Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

Summary

La creciente demanda de recopilación de datos a gran escala en la tomografía electrónica criogénica requiere rutinas de adquisición de imágenes de alto rendimiento. Aquí se describe un protocolo que implementa los desarrollos recientes de estrategias de adquisición avanzadas destinadas a maximizar la eficiencia del tiempo y el rendimiento de la recopilación de datos tomográficos.

Abstract

La tomografía electrónica criogénica (cryoET) es un método poderoso para estudiar la estructura 3D de muestras biológicas en un estado cercano al nativo. El crioET actual de última generación combinado con el análisis de promedio de subtomogramas permite la determinación estructural de alta resolución de complejos macromoleculares que están presentes en múltiples copias dentro de las reconstrucciones tomográficas. Los experimentos tomográficos generalmente requieren una gran cantidad de series de inclinación para ser adquiridas por medio de microscopios electrónicos de transmisión de alta gama con importantes costos operativos de funcionamiento. Aunque el rendimiento y la fiabilidad de las rutinas automatizadas de adquisición de datos han mejorado constantemente en los últimos años, el proceso de selección de regiones de interés en las que se adquirirá una serie inclinada no se puede automatizar fácilmente y todavía depende de la entrada manual del usuario. Por lo tanto, la configuración de una sesión de recopilación de datos a gran escala es un procedimiento que consume mucho tiempo y que puede reducir considerablemente el tiempo restante del microscopio disponible para la adquisición de series de inclinación. Aquí, el protocolo describe las implementaciones recientemente desarrolladas basadas en el paquete SerialEM y el software PyEM que mejoran significativamente la eficiencia del tiempo de la detección de la red y la recopilación de datos de series de inclinación a gran escala. El protocolo presentado ilustra cómo utilizar las funcionalidades de scripting de SerialEM para automatizar completamente el mapeo de cuadrícula, el mapeo de cuadrados de cuadrícula y la adquisición de series de inclinación. Además, el protocolo describe cómo usar PyEM para seleccionar objetivos de adquisición adicionales en modo fuera de línea después de iniciar la recopilación automatizada de datos. Para ilustrar este protocolo, se describe su aplicación en el contexto de la recopilación de datos de alta gama de la serie de inclinación Sars-Cov-2. La tubería presentada es particularmente adecuada para maximizar la eficiencia del tiempo de los experimentos de tomografía que requieren una cuidadosa selección de objetivos de adquisición y, al mismo tiempo, una gran cantidad de series de inclinación que se recopilará.

Introduction

Los métodos de microscopía electrónica criogénica (crioEM) se basan en la obtención de imágenes de muestras biológicas mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM) después de su rápida vitrificación, un proceso de preparación de muestras que preserva las estructuras moleculares y celulares de las muestras en un estado cercano a los nativos e hidratados^1,2. En la tomografía electrónica criogénica (cryoET) se consigue un modelo 3D de la muestra vitrificada mediante la adquisición de una serie de imágenes de la misma región de interés desde diferentes orientaciones, las llamadas series tilt, seguidas de la reconstrucción computacional del volumen tomográfico^3. Esta técnica de imagen avanzada se ha convertido en un poderoso método para la investigación estructural de procesos biológicos en el contexto de sus entornos celulares nativos^4,5,6.

Además del análisis ultraestructural de la muestra vitrificada, se pueden obtener reconstrucciones de alta resolución de complejos macromoleculares que están presentes en múltiples copias dentro del volumen tomográfico aplicando subtomograma con un promedio de⁵. Este enfoque de reconstrucción se basa en la alineación iterativa y el promedio de subvolúmenes que contienen la estructura de interés y está dirigido a aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la reconstrucción final^7,8. El promedio de subtomogramas se basa en la recopilación y el procesamiento de una gran cantidad de datos que a menudo exigen la adquisición de cientos de series inclinadas por medio de TEMs de alta gama con costos de funcionamiento operativos onerosos.

Actualmente, la configuración de tales sesiones automatizadas de cryoET es un proceso que consume mucho tiempo y que generalmente se basa en la entrada manual del usuario^9,10,11. Por lo general, los objetivos se identifican mediante la inspección visual de la cuadrícula asignada y, posteriormente, se configuran para la recopilación automatizada de datos. La eficiencia del usuario en la identificación de puntos de adquisición a menudo se ve afectada por la naturaleza de la muestra, lo que se vuelve particularmente desafiante cuando se analizan macromoléculas purificadas con concentración subóptima o en el caso de eventos raros dentro de entornos celulares abarrotados, lo que implica el uso de enfoques correlativos¹². Además, los flujos de trabajo actuales requieren la adquisición de imágenes durante la configuración a varios aumentos que luego se utilizarán para la localización precisa y el centrado del objetivo durante la adquisición automatizada^11,13,14. Estos pasos de realinación de alta precisión son cruciales para las aplicaciones de alta resolución, que exigen que las imágenes se realicen a gran aumento y requieren pasos de centrado precisos para retener la región de interés dentro del pequeño campo de visión resultante. En total, se dedican varias horas de cada sesión de recopilación de datos para este procedimiento que consume mucho tiempo durante el cual el TEM no se dedica a la adquisición de series inclinadas. Por lo tanto, dependiendo de la cantidad de series de inclinación requeridas, la identificación y configuración de los puntos de adquisición puede tener un impacto considerable en el tiempo de microscopio disponible para la recopilación de datos durante una sesión de crioET.

Aquí se describe un protocolo optimizado basado en el paquete de software SerialEM¹⁵ y la última versión del software PyEM¹⁶ para mapear cuadrículas, mapear cuadrados de cuadrícula, seleccionar objetivos y configurar la adquisición automatizada de datos para la recopilación de series de inclinación a gran escala. El concepto clave de este enfoque es proporcionar a SerialEM imágenes generadas computacionalmente por PyEM para cada elemento de adquisición, denominados mapas virtuales, para la localización precisa y el centrado del objetivo. Para obtener tiempo de adquisición real, la selección de los objetivos, así como la creación de los mapas virtuales, se realizan fuera de línea utilizando una segunda instancia ficticia de SerialEM, desacoplando el proceso de selección de objetivos de adquisición de las operaciones de TEM. Si bien no aborda cómo aumentar la calidad de los datos^13,17 o la velocidad de adquisición de series de inclinación^18,19, este protocolo se centra principalmente en estrategias para optimizar la eficiencia del tiempo de la configuración de sesiones crioET automatizadas a gran escala. Por lo tanto, la implementación del protocolo presentado está destinada a aquellos científicos que establecen flujos de trabajo de recopilación de datos cryoET que desean maximizar el rendimiento de la adquisición automatizada de datos al aumentar el tiempo de microscopio disponible para la adquisición de series de inclinación.

Protocol

El protocolo descrito aquí es parte de un documento más completo producido por la plataforma de servicio EMBL CryoEM que incluye instrucciones exhaustivas paso a paso y capturas de pantalla que ilustran todo el procedimiento de una sesión típica de cryoET, incluida la carga de muestras, el mapeo de cuadrícula, el ajuste del microscopio, la configuración de puntos de adquisición y la recopilación automatizada de datos. El protocolo completo se puede descargar en el siguiente enlace: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Requisitos previos

1. Instale SerialEM versión 3.8 y configréselo para controlar el microscopio y el detector (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
2. Instale una instancia ficticia de SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
3. Instale PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Mapeo de cuadrícula

1. Cargue un cassette con rejillas en el cargador automático del microscopio.
2. Configure las condiciones de imagen adecuadas para mapear toda la cuadrícula. Haga esto con el menor aumento posible teniendo en cuenta el campo de visión en el detector utilizado (EFTEM SA 2250x). Guarde las condiciones de imagen como un estado de imagen SerialEM para que las cosas sean convenientes para su uso posterior.
3. Configurar el montaje completo
   1. Abra el menú SerialEM Navigator.
   2. Seleccione Montaging & Grids.
   3. Seleccione Configurar montaje completo.
4. Inicie el script Grid_Mapping. Permita que el script espere a que el cargador automático se enfríe; haga un inventario y luego asigne cada cuadrícula que encontró el procedimiento de inventario. Ingrese un correo electrónico a través del menú Tilt Series para permitir que el script envíe convenientemente un correo electrónico cuando haya terminado.
5. Guardar Navigator.
6. Inspeccione todos los mapas de cuadrícula desde SerialEM Navigator y elija qué cuadrícula desea asignar más a mayor aumento.
   NOTA: Muchos TEM equipados con un sistema de cargador automático mostrarán una rotación de la red cuando se vuelvan a cargar. Es mejor reasignar cualquier cuadrícula después de volver a cargarla. Los sistemas alternativos generalmente solo sufren algunos cambios, que se pueden corregir en SerialEM con un procedimiento Shift To Marker.

3. Configure la dosis baja de SerialEM

1. Establezca la ampliación de los modos vista y vista previa de dosis baja de SerialEM (esto es necesario para el paso 6).
2. Adquiera una imagen de View y guárdela como un mapa en el Navegador.
3. Adquiera una imagen de vista previa y guárdela como un mapa en el Navegador.
   1. Establezca ambos modos en el mismo binning (se sugiere binning 4). Esto permite guardar los dos mapas en una pila de imágenes.
   2. En la ventana SerialEM Navigator, cambie la etiqueta del mapa Ver a Ver y la etiqueta del mapa Vista previa a Vista previa.
   3. Guarde y cierre el archivo del navegador.
      NOTA: No se necesita ningún destino para las imágenes iniciales de vista y vista previa, PyEM simplemente usará su configuración de imágenes.

4. Mapeo cuadrado de cuadrícula

1. Configure las condiciones de imagen para asignar cuadrados de cuadrícula. Es de gran importancia poder ver la muestra de interés y la distribución de cuentas fiduciales. Para garantizar un contraste óptimo para los mapas cuadrados de cuadrícula, realice los siguientes pasos.
   1. Inserte una apertura de objetivo.
   2. Si procede, inserte la ranura del filtro de energía.
   3. Utilice un desenfoque de -100 μm.
2. Pantalla para buenos cuadrados de cuadrícula adecuados para un mapeo adicional. Después de la inspección visual de los cuadrados del mapa de cuadrícula, tome imágenes de prueba del cuadrado con las condiciones de imagen que se utilizarán para los mapas de cuadrados de cuadrícula.
3. Cuando se identifique un buen cuadrado, marque su centro en la imagen del mapa de cuadrícula mediante la función Agregar puntos de SerialEM Navigator.
4. Una vez que se agregan todos los puntos, en SerialEM Navigator presione Mayús + A en el primer punto, luego presione Mayús + A en el último punto.
   NOTA: Todos los puntos agregados ahora están marcados por una A, lo que significa que todos son Puntos de adquisición.
5. Presione Mayús + N (cree un nuevo archivo en el elemento) en el primer punto y luego nuevamente en el último punto. En el cuadro de diálogo que aparece, seleccione Imágenes montadas.
6. Cuando aparezca el cuadro de diálogo de montaje, configure un tamaño de montaje que cubra un cuadrado de cuadrícula. Esto depende de la ampliación y el tamaño de malla de las rejillas utilizadas y, por lo general, requiere montajes de 2 x 2 a 4 x 4. Así que se le dé un nombre con un número (por ejemplo, squaremap_01.mrc) para permitir que el SerialEM numero automático convenientemente todos los archivos por cuadrado de cuadrícula.
7. Inicie el mapeo de cuadrícula abriendo el menú SerialEM Navigator y haga clic en Adquirir en elementos.
8. En el menú emergente, seleccione las siguientes opciones.
   1. Seleccione Eucentricidad rugosa.
   2. Seleccione Adquirir imagen de mapa.
   3. Seleccione Cerrar válvulas de columna en el extremo.
   4. Seleccione Enviar correo electrónico al final.

5. Selección de los objetivos

1. Abra una instancia de SerialEM ficticia. Esto se puede configurar en el PC SerialEM que controla el microscopio o en un PC diferente (de soporte) si ambos equipos comparten una conexión de red.
2. Una vez asignado el primer cuadrado de cuadrícula, utilice la opción de menú Combinar de SerialEM Navigator para ver el montaje en la instancia ficticia de SerialEM.
3. Haga doble clic en la ventana Navegador para abrir el mapa cuadrado de cuadrícula.
4. Busque en el mapa y utilice la opción ficticia de SerialEM Navigator Agregar puntos para agregar puntos de adquisición de imágenes en el objetivo de interés.
5. Cuando haya terminado y después de asignar los nuevos cuadrados, guarde el archivo Navigator y combine el Navigator nuevamente; continúe hasta que se asigneen todos los cuadrados de cuadrícula.

6. Generar mapas virtuales

1. Una vez más, combine el archivo del navegador con la instancia ficticia de SerialEM.
2. Ejecute el script de mapas virtuales de PyEM desde el menú serialem ficticio, Herramientas y seleccione Mapas de anclaje virtual. Esto puede llevar algún tiempo dependiendo del tamaño y la cantidad de los mapas cuadrados de cuadrícula y la unión de los mapas de vista y vista previa.
   NOTA: PyEM inicia una ventana de comandos que se cierra automáticamente cuando termina, luego se puede abrir el nuevo archivo del navegador. Por mapa montaged que contiene puntos seleccionados, PyEM escribe un único mapa combinado y todos sus mapas de vista y vista previa. Finalmente, escribe un nuevo archivo Navigator llamado <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. Ajuste del microscopio

1. Compruebe la afinación del microscopio. Para garantizar el rendimiento adecuado del microscopio, utilice la misma configuración de aumento y tamaño de haz para la adquisición de datos, en el siguiente orden.
   1. Ejecute la alineación sin coma de SeriaLEM por CTF (Zemlin tableau).
   2. Inserta y centra una apertura de objetivo.
   3. Ejecute SerialEM Correct Astigmatism por CTF (autoestigmatizado).
   4. Ejecute GIF Quick Tune (es decir, solo enfoque de ranura).
      NOTA: Como los pasos 7.1.1, 7.1.3 y 7.1.4 pueden requerir una mayor tasa de dosis, solo se debe cambiar el tamaño del punto; el tamaño del haz no debe cambiarse, ya que esto causa la inclinación del haz, lo que hace que las afinaciones sean incorrectas. Los pasos 7.1.1, 7.1.2 y 7.1.3 están semiautomatizados en este script disponible públicamente (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Configurar Navigator

1. En SerialEM, abra el nuevo archivo de navegador denominado _automaps.nav.
   NOTA: V_yyyy son los mapas de vista y P_yyyy son los mapas de vista previa. Los mapas de vista previa se establecen como puntos de adquisición.
2. En la ventana de SerialEM Navigator, anule la selección de todos los puntos A, seleccione el primer V_yyyy mapa, seleccione Contraer,haga clic en A dos veces y anule la selección de Contraer.
3. Seleccione la primera posición V_yyyy, pulse Mayús + T,luego seleccione la última posición V_yyyy y pulse Mayús + T de nuevo.
4. Elija Imágenes de fotograma único en las propiedades del archivo para abrir el cuadro de diálogo.
5. En el siguiente cuadro de diálogo Propiedades del archivo, seleccione los parámetros deseados según las necesidades de imagen y la configuración del instrumento.
6. Cuando se le solicite, asigne un nombre con un número (por ejemplo, TS_001.mrc) y haga clic en Guardar.
   NOTA: SerialEM numerará automáticamente los nombres de archivo para todas las series de inclinación.
7. Configure el controlador de la serie de inclinación para la primera posición de TS. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar para establecer estos parámetros para todas las series de inclinación después de este elemento de adquisición. Todos los mapas de vista previa ahora se seleccionan como TS (Tilt Series) con el nombre de archivo numerado TS_xxx.mrc.
   NOTA: Se pueden cambiar los parámetros manualmente más tarde utilizando la función Navigator TSparams; se aplicarán cambios para todos los elementos de la lista hacia abajo. El usuario tiene la opción de ejecutar un script personalizado en lugar de la serie de inclinación.

9. Establece las posiciones de enfoque/pista

1. Establezca la distancia de enfoque/seguimiento para cada objetivo si es necesario (asegúrese de que SerialEM Low Dose esté encendido).
2. Haga doble clic en el Ver mapa para cargarlo.
3. Seleccione el mapa de vista previa en la lista Navegador.
4. Seleccione Editar enfoque en la ventana Navegador.
5. En el panel Control de dosis baja, anule la selección de Girar eje entre áreas para colocar Prueba y Enfoque a lo largo del eje de inclinación del escenario.
6. Haga clic en la región deseada en el mapa de vista cargado para establecer la posición de enfoque / prueba para esta serie de inclinación.
7. Asegúrese de que el elemento Navegador tiene TSP configurado ahora; repita el procedimiento para todos los elementos.
   NOTA: Las posiciones de enfoque/pista se copian automáticamente hacia abajo en el Navegador. Por lo tanto, si la posición de enfoque/pista para el elemento anterior está en el lado correcto y de la distancia correcta, no es necesario cambiarla para el elemento actual.

10. Configurar scripts adicionales

1. Dos scripts manejan el rango de enfoque: pretomo y duringtomo. El script de pretomo se ejecuta antes de cada serie de inclinación y el script de duringtomo durante cada inclinación.
2. Edite el rango de enfoque en el pretomo descript .
3. En el menú SerialEM Tilt Series, marque Ejecutar script en TS y seleccione el número de script del script duringtomo.

11. Corre

1. Verifique el nivel del tanque de nitrógeno.
2. Compruebe si el turbo desactivado del cargador automático está seleccionado.
3. Compruebe el espacio libre de almacenamiento de datos.
4. En el menú Archivo SerialEM, anule la selección de Guardado continuo para el archivo de registro y cierre cualquier archivo de registro abierto actualmente. Cada serie de inclinación obtendrá su propio archivo de registro.
5. En el menú Navegador, haga clic en Adquirir en Elementos.
6. Ejecute el script PreTomo.
7. Seleccione Tarea principal Adquirir serie de inclinación.
8. Seleccione Ejecutar script después de PostTomo.
9. Seleccione Cerrar válvulas de columna en el extremo.
10. Seleccione Enviar correo electrónico al final.
11. Haga clic en GO.
    NOTA: SerialEM enviará un correo electrónico por serie de inclinación, ya sea con éxito o por error; Sin embargo, el error también puede significar que no se alcanzó el rango de inclinación completo.

Results

Este procedimiento se utilizó para adquirir la serie de inclinación Sars-Cov-2 descrita en Turonova et al. 2020²⁰; todo el conjunto de datos se produjo utilizando tres cuadrículas distintas durante tres sesiones de microscopía en EMBL Heidelberg. El estudio actual se centrará y describirá la primera sesión de 3 días (~ 72 h) con la primera cuadrícula.

Después de que toda la cuadrícula se mapeó a bajo aumento (~ 10 min, ver paso 2), se seleccionaron 71 cuadrados adecuados en el mapa de cuadrícula, y se adquirieron mapas de aumento medio(mapas cuadrados)con configuraciones (aumento, exposición, desenfoque) que permiten la visualización directa y la identificación de la muestra de interés, coronavirus en este caso (ver paso 4) (Figura 1A). El tiempo de adquisición fue de ~3 min por cuadrado, 3 h 45 min en total.

Tan pronto como se creó el primer mapa cuadrado, se abrió una instancia SerialEM ficticia (sin ningún control en la cámara o el microscopio) en una computadora separada para visualizar el mapa cuadrado y agregar puntos en objetivos adecuados para la adquisición de series de inclinación (consulte el paso 5)(Figura 1B). Los mapas cuadrados recién adquiridos se recuperaron fusionando el navegador SerialEM ficticio actual con el navegador de la instancia SerialEM adquirida. Después de ~ 2 h de adquisición y selección de cuadrados de cuadrícula, se pudieron identificar 50 objetivos iniciales.

Una vez finalizadas las adquisiciones del mapa cuadrado, se configuró SerialEM de dosis baja y se tomaron imágenes de referencia de Vista y vista previa y se guardaron como mapas (consulte el paso 3). Estos últimos mapas podrían usarse inmediatamente en la instancia ficticia de SerialEM para generar, a partir de las imágenes de mapa cuadrado correspondientes, los mapas Virtual View (Figura 1C)y Virtual Preview (Figura 1D)de los 50 objetivos seleccionados con la suite de software PyEM, durante un tiempo de procesamiento de ~ 30 min (consulte el paso 6). Este tiempo de procesamiento en la sesión ficticia de SerialEM se utilizó para realizar las preparaciones finales del microscopio para la adquisición: ajuste del filtro de energía, adquisición de imágenes de referencia de ganancia de nueva cámara, alineación libre de astigmatismo y coma de la lente objetivo.

Una vez que se completó el ajuste del microscopio y se generaron los mapas virtuales de los 50 objetivos iniciales, se configuró el navegador SerialEM real que se utilizará para la adquisición (consulte el paso 8), se establecieron las posiciones de enfoque y seguimiento (paso 9) y se pudo iniciar la adquisición de series de inclinación (consulte los pasos 10 y 11). Los mapas de vista virtual (Figura 1C)se utilizaron para un centrado inicial del objetivo(Figura 1E)seguido de un centrado final realizado en la ampliación de adquisición de la serie de inclinación real(Figura 1F)utilizando el mapa de vista previa virtual (Figura 1D).

Comenzando con el mapeo de cuadrícula a las 9:30 de la mañana, la adquisición de la serie de inclinación para los 50 objetivos iniciales comenzó aproximadamente a las 15:00. Con la configuración utilizada para la adquisición tomográfica (consulte la referencia para obtener detalles), una serie de inclinación tardó ~ 20 minutos en adquirirse, con suficientes objetivos para ejecutarse durante toda la noche. Mientras se ejecutaba la adquisición, el resto de los mapas cuadrados se podían inspeccionar y agregar más objetivos, aún fuera de línea a través de la instancia ficticia de SerialEM. Se seleccionaron 121 objetivos más entre los mapas cuadrados restantes y se agregaron a la adquisición del navegador SerialEM después de que se hubieran creado mapas virtuales para estos nuevos objetivos, suficientes para ejecutarse hasta la finalización de la sesión de 72 h.

Este procedimiento (resumido en la Figura 2)permitió, en un solo día laborable, la configuración de 171 objetivos para adquisiciones tomográficas automatizadas para una sesión de microscopio de 72 h (3 días).

Figura 1: Ejemplo de mapa cuadrado con mapas virtuales representativos y adquisiciones correspondientes después del centrado. (A) Mapa cuadrado representativo de una cuadrícula crioEM Sars-Cov-2 utilizada en Turonova et al.²⁰. Cuatro regiones de interés están marcadas con una cruz roja. El aumento del microscopio es de 2.250x. (B) Recorte del mapa cuadrado resaltando las áreas que se utilizaron para generar los mapas Vista virtual (naranja) y Vista previa virtual (amarillo) para el destino seleccionado (cruz roja) (C) Mapa de vista virtual. (D) Mapa de vista previa virtual. (E) Adquisición de vista real después del centrado utilizando el mapa de vista virtual como referencia. El aumento del microscopio es de 11,500x. (F) Adquisición de inclinación de 0° de la serie de inclinación después de centrar utilizando el mapa de vista previa virtual como referencia. El aumento del microscopio es de 64,000x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo de sesión de CryoET utilizando SerialEM con herramientas PyEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

A partir de una técnica de nicho, cryoET ahora ha madurado en un método generalizado para realizar estudios estructurales a nivel celular y molecular con una resolución alcanzable sin precedentes^21,22. La demanda cada vez mayor de imágenes crioEM ha ejercido presión sobre los limitados recursos disponibles para acceder a esta tecnología. A pesar de la apertura de una serie de instalaciones crioEM nacionales y los esfuerzos de los institutos científicos para aumentar su capacidad de TEM para apoyar las necesidades de la comunidad en todo el mundo, el acceso a los instrumentos crioEM sigue siendo limitado y, por lo tanto, los usuarios deben utilizar eficientemente el tiempo disponible para la recopilación de datos para maximizar el rendimiento de cada sesión de microscopía. La necesidad de adquirir cientos de series inclinadas combinadas con el tiempo limitado disponible para la recopilación de datos requería nuevas rutinas de adquisición de imágenes para lograr un mejor rendimiento sin comprometer la calidad de los datos. Los desarrollos recientes en los flujos de trabajo de hardware e imágenes han aumentado considerablemente la velocidad de adquisición de la serie de inclinación^18,19, lo que resulta en un cambio dramático de la relación entre el tiempo dedicado a configurar un punto de adquisición y el tiempo necesario para la adquisición real de la serie de inclinación. En conjunto, el procedimiento para configurar puntos de adquisición se está convirtiendo en uno de los principales cuellos de botella para el rendimiento alcanzable de las sesiones de cryoET.

El protocolo optimizado presentado aquí nos permitió configurar, en modo fuera de línea, 171 posiciones para la adquisición tomográfica automatizada dentro del primer día de una sesión de crioET mientras el microscopio participaba activamente en otras operaciones (por ejemplo, mapeo cuadrado, ajuste y adquisición automatizada de series de inclinación), sin afectar el tiempo del microscopio disponible para la recopilación de datos. Además de maximizar el rendimiento de una sesión cryoET, esta canalización reduce drásticamente la cantidad de tiempo invertido por el usuario en la fase preparatoria de una sesión automatizada de recopilación de datos. En el protocolo descrito, se le pide al usuario que navegue por los cuadrados de cuadrícula asignados para identificar las regiones adecuadas de interés y agregarlas al Serial EM Navigator como puntos de adquisición. Todos los destinos se procesarán automáticamente por lotes dentro de SerialEM mediante la herramienta PyEM para la producción de los mapas virtuales¹⁶. Por lo tanto, el enfoque computacional presentado es considerablemente más rápido que la adquisición de mapas de anclaje reales al eliminar los períodos de espera asociados con el movimiento del escenario, la adquisición de imágenes, el cambio de las condiciones de imagen entre la vista y la vista previa, y mediante la eventual reiteración de estos pasos mientras se centra en un aumento alto. Además, como cada imagen adquirida conduce a la acumulación de dosis de electrones en el objeto de interés^23,el uso de mapas virtuales para la realineación precisa de los objetivos reduce el daño por radiación introducido en la fase preparatoria de una sesión crioET antes de la adquisición real de la serie de inclinación. El protocolo descrito aquí hace uso de mapas virtuales de aumento intermedio y alto (Vista previa y Vista, respectivamente) para la realineación del objetivo antes de la adquisición de la serie de inclinación. Este procedimiento se puede modificar fácilmente para utilizar solo la imagen de vista de aumento intermedio cuando la precisión de la alineación es de menor importancia, por ejemplo, en el caso de estructuras grandes donde la precisión final del objetivo es menos preocupante¹⁰ o para muestras de análisis de partículas individuales que están mal distribuidas en la crio-cuadrícula que requiere la selección manual del usuario de cada punto de adquisición^{24, 25}. Finalmente, un enfoque basado en el uso fuera de línea de una instancia SerialEM ficticia también facilita la configuración de puntos de adquisición a través de la conexión remota al minimizar la necesidad de la presencia física del usuario en el microscopio, lo que permite una mayor flexibilidad en términos de organización operativa de la instalación.

Los recientes avances en tecnología y métodos para cryoET han mejorado drásticamente la velocidad y confiabilidad de las sesiones automatizadas de recopilación de datos. Sin embargo, se requieren más desarrollos para abordar los pasos restantes de limitación de tasas de este método. En particular, el paso inicial del mapeo de cuadrícula y cuadrado se está convirtiendo en uno de los principales cuellos de botella de la configuración de la sesión, generando así la necesidad de mejoras de hardware destinadas a aumentar la velocidad de los movimientos de la etapa del microscopio y de la adquisición de imágenes por parte de los detectores de electrones directos. Además, el desarrollo de enfoques de aprendizaje automático para automatizar completamente el proceso de identificación de objetivos será crucial para eliminar la necesidad de la inspección visual de los usuarios para seleccionar las regiones de interés, un procedimiento que consume mucho tiempo y que se basa en la experiencia de los usuarios.

Materials

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Microscopio electrónico de			Nuestro protocolo solo se basa en flujos de trabajo computacionales. El usuario solo necesitará acceder a un TEM de cualquier tipo