группа разработала набор датчиков молекулярного натяжения для количественной оценки и визуализации сил, генерируемых клетками и передаваемых конкретным лигандам. Наиболее чувствительный класс датчиков молекулярного натяжения состоит из шпилек со стволовыми петлями нуклеиновых кислот. Эти датчики используют пары флуорофор-гаситель, чтобы сообщать о механическом расширении и разворачивании шпилек ДНК под действием силы. Одна из проблем, связанных с датчиками натяжения шпилек ДНК, заключается в том, что они обратимы с быстрым складыванием шпильки после прекращения натяжения, и, таким образом, переходные силы трудно зарегистрировать. В этой статье мы описываем протоколы подготовки датчиков натяжения ДНК, которые можно «заблокировать» и предотвратить повторное складывание, чтобы обеспечить «хранение» механической информации. Это позволяет регистрировать высокопереходные пиконетонные силы, которые впоследствии могут быть «стерты» добавлением комплементарных нуклеиновых кислот, снимающих блокировку. Эта способность переключаться между картированием напряжения в реальном времени и механическим хранением информации выявляет слабые, кратковременные и менее обильные силы, которые обычно используются Т-клетками как часть их иммунных функций.
Introduction
Иммунные клетки защищаются от патогенов и раковых клеток, непрерывно ползая и сканируя поверхности клеток-мишеней на наличие антигенов, усеивая их поверхность 1,2. Распознавание антигена инициируется при связывании между Т-клеточным рецептором (TCR) и комплексом пептидно-главной гистосовместимости MHC (pMHC), экспрессируемым на поверхности клеток-мишеней. Поскольку распознавание TCR-pMHC происходит на стыке между двумя подвижными клетками, долгое время подозревалось, что он испытывает механические силы. Более того, это привело к механосенсорной модели активации TCR, которая предполагает, что силы TCR способствуют его функции 3,4. Чтобы понять, когда, где и как механические силы способствуют функционированию Т-клеток, необходимо разработать инструменты для визуализации молекулярных сил, передаваемых Т-клетками. Традиционно для исследования клеточных сил5,6 используются такие методы, как тракционно-силовая микроскопия (TFM) и микропиллярные матрицы. Однако силовая чувствительность TFM и микростолбовых матриц находится в масштабе наноньютона (nN) и, таким образом, часто недостаточна для изучения молекулярных пиконьютонных (pN) сил, передаваемых клеточными рецепторами7. Чтобы улучшить силу и пространственное разрешение для обнаружения, наша лаборатория впервые разработала зонды молекулярного натяжения, которые первоначально были синтезированы с использованием полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ)7. Зонды молекулярного натяжения состоят из выдвижной молекулярной «пружины» (ПЭГ, белок, ДНК), окруженной флуорофором и гасителем, и закреплены на поверхности. Силы, приложенные к концу зонда, приводят к его расширению, разделяя флуорофор и гаситель, и, таким образом, генерируя сильный сигнал флуоресценции (рис. 1А)8,9,10.
За последнее десятилетие мы разработали библиотеку различных классов зондов молекулярного натяжения с пружинными элементами, изготовленными из нуклеиновых кислот11, белков10 и полимеров8. Среди них датчики натяжения на основе ДНК обеспечивают самое высокое соотношение сигнал/шум и наибольшую чувствительность к силе, которая легко настраивается от нескольких пН до ~20 пН11. Мы использовали эти зонды натяжения ДНК в реальном времени для изучения молекулярных сил, генерируемых многими различными типами клеток, включая фибробласты, раковые клетки, тромбоциты и иммунные клетки11,12,13. В этой рукописи будут описаны протоколы синтеза и сборки зондов натяжения ДНК на поверхности для картирования молекулярных рецепторных сил с разрешением силы pN с использованием обычного флуоресцентного микроскопа. В то время как текущая процедура включает химические модификации нуклеиновой кислоты для введения флуоресцентного репортера (рис. 1B), важно отметить, что многие этапы модификации и очистки могут быть переданы на аутсорсинг компаниям, занимающимся синтезом ДНК. Таким образом, технология зондов натяжения ДНК проста и доступна для более широких сообществ клеточной биологии и механобиологии.
Вкратце, для сборки датчиков натяжения ДНК шпилька ДНК гибридизуется с флуоресцентной цепью лиганда на одном плече и якорной нитью гасителя на другом плече, а затем иммобилизуется на стеклянной подложке (рис. 1C, натяжение в реальном времени). При отсутствии механической силы шпилька закрывается, и таким образом флуоресценция гасится. Однако, когда приложенная механическая сила больше, чем F1/2 (сила в равновесии, которая приводит к 50% вероятности разворачивания), шпилька механически плавится, и генерируется флуоресцентный сигнал.
Основываясь на датчике натяжения ДНК в реальном времени, мы также описываем протоколы для отображения накопленных сил, что особенно полезно для изучения взаимодействия между рецепторами на иммунных клетках и их естественным лигандом. Это связано с тем, что иммунные рецепторы часто демонстрируют короткоживущие связи 3,14. Накопленные силы визуализируются с помощью «запирающей» цепи, которая преимущественно связывается с открытыми шпильками ДНК и позволяет хранить флуоресцентные сигналы, связанные с механическими событиями вытягивания (рис. 1C, заблокированное натяжение). Фиксирующая прядь предназначена для связывания загадочного места связывания, который подвергается воздействию при механически индуцированном плавлении шпильки, и блокировки шпильки в открытом состоянии путем блокировки повторного складывания шпильки, тем самым сохраняя сигнал натяжения и генерируя накопленную карту натяжения. Кроме того, блокирующая цепь имеет восьминуклеотидную опору, которая обеспечивает реакцию смещения цепи, опосредованную опорой на носок, с ее полным дополнением, «разблокирующей» нитью. С добавлением отпирающей пряди связанная фиксирующая прядь снимается с конструкции шпильки, стирая сохраненный сигнал натяжения и сбрасывая шпильку обратно в состояние реального времени.
Рисунок 1: Схема современных датчиков молекулярного натяжения. (A) Общая конструкция датчика молекулярного натяжения в реальном времени, (B) Нити для конструкции датчика натяжения на основе ДНК и (C) спроектированные датчики натяжения на основе ДНК и их переключение между состоянием реального времени и заблокированным состоянием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Основной протокол состоит из четырех основных разделов - подготовка олигонуклеотидов, подготовка поверхности, визуализация и анализ данных. Этот протокол был успешно продемонстрирован нашей лабораторией и другими в наивных и активированных OT-1 CD8+ Т-клетках, OT-II CD4+ клетках, а также гибридомах и может применяться для опроса различных рецепторов иммунных клеток, включая рецептор Т-клеток, рецептор запрограммированной клеточной смерти (PD1) и силы антигена 1, связанного с функцией лимфоцитов (LFA-1). OT-1 CD8+ наивные Т-клетки используются в качестве примера клеточной линии в этой статье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Трансгенные мыши OT-1 размещены в Отделе ресурсов животных в Университете Эмори. Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Олигонуклеотидный препарат
- Растворите ДНК цепи лиганда в воде (удельное сопротивление 18,2 МОм, используемое во всем протоколе). Закрутите и раскрутите раствор с помощью настольной центрифуги. Отрегулируйте объем воды таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ. Проверьте концентрацию с помощью нанокапельного спектрофотометра для измерения поглощения на длине волны 260 нм и определения конечной концентрации на основе коэффициента экстинкции олигонуклеотида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цепь лиганда имеет модификацию на каждом конце, 5'-амин и 3'-биотин, для конъюгирования с флуорофором и представления биотинилированного лиганда. Аминогруппа в цепи лиганда должна быть конъюгирована с флуорофором. Краситель Cy3B используется для этого сопряжения из-за его высокой яркости и фотостабильности, но он обычно не предлагается в продаже и требует собственного сопряжения. Соответственно, в следующем разделе описывается конъюгация между аминами и эфирными красителями NHS. Для конечных пользователей, которые не имеют доступа к средствам или ресурсам для модификации нуклеиновых кислот, модифицированные нуклеиновые кислоты можно приобрести у поставщиков услуг по синтезу ДНК, которые предлагают яркие и фотостабильные красители, такие как семейство красителей Alexa и Atto. - Приготовьте 10 растворов PBS и 1 M NaHCO3 . Смешайте 10 мкл 1 мМ раствора цепи аминового лиганда (10 нмоль) с 10 мкл 10x PBS, 10 мкл 1 М NaHCO3 и 60 мкл H2O. Растворите 50 мкг сложного эфира Cy3B NHS в 10 мкл ДМСО непосредственно перед использованием и добавьте в смесь до общего объема реакции 100 мкл. Добавьте сложный эфир Cy3B NHS в последнюю очередь. Дайте вступать в реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 °C в течение ночи.
- Подготовьте фиксирующую цепь Atto647N, конъюгируя цепь блокировки амина с эфиром Atto647N NHS. Приготовьте 10 растворов PBS и 1 M NaHCO3 . Смешайте 10 мкл раствора нити блокировки аминов 1 мМ (10 нмоль) с 10 мкл 10x PBS, 10 мкл 1 М NaHCO3 и 60 мкл H2O. Растворите 50 мкг сложного эфира Atto647N NHS в 10 мкл ДМСО непосредственно перед использованием и добавьте в смесь до общего объема реакции 100 мкл. Добавьте сложный эфир Atto647N NHS в последнюю очередь. Дайте вступать в реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 °C в течение ночи.
- После реакций удаляют побочные продукты, излишки красителя и соли с помощью обессоливающей гель-фильтрации P2. Разбавьте реакционную смесь H2O до общего объема 300 мкл, который подходит для последующей стадии очистки ВЭЖХ. Добавьте 650 мкл гидратированного геля P2 в центробежное устройство и вращайте при 18 000 x g в течение 1 мин. Удалите жидкость в нижней части устройства, добавьте реакционную смесь в колонку, содержащую гель P2, открутите вниз при 18 000 x g в течение 1 мин и соберите реакционную смесь на дне устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гель P2 следует увлажнить не менее чем за 4 ч до использования с H2O. - Очистите обессоленную реакционную смесь с помощью ВЭЖХ с помощью колонки C18, предназначенной для очистки олигонуклеотидов, с растворителем A: 0,1 М TEAA в H2O и B: ACN в качестве подвижной фазы для линейного градиентного элюирования 10-100% B в течение 50 мин при скорости потока 0,5 мл / мин. Впрыскивают обессоленную реакционную смесь в обратную фазу ВЭЖХ с контуром впрыска 500 мкл для очистки. Соберите продукт, который имеет пик поглощения для ДНК (260 нм) и пик поглощения для флуорофора (560 нм для Cy3B и 647 нм для Atto647N), и высушите их в вакуумном центробежном концентраторе в течение ночи (см. рис. 2A).
- Восстановите высушенный олигокраситель в 100 мкл воды. Определите концентрацию цепи лиганда Cy3B и цепи блокировки Atto647N с помощью спектрофотометра nanodrop. Убедитесь, что соотношение маркировки красителя близко к 1:1. При необходимости при определении концентрации олигонуклеотидов скорректируйте поглощение красителя 260 нм.
- Валидируйте очищенный продукт с помощью MALDI-TOF-MS, используя 3-HPA в качестве субстрата в 50% ACN/H2O с 0,1% TFA и 5 мг/мл цитрата аммония, используя 0,5 мкл продукта в концентрации 1-5 мкМ для подготовки образцов MALDI-TOF-MS. Пример масс-спектра можно найти на рисунке 2B.
- Растворите прядь шпильки и анкерную прядь гасителя в воде и убедитесь, что концентрация исходных растворов составляет от 50 до 100 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прядь шпильки не модифицирована и может быть синтезирована непосредственно у поставщика. Анкерная прядь имеет тиоловую анкерную группу и гаситель BHQ2 и может быть синтезирована непосредственно по индивидуальному заказу у поставщика. - Аликвотируйте все олигонуклеотиды. Для краткосрочного использования и хранения храните эти олигонуклеотиды при температуре 4 °C. Для длительного хранения заморозьте и храните при температуре -20 °C. К этому моменту все олигонуклеотиды готовы к сборке зонда натяжения ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания не являются проблемой для олигонуклеотидов.
2. Подготовка поверхности
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка подложек для натяжения шпилек ДНК занимает два дня. Датчик натяжения шпильки ДНК будет функционализирован на стеклянных покровных стеклах.
- День 1
- Поместите 25-миллиметровые покровные стекла на стойку из политетрафторэтилена в стакане объемом 50 мл. Каждая стойка вмещает до 8 покровных листов. Промойте покровные стекла, погрузив их в воду три раза.
- Добавьте 40 мл раствора этанола в соотношении 1:1 (v:v), смешанного с водой, в стакан, содержащий стойку и покровные стекла, и запечатайте стакан парафиновой пленкой.
- Обработайте стакан ультразвуком в течение 15 минут в ультразвуковом очистителе (рабочая частота 35 кГц), чтобы очистить покровные стекла. После обработки ультразвуком слейте жидкость и промойте стакан со стойкой и покровными стеклами в нем водой не менее 6 раз, чтобы удалить оставшийся органический растворитель.
- Приготовьте свежий раствор Пираньи, смешав серную кислоту и перекись водорода в соотношении 3:1. Чтобы приготовить 40 мл раствора пираньи, сначала добавьте 30 мл серной кислоты в чистый стакан объемом 50 мл, а затем медленно добавьте 10 мл H 2 O2. Раствор Piranha быстро нагревается и пузырится при добавлении H 2 O2. Аккуратно перемешайте пиранью с помощью конца стеклянной пипетки.
- Затем перенесите стойку, в которой хранятся покровные стекла, в стакан с аккуратно перемешанным раствором пираньи для травления (рис. 3А). Дайте раствору Piranha гидроксилировать и очистите покровные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре. После травления «Пираньи» перенесите стойку с помощью стального или политетрафторэтиленового пинцета в чистый стакан объемом 50 мл с водой и снова промойте водой не менее 6 раз.
ВНИМАНИЕ: Большое количество органических веществ может бурно реагировать с раствором пираньи и вызывать взрыв. Будьте осторожны и всегда работайте с раствором Piranha в вытяжном шкафу. Обязательно наденьте лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Никогда не храните свежий раствор пираньи в закрытой таре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение перекиси водорода и серной кислоты должно поддерживаться ниже 1:2 (v:v) и никогда не должно превышать 1:1. Погружая стойку с покровными стеклами в раствор Пираньи, медленно и осторожно помещайте их в раствор. Не выбрасывайте раствор сразу после протравливания, так как он еще активен и горячий. Оставьте его в стакане на ночь, прежде чем вылить в контейнер для кислотных отходов. - Погрузите стойку, удерживающую покровные стекла, в стакан объемом 50 мл с 40 мл этанола для удаления воды. Выбросьте этанол и повторите 3 раза, чтобы убедиться, что вода была удалена.
- Затем погрузите стойку в 3% аминопропилтриэтоксисилан (APTES) (v/v) в 40 мл этанола для реакции с -OH на покровных стеклах в течение 1 ч при комнатной температуре (рис. 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол можно заменить ацетоном. - Промойте поверхности 6 раз, погрузив их в 40 мл этанола, затем высушите в духовке при 80 ° C в течение 20 минут. После охлаждения высушенные аминомодифицированные покровные стекла хранят при температуре -20 °C для будущего использования (до 6 месяцев).
- Нижнюю внутреннюю сторону пластиковых чашек Петри диаметром 10 см накройте парафиновой пленкой. Парафиновая пленка предотвращает скольжение покровных стекол внутри чашки Петри и помогает сохранить раствор для следующих этапов функционализации на покровных стеклах. Поместите охлажденные аминомодифицированные покровные стекла в чашки Петри. Сторона, подлежащая функционализации, должна быть обращена вверх.
- Чтобы модифицировать аминные группы на покровных стеклах, добавьте 300 мкл 0,5% липоевой кислоты PEG NHS (LA-PEG-SC) и 2,5% mPEG NHS (mPEG-SC) в 0,1 М NaHCO3 на каждое покровное стекло и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре (рис. 3C). На каждое 25-миллиметровое покровное стекло следует взвесить 1,5 мг LA-PEG-SC и 7,5 мг mPEG-SC. Растворяйте реагенты NHS непосредственно перед добавлением на поверхности, так как они имеют короткий период полураспада (~ 10 мин) в водном растворе при комнатной температуре. После реакции промойте поверхности 3 раза водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакцию NHS можно проводить при 4 ° C в течение ночи. Реагенты NHS имеют более длительный период полураспада перед гидролизом при 4 ° C, что составляет около 4-6 часов. Это приведет к трехдневной процедуре подготовки поверхности. - Добавьте 100 мкл 0,1 М NaHCO3 , содержащего 1 мг/мл сульфо-NHS ацетата, к набору «сэндвич-стекла» (два покровных стекла, обращенных друг к другу, с реакционным буфером между ними). Дайте пассивации произойти в течение не менее 30 минут. Для экономии реагента этот этап может быть выполнен с 50 мкл 1 мг / мл сульфо-ацетата NHS. После пассивации трижды смойте водой.
- Добавьте 0,5 мл наночастиц золота (AuNP, 8,8 нм, дубильная кислота, 0,05 мг/мл) в каждое покровное стекло и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (рис. 3D). Чтобы сохранить реагент, этот шаг можно выполнить, также зажав два покровных стекла. Убедитесь, что в системе нет солей из предыдущих шагов, чтобы избежать агрегации наночастиц золота. Не оставляйте покровные стекла сохнуть после этого шага.
- Между тем, предварительно гибридизируйте шпильку 4,7 pN, цепь лиганда Cy3B и якорную цепь BHQ2, которые образуют зонды натяжения ДНК, конструируются в соотношении 1,1: 1: 1 в 1 M NaCl при 300 нМ в пробирке для ПЦР. Отжигают пряди, нагревая раствор до 95 °C в течение 5 мин, затем постепенно охлаждают, снижая температуру до 20 °C в течение 30 мин в термоциклере.
- Промойте покровные стекла водой три раза после 30 минут инкубации с наночастицами золота. Добавьте дополнительную якорную цепь BHQ2 (из запаса 100 мкМ) в отожженный раствор ДНК, чтобы получить соотношение между якорной цепью BHQ2 и цепью лиганда Cy3B 10:1. На этом этапе раствор ДНК должен содержать 300 нМ конструкции натяжного зонда и 2,7 мкМ цепи BHQ2. Добавьте 100 мкл на два покровных стекла, чтобы получился «сэндвич» (рис. 3E).
- Осторожно поместите влажный лабораторный шарик в чашку Петри (подальше от покровных стекол) и запечатайте чашку парафиновой пленкой, чтобы предотвратить высыхание раствора. Накройте блюдо фольгой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение ночи.
- День 2
- Смойте излишки щупов с покровных стекол с помощью 1x PBS. Проверьте качество поверхности зонда на натяжение ДНК под эпифлуоресцентным микроскопом.
- Приготовьте 40 мкг/мл стрептавидина в 1x PBS и инкубируйте на покровных стеклах в течение 30 мин при комнатной температуре (рис. 3F). Обычно для покровного стекла диаметром 25 мм достаточно 100 мкл. После инкубации промыть PBS 3 раза, чтобы смыть лишнее количество стрептавидина.
- Приготовьте 40 мкг/мл биотинилированного антитела/лиганда в 1x PBS. Добавьте 50-100 мкл на бутерброд и выдерживайте в течение 30 минут при комнатной температуре (рис. 3G). Промойте PBS три раза после инкубации, чтобы смыть избыточное количество биотинилированных антител / лиганда.
- Тщательно соберите чистые камеры визуализации с поверхностями. Поверхности могут быть легко растресканы при затягивании камер. Добавьте 0,5-1 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в камеры визуализации и держите их готовыми к визуализации с помощью клеток (рис. 3H).
3. Визуализация клеточных рецепторных сил
- Подготовьте иммунные клетки, представляющие интерес для HBSS, в дозе 1-2 x 106 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера в этой статье используются наивные клетки OT-1 CD8+. Очистите наивные Т-клетки OT-1 CD8+ a из селезенки принесенных в жертву мышей с помощью набора для выделения CD8+ Т-клеток мыши MACS с сепаратором MACS в соответствии с инструкциями производителя. Изолируйте и обогащайте CD8 + Т-клетки, удаляя любые Т-клетки, отличные от CD8 +, с которыми связан коктейль магнитных истощающих антител. Ресуспендируют очищенные OT-1 CD8+ наивные Т-клетки в HBSS в дозе 2 x 106 клеток/мл и хранят на льду перед использованием. - Проверьте качество поверхности зонда натяжения шпильки ДНК под флуоресцентным микроскопом (объектив 100x) для контроля качества перед добавлением лигандов или гальванических клеток. Изображение и количественная оценка средней интенсивности фона в канале Cy3B поверхности зонда натяжения шпильки ДНК по крайней мере из 5 различных положений и 3 реплик. Обеспечьте согласованность условий получения изображений, чтобы это значение можно было использовать в качестве надежного маркера качества поверхности и плотности зонда (рис. 4C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественно определите количество нитей ДНК на наночастицу золота и количество наночастиц золота намкм 2 в первые несколько раз подготовки поверхности в соответствии с литературой12, что может быть использовано в качестве еще одного надежного маркера качества поверхности. - Пластина ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 клетки на каждом натяжном зонде ДНК функционализирует покровное стекло и позволяет им прикрепляться и распространяться в течение ~ 15 мин при комнатной температуре.
- По мере того, как клетки наносятся на натяжные зонды ДНК и начинают распространяться, визуализируйте флуоресцентные сигналы, которые генерируются в канале Cy3B со 100-кратным объективом (рис. 3I).
- После того, как клетки начнут вырабатывать сигнал натяжения в реальном времени на поверхности натяжного зонда ДНК в канале Cy3B, получите изображения в каналах Cy3B и Atto647N (микроскопия TIRF дает лучшее соотношение сигнал/шум, чем эпифлуоресценция). Затем добавьте цепь Atto647N в камеры визуализации в конечной концентрации 200 нМ для механически селективной гибридизации.
- После 10 минут инкубации быстро и осторожно удалите буфер, содержащий флуоресцентную фиксирующую нить Atto647N, и замените ее свежими сбалансированными солями Хэнка. Снова получите изображение в каналах Cy3B и Atto647N и определите коэффициент корреляции Пирсона с помощью программного обеспеченияFiji 15.
- В момент, представляющий интерес для исследования, введите нефлуоресцентную фиксирующую нить в клетки в камере визуализации для хранения сигнала натяжения. Приготовьте фиксирующую нить (100 мкМ) и добавьте в клетки в конечной концентрации 1 мкМ. Аккуратно перемешайте пипеткой. Продолжительность блокировки может варьироваться, но рекомендуемое время составляет 10 минут.
- Получение покадровых видеороликов или конечных изображений в эпифлуоресценции как для качественного картирования напряжения, так и для количественного анализа по мере необходимости (рис. 3J и рис. 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется измерение натяжения в несколько моментов времени, инициируйте стирание сохраненных сигналов натяжения, добавив разблокирующую прядь. Чтобы избежать чрезмерного промывания, более высокая конечная концентрация разблокирующей нити при 2 мкМ используется для инициирования реакции смещения цепи, опосредованной захватом пальца, с фиксирующей нитью в течение 3 мин, которая стирает сохраненные сигналы (рис. 3J). Аккуратно смойте излишки олигонуклеотидов с помощью HBSS. Поверхность натяжного зонда шпильки ДНК и клетки готовы к следующему раунду хранения и картирования натяжения. Разблокировка сигналов напряжения не нужна, если только один момент времени представляет интерес для исследования.
4. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений выполняется с использованием программного обеспечения Fiji, а количественный анализ выполняется с использованием программного обеспечения для анализа.
- Исправьте любой дрейф во время получения изображения с помощью команды « Исправить 3D-дрейф » в разделе «Регистрация » в меню «Плагины ».
- Удалите фон камеры изображения с помощью команды « Вычитать » в меню «Процесс ».
- Определите коэффициент корреляции Пирсона с функцией «Колокализация» в меню «Анализ».
- Усредните и вычтите фон флуоресценции, создаваемый неоткрытыми зондами, из трех разных локальных фоновых областей. Рисуйте рентабельность инвестиций ячеек на изображениях с вычитанием фона или изображениях RICM (отражение, интерференционно-контрастная микроскопия) с помощью инструмента « Выделение изображения J от руки ». Измерьте любую метрику, представляющую интерес для ROI, например, интегральную интенсивность флуоресценции и занятость напряжения, используя инструмент «Измерение» в меню «Анализ» (рис. 6).
- Экспортируйте измерения для количественного анализа с помощью программного обеспечения для анализа.
- Стройте график данных с помощью любого программного обеспечения для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы показываем репрезентативные изображения контроля качества поверхности (рис. 4). Высококачественная поверхность должна иметь чистый фон в канале RICM (рис. 4B) и равномерную интенсивность флуоресценции в канале Cy3B (рис. 4C). При одинаковом оборудовании для визуализации и идентичных условиях получения флуоресцентной визуализации фоновая интенсивность флуоресценции должна быть постоянной и воспроизводимой каждый раз при проведении экспериментов с ДНК-зондами. Мы рекомендуем использовать его в качестве маркера для контроля качества поверхности перед каждым набором индивидуальных экспериментов.
В этой статье мы показываем некоторые репрезентативные данные (рис. 5) с наивными клетками OT-1 CD8+ в качестве модельного типа клеток, которые специфически распознают куриный овальбумин. Антитело CD3ε включено в качестве положительного контроля для системы, а родственный антиген pMHC N4 (SIINFEKL) используется в качестве примера. Клетки были нанесены на субстраты, которые были функционализированы с помощью шпилечных зондов ДНК 4,7 pN, представляющих либо антиCD3ε, либо pMHC N4. Через 30 минут было зафиксировано распространение клеток в RICM и напряжение в канале Cy3B в реальном времени, и фиксирующая цепь вводилась в конечной концентрации 1 мкМ. Покадровая съемка блокировки натяжения показала, что сигналы напряжения TCR-antiCD3ε и TCR-pMHC усиливались из-за блокировки шпильки и накопления сигнала. Кроме того, взаимодействие TCR-pMHC N4 показало слабый силовой сигнал в реальном времени (0 мин), вероятно, из-за короткого времени жизни связи. Фиксирующая прядь регистрировала эти кратковременные механические события вытягивания, что облегчает количественный анализ. Кроме того, блокировка выявила паттерн силы TCR-pMHC по мере ее накопления, который сильно отличался от контроля антиCD3ε и напоминал паттерн иммунных синапсов «в яблочко». Количественная оценка флуоресцентного сигнала описана на шаге 4.4. Обычно мы используем занятость натяжения (определяемую как процент площади, которая имеет сигнал натяжения над областью контакта) и интегральную интенсивность флуоресценции каждой ячейки в качестве показателя для оценки накопленного напряжения, которое составляет > 4,7 пН.
Рисунок 2: Примеры олигонуклеотидных препаратов. (A) ВЭЖХ-хроматограмма очистки цепи лиганда Cy3B; (B) спектры MALDI-TOF-MS продукта; (C) Таблица расчетной массы и найденных m/z пиков исходного материала и меченого олигонуклеотида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Функционализация субстратов зонда натяжения ДНК и процедуры эксперимента. Шаги описаны в соответствующем протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример поверхности зонда натяжения ДНК с хорошим качеством. (A) характеристика поверхности зонда натяжения ДНК с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ); и необработанные микроскопические изображения поверхности зонда натяжения ДНК в каналах (B) RICM и (C) Cy3B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пример необработанных микроскопических изображений успешного эксперимента. Изображения показывают, что наивные клетки OT-1 CD8+ продуцируют силы TCR против (A) антиCD3ε и (B) pMHC N4. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Примеры обработки данных и количественного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Примеры удачных и неудачных поверхностей и картирования натяжения . (A) Клетки, которые не распространяются по сравнению с клетками, которые распространяются по поверхностям pMHC N4 в RICM. (B) Клетка OT-1, которая распространялась, но не генерировала сигнал напряжения на поверхности антиCD3ε с низкой плотностью зонда натяжения ДНК. (C) Рисунок, показывающий, что успешная поверхность бледно-розовая, а неудачная поверхность бесцветна. (D) Изображение в канале Cy3B, показывающее флуоресцентные агрегаты из старого запаса ДНК. (E) Рисунок в каналах RICM и Cy3B, которые, вероятно, связаны либо с недостаточной промывкой, либо со случайным высыханием поверхности между этапами. (F) Изображения в каналах RICM и Cy3B, демонстрирующие эффект от использования Au NP различных размеров. (G) RICM и Cy3B изображения клеток OT-1, которые не проявляли сигналов напряжения, а вместо этого истощали ДНК. Масштабная линейка = 5 мкм. Обратите внимание, что необработанные данные, показанные здесь, были собраны разными членами группы с разными настройками получения изображений с 3 микроскопов, таким образом, имея разные уровни фона флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью подробных процедур, представленных здесь, можно подготовить субстраты зонда натяжения шпильки ДНК для картирования и количественной оценки напряжения рецепторов, продуцируемого иммунными клетками. Когда клетки наносятся на подложку зонда натяжения шпильки ДНК, они приземляются, прикрепляются и распространяются по мере того, как рецепторы ощущают лиганды как химически, так и механически, последний из которых обнаруживается нашими зондами. Однако в некоторых случаях клетки могут не распространяться (Рисунок 7А) или не выдают сигнал напряжения. Это часто является следствием проблем с химическим составом поверхности и требует устранения неполадок (Таблица 1). Низкая плотность лигандов является одной из наиболее распространенных проблем, которая приводит к сбою распространения клеток. Это может быть результатом множества факторов, таких как деградировавший лиганд, деградировавшие нити ДНК, гидролизованные реагенты, такие как APTES и / или LA-PEG-NHS, агрегированные наночастицы золота или недостаточная очистка стеклянного покровного стекла. Сравнивая интенсивность флуоресценции фона субстрата в успешных экспериментах и неудачных (Рисунок 7B), можно быстро оценить источник проблемы. Например, поверхности с сильным сигналом флуоресценции от фоновых измерений указывают на то, что иммобилизация ДНК-зондов прошла успешно. Низкая фоновая интенсивность предполагает проблемы на этапах подготовки до добавления стрептавидина и биотинилированного лиганда. Если проблема вызвана лигандом, его качество можно проверить, нанеся его на предметное стекло или лунки в 96-луночную пластину с дозой 10 мкг/мл для проверки клеточной адгезии. Это полезный функциональный тест активности лигандов для лигандов pMHC и антител против CD3. Наблюдая за изменением цвета (бледно-розовым) функционализированных покровных стекла после стадии инкубации Au NP, можно оценить, вызвана ли проблема деградацией ДНК или этапами, предшествующими инкубации с ДНК (Рисунок 7C). Качество цепи ДНК может быть проверено с помощью ВЭЖХ и MALDI-TOF-MS, в которых один образец ДНК покажет несколько пиков при деградации. Качество Au NP может быть подтверждено путем сравнения спектров УФ-ВИД и изображений ПЭМ с характеристикой, предоставленной производителем. Если качество лиганда, нитей ДНК и Au NP подтверждено, и эти реагенты не вызывают проблем с поверхностью, мы рекомендуем заменить реагенты, включая APTES, LA-PEG-NHS, серную кислоту и H2O2 для будущей подготовки поверхности вместо того, чтобы тратить время на точное определение причины проблемы с химическим составом поверхности. За исключением проблемы низкой плотности, которая приведет к серьезному отказу субстрата ДНК-зонда, есть несколько незначительных проблем, которые могут повлиять на качество данных. Поскольку подготовка поверхности имеет несколько этапов инкубации, буферы, используемые во время подготовки поверхности, следует делать свежими, фильтровать и хранить при температуре 4 ° C для хранения, чтобы избежать загрязнения. Если поверхность загрязнена, это будет видно в канале RICM и может привести к странному фону флуоресценции. Помимо загрязнения, агрегаты могут образовываться в исходном растворе ДНК с течением времени, что может привести к появлению ярких точек в канале Cy3B (Рисунок 7D). Обычно несколько агрегатов не влияют на качество данных; Однако, если клетка попадает в области с такими дефектами, анализ данных менее надежен. Иногда нерегулярные паттерны, влияющие на отображение натяжения, могут наблюдаться как в каналах RICM, так и в каналах Cy3B, что может быть вызвано недостаточной промывкой после шага APTES или случайным высыханием поверхности во время этапов после того, как частицы золота функционализируются на поверхности (Рисунок 7E). Эти паттерны могут влиять на картирование напряжения в зависимости от того, насколько оно серьезно. Чтобы сохранить относительно ценные реагенты, такие как антитела или pMHC, мы рекомендуем всегда проверять качество поверхности (см. 2.2.1 и 3.3) перед функционализацией зондов натяжения шпилек ДНК антителом/лигандом. Несмотря на то, что этот протокол подготовки поверхности оказался прочным и надежным в наших руках, обратите внимание, что он не всегда хорошо переносит изменения на определенных этапах. Например, когда вместо травления пираньи используется травление основания и плазменное травление, весьма вероятно, что плотность зонда уменьшается и присутствует больше поверхностных дефектов. Изменения размера Au NP и укупорочных реагентов, вероятно, существенно повлияют на результаты функционализации поверхности (Рисунок 7F). Например, мы обнаружили, что 5 и 10 нм Au NP не очень хорошо связываются с поверхностями, модифицированными липоевой кислотой, что приводит к минимальному количеству ДНК после подготовки поверхности. Однако 8,8 нм и 13 нм Au NP могут связываться с поверхностями липоевой кислоты при гораздо более высокой плотности, что наблюдалось в RICM (шероховатость) и канале Cy3B (интенсивность флуоресценции).
После того, как поверхности зондов натяжения шпилек ДНК хорошего качества подготовлены, можно проводить эксперименты с интересующими клетками и получать данные с помощью флуоресцентного микроскопа. Напряжение в реальном времени может быть зафиксировано с помощью обычного флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом с высокой числовой апертурой NA (числовой апертурой) и EMCCD. Обратите внимание, однако, что мы наблюдали, что первичные Т-клетки иногда отображают артефакты на поверхностях зонда натяжения ДНК из-за условий этой конкретной мыши. Как ни странно, такие артефакты чаще случаются со старыми мышами. Например, мы наблюдали отрицательное истощение флуоресценции вместо включенных сигналов флуоресценции (рис. 7G). В этом случае завершите эксперимент и повторите его с новой партией ячеек. Перед использованием нефлуоресцентной фиксирующей нити для количественного анализа рецепторных сил необходимо подтвердить хранение и стирание сигнала натяжения с помощью флуоресцентной фиксирующей нити Atto647N. После первоначальной блокировки в течение 10 минут сигнал Atto647N должен быть сильно локализован вместе с сигналом Cy3B, так как он отражает историю напряжения во время этой инкубации. Поскольку сигнал Cy3B отражает не только историю натяжения, но и силы в реальном времени после удаления фиксирующей пряди, возможно, что небольшое подмножество сигнала Cy3B не сопровождается сигналом Atto647N (рис. 3J). Для более количественного анализа натяжения мы рекомендуем использовать нефлуоресцентную фиксирующую прядь, которая исключит потенциальную передачу энергии между Cy3B и Atto647N, а также предотвратит чрезмерную промывку между получением изображений. Обратите внимание, что добавление фиксирующей нити неизбежно вызовет небольшое увеличение фона флуоресценции, так как термодинамика приведет к некоторой незначительной гибридизации между шпилькой и фиксирующей нитью, которую можно вычесть перед количественной оценкой. Можно количественно оценить интегральную интенсивность каждой клетки после процедуры блокировки, чтобы изучить силу, генерируемую определенным рецептором. Кроме того, кинетика блокировки, вероятно, отражает включение и выключение 2D k рецептора к его лиганду.
| Проблема | Возможная причина | Решение |
| Поверхности не розовые после инкубации AuNP | Недостаточное травление | Включите этап травления основы после травления пираньи. Травить покровные стекла в 0,5 М КОН в ледяной бане в течение 1 ч с ультразвуком. |
| APTES гидролизован | Использование новых APTES | |
| Реагенты NHS гидролизуются | Используйте новые реагенты PEG-NHS | |
| Реагенты PEG-NHS гидролизуются перед нанесением на поверхности | Работайте быстрее | |
| Au NP агрегировал | Используйте новый Au NP | |
| Остаточная вода на покровных стеклах разбавляла Au NP | Перед добавлением Au NP убедитесь, что в нем нет или мало остатков воды. | |
| Клетки не распространяются по поверхности | Низкая плотность ДНК-зондов | Если поверхности не такие розовые, устраните неполадки, как описано выше. Если функционализация Au NP нормальная, синтезируют и используют новую ДНК |
| Низкая плотность лигандов | Используйте новые реагенты стрептавидина и лиганда | |
| Клетки не распространяются на лиганд | Проверьте распространение клеток на поверхности, покрытой лигандом, если клетки не распространяются по-прежнему, включите прилипшие молекулы, как описано в ссылке 12. | |
| Клетки распространяются хорошо, но сигнал напряжения не наблюдается или только очень слабый сигнал напряжения наблюдается даже при контроле антител | Взаимодействие рецептор-лиганд не имеет передачи силы | Н.А. |
| Сила недолговечна или силовые сигналы редки | Используйте блокирующий олигонуклеотид | |
| Поверхность плохо пассивируется | Увеличьте концетат сульфо-NHS до 10 мг / мл | |
| В Atto647N не наблюдается сигнала блокировки | Олигонуклеотид деградировал | Проверить с помощью MALDI-TOF-MS |
| Сигнал блокировки локализован с помощью датчика реального времени | Сила рецептора выше, чем рабочий диапазон блокирующего нуклеотида | Используйте шпильку в реальном времени с частотой 19 пН из ссылки 12, как описано. |
Таблица 1: Поиск и устранение неисправностей с помощью системы датчиков натяжения на основе ДНК.
Применение механического хранения информации особенно полезно для картирования рецепторных сил, генерируемых иммунными клетками, которые часто являются преходящими и менее многочисленными. Как определено измерениями одномолекулярной спектроскопии, пиковое время жизни связи наблюдается при приложении силы ~ 10 пН с временем жизни от менее 100 миллисекунд до нескольких секунд. Такие короткосрочные связи трудно захватить с помощью обычной визуализации натяжения ДНК-шпильки15. Другое применение этой механической системы хранения заключается в том, что плотность интересующего рецептора на поверхностиклетки 16 относительно низкая, что приводит к разреженному сигналу, который часто трудно отличить от фона с помощью обычных датчиков натяжения шпилек ДНК. Такие рецепторные силы низкой плотности могут быть выявлены путем картирования накопленного напряжения с помощью этой стратегии. Обратите внимание, что мы специально ограничиваем применение этой стратегии к иммунным клеткам, поскольку известно, что силы, присутствующие в иммунных клетках, находятся в более низком режиме (TCR < 19 pN) по сравнению с интегринами в фибробластах или тромбоцитах (до или более 56 pN)12,13,15. Причина в том, что константа скорости гибридизации khyb не нарушается при нагрузке менее 20 пН по измерениям оптического пинцета, которая находится в диапазоне 106 М-1 С-1. Более того, прогнозируется, что k hyb при силах < 20 pN будет немного выше, чем при khyb при нулевой силе, поскольку слабое взаимодействие помогает выровнять цепь для гибридизации комплементарной цепи с17. С другой стороны, ожидается, что большие силы будут препятствовать гибридизации, поскольку koff увеличивается и создает барьер для гибридизации18. По нашим оценкам, для замка длиной 15-17 нуклеотидов сила от 27,8 до 30,8 пН будет препятствовать гибридизации. Учитывая эти ограничения, мы предлагаем применять этот метод исключительно в исследованиях рецепторных сил иммунных клеток. Кроме того, наличие фиксирующей пряди, вероятно, изменит энергетический ландшафт для разворачивания шпильки, что может немного уменьшить эффективнуюF1/2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH R01GM131099, NIH R01GM124472 и NSF CAREER 1350829. Мы благодарим Центр тетрамеров NIH за лиганды pMHC. Это исследование было частично поддержано Emory Comprehensive Glycomics Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
- Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
- Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
- Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
- Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961 (2019).
- Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
- Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
- Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).
