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Artículo de método

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

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DOI:

10.3791/62391

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31 de marzo de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Resumen

Los vasos sanguíneos están distribuidos ubicuamente dentro de todos los tejidos del cuerpo y realizan diversas funciones. Por lo tanto, la derivación de células endoteliales vasculares maduras, que recubren los lúmenes de los vasos sanguíneos, a partir de células madre pluripotentes humanas es crucial para una multitud de aplicaciones de ingeniería y regeneración de tejidos. In vivo, las células endoteliales primordiales se derivan del linaje mesodérmico y se especifican hacia subtipos específicos, incluidos arteriales, venosos, capilares, hemogénicos y linfáticos. Las células endoteliales hemogénicas son de particular interés porque, durante el desarrollo, dan lugar a células madre y progenitoras hematopoyéticas, que luego generan todos los linajes sanguíneos a lo largo de la vida. Por lo tanto, la creación de un sistema para generar células endoteliales hemogénicas in vitro proporcionaría una oportunidad para estudiar la transición endotelial a hematopoyética, y puede conducir a la producción ex vivo de productos sanguíneos humanos y una menor dependencia de donantes humanos. Si bien existen varios protocolos para la derivación de células endoteliales progenitoras y primordiales, no se ha descrito la generación de células endoteliales hemogénicas bien caracterizadas a partir de células madre humanas. Aquí, se presenta un método para la derivación de células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente 1 semana: un protocolo de diferenciación con células de raya primitivas formadas en respuesta al inhibidor de GSK3β (CHIR99021), luego inducción de linaje de mesodermo mediada por bFGF, seguida de desarrollo de células endoteliales primordiales promovidas por BMP4 y VEGF-A, y finalmente especificación de células endoteliales hemogénicas inducida por ácido retinoico. Este protocolo produce una población bien definida de células endoteliales hemogénicas que se pueden utilizar para comprender mejor su regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética, que tiene el potencial de aplicarse a aplicaciones terapéuticas posteriores.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son una población heterogénea de células que realizan múltiples funciones en todo el cuerpo humano y en tejidos diseñados. Además de apoyar y regular otros tipos de células (es decir, cardiomiocitos1, células osteoblásticas,2), estas funciones incluyen formar una barrera selectiva entre la sangre y los tejidos y ayudar en la formación de tejidos3. La diferenciación de CE maduras durante el desarrollo normal requiere diversas vías de señalización. Las CE primordiales se derivan de progenitores del mesodermo, y luego se especifican hacia fenotipos arteriales, venosos, capilares y linfáticos maduros4. Además, también se especifica que un pequeño subconjunto de CE en el saco vitelino extraembrionario y la región embrionaria de Aorta-Gónada-Meonefros (AGM) se conviertan en CE hemogénicas, que dan lugar a células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) que migran al hígado fetal y a la médula ósea fetal, donde permanecen postnatalmente y generan todos los tipos de células sanguíneas a lo largo de la vida4. La amplia gama de fenotipos EC es esencial para todo el desarrollo y mantenimiento de los tejidos.

Por lo tanto, las CE y sus derivados son componentes críticos de estudios dirigidos a modelar y dilucidar mecanismos de desarrollo humano y/o enfermedad, así como aplicaciones de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos 5,6,7,8. Sin embargo, la principal limitación para este tipo de estudios es la falta de disponibilidad de CE humanas primarias en la cantidad requerida. Se ha estimado que se requeriría un mínimo de 3 x 108 CE para la mayoría de las aplicaciones terapéuticas6. Para resolver este problema, se ha propuesto el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) debido a su diverso potencial de linaje y su capacidad para generar un gran número de progenie 6,9.

De hecho, la utilidad de las células derivadas de hESCs o hiPSCs ha sido demostrada en múltiples estudios centrados en el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos10,11,12. La tecnología Organ-on-a-Chip (OOC) se ha utilizado para recapitular más fielmente la fisiología del cuerpo humano mediante la integración de células y tejidos en andamios tridimensionales. Además, la conexión de múltiples OOC individuales (un llamado cuerpo o humano en un chip, BOC / HOC) se puede lograr a través de microfluídica para permitir la diafonía entre los órganos de interés13,14,15. Los tejidos de soporte, como la vasculatura, son componentes críticos de OOC y BOC / HOC; La incorporación de vasculatura permite el transporte de nutrientes, oxígeno y factores paracrinos a través de los tejidos, promoviendo así el microambiente específico del tejido requerido 3,12. Por lo tanto, los métodos para derivar CE humanas maduras, como las CE arteriales, venosas, linfáticas y hemogénicas, son cruciales para avanzar en estos enfoques de ingeniería de tejidos.

Se han publicado múltiples protocolos que detallan los pasos para la derivación de CE humanas primordiales o progenitoras de hESCs o hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Muchos de estos protocolos se basan en la formación del cuerpo embrioide (EB) o en el cocultivo de ESCs/iPSCs con una capa de alimentación murina de células del estroma. Estas estrategias tienden a ser difíciles y requieren mucho tiempo, con bajos rendimientos de EC y / o contaminación de EC humanas con células murinas. Los protocolos que se basan estrictamente en el cultivo 2D sin el uso de células estromales a menudo requieren inducciones largas, utilizan combinaciones complejas de factores de crecimiento y / o inhibidores para la inducción, tienen períodos de expansión prolongados después de la separación celular o una combinación de estos factores. El avance del conocimiento de las vías de señalización y los factores involucrados en la derivación de tipos maduros de EC in vivo proporciona la base para un protocolo de diferenciación in vitro sencillo y sólido.

Anteriormente, se identificaron roles clave para las vías de señalización de Notch y Ácido Retinoico (AR) en la especificación de CE arteriales murinas y hemogénicas, respectivamente, durante el desarrollo. La vía de señalización de Notch desempeña múltiples funciones en la especificación y el mantenimiento del fenotipo arterial de la CE. El trabajo que utilizó el modelo de vascularización retiniana murina identificó una vía en la que el esfuerzo cortante del líquido induce un eje de señalización Notch-Cx37-p27, promoviendo la detención del ciclo celular G1, lo que permite la especificación arterialde EC 27. Se ha planteado la hipótesis de que los estados del ciclo celular desempeñan un papel en las decisiones sobre el destino celular al proporcionar distintas ventanas de oportunidad en las que las células son receptivas a ciertas señales que pueden inducir la expresión génica y cambios fenotípicos28. Esta detención G1 mediada por Notch permitió la expresión de genes enriquecidos en CE arteriales, incluyendo ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 y Notch 4 (revisado en29,30). También se ha demostrado que la especificación hemogénica de EC se promueve in vivo a través de la señalización de AR31,32. Estudios adicionales identificaron que, aguas abajo de la señalización de AR, la expresión de c-Kit y Notch regula al alza p27, lo que permite la especificación hemogénica en el saco vitelino murino y AGM33. Las CE hemogénicas murinas pueden identificarse mínimamente por la expresión de marcadores endoteliales (es decir, CD31, KDR) y hematopoyéticos (es decir, c-Kit, CD34)4. Finalmente, las CE hemogénicas experimentan una transición endotelial-hematopoyética (EHT) para formar HSPC, que pueden dar lugar a todos los tipos de células sanguíneas 4,34,35.

Trabajos recientes probaron si esta misma jerarquía de señalización puede promover la especificación de EC hemogénica humana. Para ello, se desarrolló un protocolo de cultivo 2D sin suero y alimentador para derivar CE hemogénicas a partir de hESCs, y estas CE hemogénicas se caracterizaron a nivel de una sola célula como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. Este estudio también aprovechó el reportero Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), que identifica diferentes estados del ciclo celular, utilizando H9-hESCs que expresan el constructo del reportero FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. En estudios con estas células, se demostró que la AR promueve la detención temprana del ciclo celular G1 en las CE, y el estado temprano G1 permite la especificación hemogénica in vitro37. En este documento, se proporciona un protocolo detallado para la diferenciación de estas células endoteliales hemogénicas humanas y ensayos que confirman su identidad. Este método sencillo proporciona un medio útil para generar este subconjunto especializado de CE para futuros estudios de los mecanismos del desarrollo de las células sanguíneas humanas.

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Protocolo

1. Reactivos y preparación de reactivos

NOTA: Se proporciona una lista de reactivos en la Tabla de materiales.

  1. Obtener las líneas de células madre pluripotentes humanas: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    NOTA: La generación de CE hemogénicas puede ser más eficiente en la línea celular H1.
  2. Preparar las reservas de proteínas de la matriz: Alícuota de la proteína de la matriz en tubos prerefrigerados de 1,5 ml (sobre hielo) de modo que cada tubo contenga 1 mg de proteína de la matriz. 1 mg de proteína de matriz es suficiente para cubrir todos los pocillos de dos placas de 6 pocillos (12 pocillos en total). Conservar las alícuotas a -20 °C hasta su uso.
    NOTA: Realice todos los pasos que involucren proteína de la matriz en hielo o a 4 °C. Descongele el vial de material congelado de proteína de la matriz en hielo a 4 °C durante la noche. Una vez descongelado, agite el vial para asegurarse de que el contenido esté mezclado. Enfriar previamente los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml durante al menos 1 h a -20 °C y transferirlos al hielo inmediatamente antes de la alícuota.
  3. Preparar placas recubiertas de proteínas de la matriz: descongelar las alícuotas de proteínas de la matriz en hielo a 4 °C. Agregue 12.5 ml de DMEM: F12 helado a un tubo cónico preenfriado sobre hielo. Utilizando puntas de pipeta preenfriadas, transfiera una alícuota (1 mg) de proteína de matriz al tubo cónico y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Alícuota 1 ml de proteína de la matriz diluida en cada pocillo de placas de 6 pocillos preenfriadas (en hielo) utilizando una pipeta serológica preenfriada. Agite y balancee las placas para que todo el pozo esté cubierto uniformemente. Incubar las placas durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que la proteína de la matriz se solidifique. Envolver las placas con parafilm y conservar a 4 °C hasta su uso. Use placas recubiertas de proteína de matriz dentro de las 2 semanas posteriores a la preparación.
    NOTA: Utilice las placas de 6 pocillos recubiertas de proteínas de la matriz para el paso rutinario de las células y la diferenciación a células endoteliales primordiales y hemogénicas. Realice todos los pasos en hielo. Enfriar previamente las placas de 6 pocillos, las puntas de pipeta, las pipetas serológicas y los tubos cónicos antes de su uso durante al menos 1 h a -20 °C. Transfiera estos artículos al hielo cuando estén listos para usar.
  4. Prepare el medio de diferenciación de bases agregando 5 ml de PFHM a 100 ml de medio de diferenciación de células madre pluripotentes. Conservar a 4 °C.
  5. Preparar BSA-PBS al 0,1% disolviendo 0,1 g de BSA en 100 ml de PBS. Esterilizar el filtro BSA-PBS pasando a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
  6. Preparar 5 mM de HCl diluyendo HCl (12 M) 1:2.400 con agua. Ajuste el pH a 3.0 utilizando NaOH. Esterilizar la solución por filtro pasando a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
  7. Prepare existencias de bFGF, BMP4, VEGF-A, ácido retinoico (AR) y DLL4.
    1. bFGF: Reconstituir el polvo liofilizado a 100 μg/mL en BSA-PBS al 0,1%. Alícuota y conservar a -20 °C. Utilice las existencias de bFGF dentro de los 3 meses posteriores a la preparación. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
    2. BMP4: Reconstituir el polvo liofilizado a 1 mg/mL en HCl 5mM, pH 3.0. Diluir adicionalmente a 50 μg/ml en BSA-PBS al 0,1%. Alícuota y conservar a -20 °C. Utilice las existencias BMP4 dentro de los 3 meses posteriores a la preparación. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
    3. VEGF-A: Reconstituir el polvo liofilizado a 1 mg/mL en dH2O. Diluir adicionalmente a 100 μg/ml en BSA-PBS al 0,1%. Alícuota y conservar a -20 °C. Utilice las existencias de VEGF-A dentro de los 3 meses posteriores a la preparación. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
    4. RA: Reconstituir el polvo liofilizado a 100 mM en DMSO. Alícuota y conservar a -80 °C. Utilice las existencias de AR dentro de 1 mes de preparación. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
      NOTA: Proteja las existencias de AR de la luz.
    5. DLL4: Reconstituir el polvo liofilizado a 1 mg/mL en PBS. Alícuota y conservar a -20 °C. Utilice las existencias DLL4 dentro de los 12 meses posteriores a la preparación. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
  8. Preparar el medio de diferenciación celular endotelial inmediatamente antes de su uso diluyendo VEGF-A y BMP4 en medio de diferenciación de bases (paso 1.4) de modo que las concentraciones finales sean de 25 ng/ml y 50 ng/ml, respectivamente.
  9. Preparar la AR de trabajo inmediatamente antes de su uso diluyendo 100 mM de material 1:1.000 en DMSO a 100 μM.
    NOTA: Proteja la RA de trabajo de la luz.
  10. Preparar el medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas inmediatamente antes de su uso diluyendo VEGF-A, BMP4 y AR de trabajo en medio de diferenciación de bases (paso 1.4) de modo que las concentraciones finales sean de 25 ng/ml, 50 ng/ml y 0,5 μM, respectivamente.
  11. Prepare el tampón de tinción de anticuerpos haciendo HBSS que contenga 10% de FBS y complemente con reactivo antimicrobiano diluido 1:500. Filtre estéril el tampón y úselo inmediatamente.
  12. Prepare el tampón de clasificación celular haciendo HBSS que contenga 1% de FBS y complemente con reactivo antimicrobiano diluido 1:500. Filtre estéril el tampón y úselo inmediatamente.
  13. Prepare 1 mg/ml de existencias de fibronectina agregando 5 ml de agua estéril a 5 mg de fibronectina liofilizada. Alícuota y conservar a -20 °C. Utilice las existencias de fibronectina antes de la fecha de caducidad en la etiqueta del producto liofilizado. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
  14. Preparar los platos recubiertos de fibronectina de 35 mm. Diluir las reservas de fibronectina (1 mg/ml) a 4 μg/ml en agua estéril. Añadir 1 ml de esta solución de recubrimiento de fibronectina a cada plato e incubar a 37 °C durante 30 min a 1 h. Use los platos inmediatamente después del recubrimiento.
  15. Preparar 3 o 4 ml de alícuotas de medio a base de metilcelulosa siguiendo las instrucciones del fabricante. Conservar las alícuotas a -20 °C hasta su uso. Utilice las alícuotas del medio a base de metilcelulosa antes de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del producto en stock. Descongelar las alícuotas inmediatamente antes de su utilización.
  16. Preparar la solución de recubrimiento DLL4 diluyendo el stock de DLL4 humano recombinante hasta una concentración final de 10 μg/ml en PBS.
  17. Prepare y almacene el medio de crecimiento de células endoteliales de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  18. Prepare el tampón del análisis de citometría de flujo haciendo PBS que contenga 0.1% de BSA. Filtrar estéril el tampón y almacenar a 4 °C hasta su uso.

2. Cultivo celular y paso de hESCs

  1. Permita que las placas recubiertas de proteínas de la matriz, el medio de crecimiento de células madre y el DMEM: F12 se calienten a temperatura ambiente.
  2. Cultivar las líneas celulares hESC en medio de crecimiento de células madre (2 ml / pocillo) en placas de 6 pocillos recubiertas de proteínas de la matriz en una incubadora de 37 ° C, 5% de CO2 .
  3. Revise las células diariamente y retire las células diferenciadas según sea necesario raspándolas suavemente de la placa con una punta de pipeta p200.
    NOTA: Las células diferenciadas aparecerán en la periferia de las colonias. Consulte el manual del producto del medio de crecimiento de células madre para ver ejemplos de células diferenciadas en cultivo.
  4. Pasan las células una vez que alcanzan el 70%-80% de confluencia. Para pasar celdas, realice los pasos siguientes.
    NOTA: Las células deben dividirse antes de alcanzar una confluencia del 70% al 80% si se produce una mayor diferenciación.
    1. Retire el medio por encima de las células y lave suavemente con 1 ml de DMEM: F12 por pocillo.
    2. Agregue 1 ml de DMEM: F12 por pocillo.
    3. Añadir 160 μL/ml de Dispasa por pocillo e incubar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% durante 45 min.
    4. Después de la incubación de Dispase, agregue 1 ml adicional de DMEM: F12 por pocillo y pipete suavemente para levantar las células.
      NOTA: Evite disociar las células en una suspensión de una sola célula. Paso de las células como pequeños grumos.
    5. Transfiera las células a un tubo cónico que contenga 12 ml de DMEM: F12 y permita que las células se asienten por gravedad (~ 5-10 min).
    6. Retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet en 0,5 ml de medio de crecimiento de células madre por pocillo de células levantadas para obtener pequeños grupos de células.
      NOTA: Evite disociar las células en una suspensión de una sola célula. Paso de las células como pequeños grumos.
    7. Aspire la solución de recubrimiento de proteína de matriz de los pocillos de la placa recubierta de proteína de matriz preparada y agregue 1.5 ml del medio de crecimiento de células madre por pocillo.
    8. Añadir el volumen deseado de células resuspendidas (paso 2.4.6) a cada pocillo de la placa recubierta de proteínas de la matriz preparada.
    9. Incubar la placa en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Cambie el medio cada 24 h a un medio de crecimiento de células madre frescas.

3. Diferenciación de hESCs a células endoteliales primordiales

  1. Día -1: Cultivo y paso de las células como se describe anteriormente en la sección 2. Sembrar las células (paso 2.4.6) en grupos pequeños (~50 μm) a una densidad de aproximadamente 2 grupos por centímetro cuadrado38.
    NOTA: Evalúe la densidad de la semilla y refine empíricamente si es necesario.
  2. Día 0: 24 h después de sembrar las células, aspirar el medio de cada pocillo y lavar suavemente las células con 1 mL DMEM:F12 por pocillo. Añadir 1 ml del medio de diferenciación de bases que contiene 5 μM GSK3i (CHIR99021, añadido fresco) a cada pocillo e incubar durante 24 h (37 °C, 5% deCO2).
    NOTA: Para todos los pasos de lavado, agregue lentamente el medio de lavado indicado a la placa pipeteando contra la pared del pozo de la placa. Agite suavemente la placa para que toda la superficie del pozo esté cubierta por medios de lavado. Incline ligeramente la placa de modo que los medios de lavado se acumulen en la posición de las seis en punto y aspire cuidadosamente los medios de lavado.
  3. Día 1: Aspirar el medio de cada pocillo y lavar suavemente las células con 1 ml de DMEM: F12 por pocillo. Añadir 1 ml del medio de diferenciación base que contenga 50 ng/ml de bFGF (añadido fresco, 1:2.000 de material congelado) a cada pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  4. Día 2: Aspirar el medio de cada pocillo y lavar suavemente las células con 1 ml de DMEM: F12 por pocillo. Añadir 1 mL del medio de diferenciación celular endotelial a cada pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  5. Día 3: Reemplazar el medio por encima de las células con 1 ml de medio de diferenciación celular endotelial recién preparado por pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  6. Día 4: Reemplazar el medio por encima de las células con 1 mL de medio de diferenciación de células endoteliales recién preparado por pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  7. Día 5: Los FACS purifican las células para evaluar el fenotipo EC (secciones 4-5) o mantenerlas en cultivo y diferenciarse hacia células endoteliales hemogénicas (sección 6).

4. Purificación FACS de células endoteliales primordiales

  1. Aspirar el medio por encima de las células y lavar suavemente una vez con 1 ml de DMEM: F12 por pocillo.
  2. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular por pocillo e incubar las células durante 12 min en una incubadora deCO2 al 57 °C, o hasta que las células se hayan disociado.
  3. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico que contenga 12 ml de DMEM: F12 y pellet por centrifugación durante 5 min, 1,000 x g.
  4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 12 ml de DMEM:F12 para lavar.
  5. Granular las células por centrifugación durante 5 min, 1.000 x g.
  6. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en un tampón de tinción de anticuerpos helado y cuente las células. Ajustar la concentración usando tampón de tinción de anticuerpos helados a 1 x 105 células/ml.
  7. Dividir las células uniformemente en tubos de microcentrífuga en hielo, cada uno con un mínimo de 600 μL de células a 1 x 105 células/ml, para la tinción de anticuerpos.
    NOTA: Se requieren cuatro tubos de células para la tinción de los CE primordiales: control no teñido, control de anticuerpos únicos CD31, control de anticuerpos únicos CD45 y muestra que contiene anticuerpos CD31 y CD45. La información sobre los anticuerpos se proporciona en la Tabla de materiales.
  8. Agregue anticuerpos a los tubos que contienen células, según corresponda, e incube en hielo y protegido de la luz durante 30 minutos.
    1. Control no teñido: No agregue ningún anticuerpo.
    2. Control de anticuerpos CD31 únicos: agregue solo el anticuerpo CD31.
    3. Control de anticuerpos CD45 únicos: agregue solo el anticuerpo CD45.
    4. Muestra: Agregue anticuerpos CD31 y CD45.
      NOTA: La concentración final de anticuerpos en la muestra, así como los conjugados fluorescentes, deben optimizarse en función de los anticuerpos específicos y el clasificador celular utilizado.
  9. Granular las células por centrifugación en una microcentrífuga de mesa a 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
  10. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 600 μL de tampón de clasificación helada.
  11. Colar las muestras a través de las tapas de filtro de malla de tubos FACS de 5 ml y almacenar las células en hielo, protegidas de la luz, para un FACS inmediato.
  12. Obtener células endoteliales primordiales (CD31+ CD45-), realizando los siguientes pasos.
    1. Identificar la población de células CD45 negativas y la puerta (CD45-).
    2. Dentro de (CD45-), identifique la población de células CD31 positivas (CD31+) y clasifique las células en 6 ml de tampón de clasificación de células heladas. Utilice estas celdas para aplicaciones posteriores (consulte la sección 5).

5. Ensayo para confirmar el fenotipo de las células endoteliales primordiales

  1. Cubra tres pocillos de una placa de 6 pocillos con una solución de recubrimiento DLL4 de 1 ml/pocillo durante 30 min en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Como control, cubra los otros tres pocillos de la placa con 1 ml / pocillo de PBS.
  2. Aspirar la solución de recubrimiento DLL4 y PBS, y colocar en placa 25.000 células endoteliales primordiales clasificadas (ver paso 4.12) en 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales por pocillo.
  3. Incubar las células durante 24 h en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 .
  4. Aspirar el medio por encima de las células y lavar una vez con 2 mL/pocillo PBS. Analizar las células mediante qPCR o citometría de flujo (para células que expresan la construcción FUCCI).
    1. Para analizar las células por qPCR, realice los siguientes pasos.
      1. Aspirar el líquido por encima de las células y aislar el ARN en las células utilizando un kit de extracción de ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      2. Realice reacciones de transcripción inversa con una mezcla maestra de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      3. Realice reacciones de qPCR con una mezcla maestra SYBR Green de acuerdo con el protocolo del fabricante.
        NOTA: Los cebadores utilizados (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) se enumeran en la Tabla 1.
    2. Para analizar las células que expresan la construcción FUCCI por citometría de flujo, realice los siguientes pasos.
      1. Aspirar el líquido por encima de las células y añadir 500 μL/pocillo de tripsina-EDTA al 0,25%.
      2. Incubar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% hasta que se levanten, ~5 min.
      3. Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga y granule las células en una microcentrífuga de 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
      4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón de análisis de citometría de flujo helado.
      5. Colar las muestras a través de la tapa del filtro de malla de un tubo FACS de 5 ml y almacenar las células en hielo, protegidas de la luz, para un análisis de citometría de flujo inmediato.
      6. Analice el porcentaje de células plateadas en el control DLL4 frente al PBS en G1 temprano (sin color), G1 tardío (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) y S/G2/M (mCherry-/mVenus+).

6. Diferenciación de hESCs a células endoteliales hemogénicas

NOTA: Diferenciar las células a las CE primordiales del día 4, como se describe anteriormente en las secciones 3.1-3.6.

  1. Día 5: Aspirar el medio por encima de las células y lavar suavemente las células con 1 ml de DMEM: F12 por pocillo. Añadir 1 ml de medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas recién preparado por pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  2. Día 6: Reemplazar el medio por encima de las células con 1 ml de medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas recién preparado por pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  3. Día 7: Reemplazar el medio por encima de las células con 1 ml de medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas recién preparado por pocillo e incubar 24 h (37 °C, 5%CO2).
  4. Día 8: El FACS aísla células endoteliales hemogénicas (ver sección 7).

7. Aislamiento FACS de células endoteliales hemogénicas

  1. Levantar y lavar las células como se ha descrito anteriormente en las secciones 4.1-4.6.
  2. Dividir las células uniformemente en tubos de microcentrífuga en hielo, cada uno con un mínimo de 600 μL de células a 1 x 105 células/ml, para la tinción de anticuerpos.
    NOTA: Se requieren ocho tubos de células para la tinción de anticuerpos de CE hemogénicos: control no teñido, control de anticuerpos únicos CD31, control de anticuerpos únicos CD45, control de anticuerpos únicos KDR, control de anticuerpos únicos c-Kit, control de anticuerpos únicos CD34, control de anticuerpos únicos VE-cadherina y muestra que contiene los seis anticuerpos.
    NOTA: La información de anticuerpos se proporciona en la Tabla de materiales.
  3. Agregue anticuerpos a los tubos que contienen células, según corresponda, e incube en hielo y protegido de la luz durante 30 minutos.
    1. Control sin teñir: No agregue anticuerpos.
    2. Control de anticuerpos CD31 únicos: agregue solo el anticuerpo CD31.
    3. Control de anticuerpos CD45 únicos: agregue solo el anticuerpo CD45.
    4. Control de anticuerpos únicos KDR: agregue solo el anticuerpo KDR.
    5. Control de anticuerpos únicos c-Kit: Agregue solo el anticuerpo c-Kit.
    6. Control de anticuerpos CD34 únicos: agregue solo el anticuerpo CD34.
    7. Control de anticuerpos únicos contra la cadherina VE: agregue solo el anticuerpo VE-cadherina.
    8. Muestra: Agregue anticuerpos CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 y VE-cadherina.
      NOTA: La concentración final de anticuerpos en la muestra, así como los conjugados fluorescentes, deben optimizarse en función de los anticuerpos específicos y el clasificador celular utilizado.
  4. Granular las células por centrifugación en una microcentrífuga a 4 °C durante 5 min a 1.000 x g.
  5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 600 μL de tampón de clasificación helada.
  6. Colar las muestras a través de la tapa del filtro de malla de tubos FACS de 5 ml y almacenar las células en hielo, protegidas de la luz, para un FACS inmediato.
  7. Para obtener células endoteliales hemogénicas (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-), realice los siguientes pasos.
    1. Identificar la población de células CD45- y la puerta (CD45-).
    2. Dentro de (CD45-), identifique la población de células CD31+ y la puerta (CD31+).
    3. Dentro de (CD31+), identifique la población de células VE-Cadherin- y la puerta (CDH5-).
    4. Dentro de (CDH5-), identifique la población y la puerta de células c-Kit+ (KIT+).
    5. Dentro de (KIT+), identifique la población de células CD34+ y la puerta (CD34+).
    6. Dentro de (CD34+), identifique y clasifique las células KDR+ en 6 ml de tampón de clasificación de células heladas. Utilice estas celdas en aplicaciones posteriores (consulte la sección 8).

8. Ensayo de unidad formadora de colonias

  1. Descongelar las alícuotas de medio a base de metilcelulosa siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Una alícuota de 3 ml es suficiente para dos muestras y una alícuota de 4 ml es suficiente para tres muestras.
  2. Contar las células endoteliales hemogénicas clasificadas obtenidas en el paso 7.7.
  3. Siguiendo las instrucciones del fabricante, calcule el volumen de células clasificadas para agregar a cada medio alícuota a base de metilcelulosa para que cada muestra contenga un mínimo de 1,000 células endoteliales hemogénicas.
    NOTA: El número de celdas se puede ajustar según sea necesario.
  4. Agregue el volumen calculado de células al medio alícuota a base de metilcelulosa y al vórtice a fondo. Deje que los cultivos medios a base de metilcelulosa reposen a temperatura ambiente durante 10 minutos, o hasta que las burbujas se disipen.
  5. Aspire la solución de recubrimiento de fibronectina de los platos preparados de 35 mm. Siguiendo las instrucciones del fabricante, dispensar 1 ml de cultivo de medio a base de metilcelulosa por plato de 35 mm. Gire suavemente el plato para distribuir uniformemente el cultivo.
  6. Coloque estos platos de 35 mm, así como dos platos adicionales de 35 mm llenos de agua estéril, dentro de un plato de cultivo de tejidos de 15 cm.
  7. Incubar los cultivos en una incubadora deCO2 a 37 °C, al 5%, y observar los cultivos los días 8 y 14.
    1. El día 8, cuente las colonias CFU-E y BFU-E.
    2. El día 14, cuente las colonias CFU-GM y CFU-GEMM.
      NOTA: Consulte el manual de medios a base de metilcelulosa para la identificación morfológica de los tipos de colonias.

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Resultados

En la Figura 1 se muestra un esquema que describe la especificación de las CE primordiales y las CE hemogénicas de las hESCs, y una imagen representativa de las células 24 h después del recubrimiento. Después de la especificación, los CE primordiales y los CE hemogénicos se purifican con FACS en los días 5 y 8, respectivamente. Las CE primordiales se definen como CD31+ CD45- y las CE hemogénicas se definen como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherina-...

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Discusión

En este documento, se describen los pasos para producir células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente 1 semana utilizando un sistema de cultivo 2D sin alimentador murino y suero (Figura 1). Este protocolo amplía un método descrito por Sriram et al. (2015) para obtener CE primordiales38. La naturaleza primordial y el potencial de especificación de los CD31+ CD45- EC se demuestra cultivando estas...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente apoyado por las subvenciones de los NIH HL128064 y U2EB017103. El apoyo adicional fue proporcionado por CT Innovations 15-RMB-YALE-04 subvención.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de 15 cmCorning430599tratamiento con cultivo de tejidos
Placas de 35 mmCorning430165tratamiento con cultivo
de 6 pocillosCorning3516tratamiento con cultivo
de tejidos Reactivo antimicrobiano
Marca: Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR& Sistemas D233-FB-025uso a 50 ng/mL
BMP4BioLegend595202uso a 25 ng/mL
Albúmina sérica bovina (BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Cell Detatchment Solution
Marca: Accutase		Stemcell Technologies7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
DispasaStemcell Technologies7913
DLL4R& D sistemas1506-D4/CFhumano recombinante; uso a 10 μ g/mL
DMEM:F12Gibco11320-033
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco< 14190144
Medio de crecimiento de células endotelialesbr/> Marca: EGM-2 Endotelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)Tubos LonzaCC-3162
FACSredondo de poliestireno 352235 Corning con tapa
de filtroSuero Fetal Bovino (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectinaThermoFisher Scientific33016015uso a 4 μ g/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM de culata; uso a 5 μ M
Hanks Solución salina equilibrada (HBSS)Gibco14175-095
Ácido clorhídrico (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Proteína de matriz 
Marca: Matrigel		Corning356230Factor de crecimiento reducido. Consulte el Certificado de análisis del lote para determinar la concentración de proteína (Matrigel). Esta concentración es necesaria para calcular el volumen de Matrigel que contiene 1 mg de proteína.
Medio a base de metilcelulosa
Marca: MethoCult H4435 Tecnologías		células madre4435
Medio de diferenciación de células madre pluripotentes
Nombre de la marca: STEMdiff APEL 2		Tecnologías de células madre5270
Células madre pluripotentes: H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)humano; H9-FUCCI se obtuvieron del laboratorio del Dr. Ludovic Vallier en el Instituto de Células Madre de Cambridge
Medio de hibridomas sin proteínas (PFMH)Gibco12040077
Ácido retinoicoSigma AldrichR2625-50 mguso a 0,5 μ M
Transcripción inversa master mix
Marca: iScript Transcripción inversa Supermix		BioRad1708840
kit de extracción de ARN
Marca: RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
Hidróxido de sodio (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
Medio de crecimiento de células madre
Marca: mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Mezcla maestra verde
Marca: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
Trypsin-EDTAGibco252999560.25%
VEGF165 (VEGF-A)PeproTech100-20uso a 50 ng/mL
α-CD31-FITCBioLegend3031042 μ g/mL*
α-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 μ g/mL*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 μ g/mL*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μ g/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μ g/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μ g/mL*
* Los conjugados fluorescentes de anticuerpos deben optimizarse en función del clasificador de células utilizado. A continuación se presentan las concentraciones finales utilizadas en este estudio.
de tejidos Placas Fondo de enriquecidas

Referencias

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