Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Resumen

Los vasos sanguíneos están distribuidos ubicuamente dentro de todos los tejidos del cuerpo y realizan diversas funciones. Por lo tanto, la derivación de células endoteliales vasculares maduras, que recubren los lúmenes de los vasos sanguíneos, a partir de células madre pluripotentes humanas es crucial para una multitud de aplicaciones de ingeniería y regeneración de tejidos. In vivo, las células endoteliales primordiales se derivan del linaje mesodérmico y se especifican hacia subtipos específicos, incluidos arteriales, venosos, capilares, hemogénicos y linfáticos. Las células endoteliales hemogénicas son de particular interés porque, durante el desarrollo, dan lugar a células madre y progenitoras hematopoyéticas, que luego generan todos los linajes sanguíneos a lo largo de la vida. Por lo tanto, la creación de un sistema para generar células endoteliales hemogénicas in vitro proporcionaría una oportunidad para estudiar la transición endotelial a hematopoyética, y puede conducir a la producción ex vivo de productos sanguíneos humanos y una menor dependencia de donantes humanos. Si bien existen varios protocolos para la derivación de células endoteliales progenitoras y primordiales, no se ha descrito la generación de células endoteliales hemogénicas bien caracterizadas a partir de células madre humanas. Aquí, se presenta un método para la derivación de células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente 1 semana: un protocolo de diferenciación con células de raya primitivas formadas en respuesta al inhibidor de GSK3β (CHIR99021), luego inducción de linaje de mesodermo mediada por bFGF, seguida de desarrollo de células endoteliales primordiales promovidas por BMP4 y VEGF-A, y finalmente especificación de células endoteliales hemogénicas inducida por ácido retinoico. Este protocolo produce una población bien definida de células endoteliales hemogénicas que se pueden utilizar para comprender mejor su regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética, que tiene el potencial de aplicarse a aplicaciones terapéuticas posteriores.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son una población heterogénea de células que realizan múltiples funciones en todo el cuerpo humano y en tejidos diseñados. Además de apoyar y regular otros tipos de células (es decir, cardiomiocitos¹, células osteoblásticas,²), estas funciones incluyen formar una barrera selectiva entre la sangre y los tejidos y ayudar en la formación de tejidos³. La diferenciación de CE maduras durante el desarrollo normal requiere diversas vías de señalización. Las CE primordiales se derivan de progenitores del mesodermo, y luego se especifican hacia fenotipos arteriales, venosos, c....

Protocolo

1. Reactivos y preparación de reactivos

NOTA: Se proporciona una lista de reactivos en la Tabla de materiales.

1. Obtener las líneas de células madre pluripotentes humanas: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
   NOTA: La generación de CE hemogénicas puede ser más eficiente en la línea celular H1.
2. Preparar las reservas de proteínas de la matriz: Alícuota de la proteína de la matriz en tubos prerefrigerados de 1,5 ml (sobre hielo) de modo que cada tubo contenga 1 mg de proteína de la matriz. 1 mg de proteína de matriz es suficiente para cubrir todos los pocillos de dos placas de 6 pocillos (12 pocillos en total). Conserv....

Resultados

En la Figura 1 se muestra un esquema que describe la especificación de las CE primordiales y las CE hemogénicas de las hESCs, y una imagen representativa de las células 24 h después del recubrimiento. Después de la especificación, los CE primordiales y los CE hemogénicos se purifican con FACS en los días 5 y 8, respectivamente. Las CE primordiales se definen como CD31+ CD45- y las CE hemogénicas se definen como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34⁺ VE-Cadherina-.......

Discusión

En este documento, se describen los pasos para producir células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente 1 semana utilizando un sistema de cultivo 2D sin alimentador murino y suero (Figura 1). Este protocolo amplía un método descrito por Sriram et al. (2015) para obtener CE primordiales³⁸. La naturaleza primordial y el potencial de especificación de los CD31⁺ CD45^- EC se demuestra cultivando estas.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de 15 cm	Corning	430599	tratamiento con cultivo de tejidos
Placas de 35 mm	Corning	430165	tratamiento con cultivo
de 6 pocillos	Corning	3516	tratamiento con cultivo
de tejidos Reactivo antimicrobiano Marca: Normocin	Invitrogen	ant-nr-1
bFGF	R& Sistemas D	233-FB-025	uso a 50 ng/mL
BMP4	BioLegend	595202	uso a 25 ng/mL
Albúmina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-1
Cell Detatchment Solution Marca: Accutase	Stemcell Technologies	7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-100mL
Dispasa	Stemcell Technologies	7913
DLL4	R& D sistemas	1506-D4/CF	humano recombinante; uso a 10 μ g/mL
DMEM:F12	Gibco	11320-033
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco		< 14190144
Medio de crecimiento de células endotelialesbr/> Marca: EGM-2 Endotelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)	Tubos Lonza	CC-3162
FACS	redondo de poliestireno 352235 Corning con tapa
de filtroSuero Fetal Bovino (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fibronectina	ThermoFisher Scientific	33016015	uso a 4 μ g/cm2
GSK3i/CHIR99021	Stemgent	04-0004-02	10 mM de culata; uso a 5 μ M
Hanks Solución salina equilibrada (HBSS)	Gibco	14175-095
Ácido clorhídrico (HCl)	Fisher Scientific	A144S-500
Proteína de matriz  Marca: Matrigel	Corning	356230	Factor de crecimiento reducido. Consulte el Certificado de análisis del lote para determinar la concentración de proteína (Matrigel). Esta concentración es necesaria para calcular el volumen de Matrigel que contiene 1 mg de proteína.
Medio a base de metilcelulosa Marca: MethoCult H4435 Tecnologías	células madre	4435
Medio de diferenciación de células madre pluripotentes Nombre de la marca: STEMdiff APEL 2	Tecnologías de células madre	5270
Células madre pluripotentes: H1, H9, H9-FUCCI	WiCell	WA09 (H9), WA01 (H1)	humano; H9-FUCCI se obtuvieron del laboratorio del Dr. Ludovic Vallier en el Instituto de Células Madre de Cambridge
Medio de hibridomas sin proteínas (PFMH)	Gibco	12040077
Ácido retinoico	Sigma Aldrich	R2625-50 mg	uso a 0,5 μ M
Transcripción inversa master mix Marca: iScript Transcripción inversa Supermix	BioRad	1708840
kit de extracción de ARN Marca: RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Hidróxido de sodio (NaOH)	Fisher Scientific	SS255-1
Medio de crecimiento de células madre Marca: mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
SYBR Mezcla maestra verde Marca: iTaq Universal SYBR Green Master Mix	BioRad	1725121
Trypsin-EDTA	Gibco	25299956	0.25%
VEGF165 (VEGF-A)	PeproTech	100-20	uso a 50 ng/mL
α-CD31-FITC	BioLegend	303104	2 μ g/mL*
α-CD34-Pacific Blue	BioLegend	343512	2 μ g/mL*
α-CD45-APC/Cy7	BioLegend	304014	2 μ g/mL*
α-c-Kit-APC	BioLegend	313206	2 μ g/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7	BioLegend	359911	2 μ g/mL*
α-VE-Cadherin-PE	BioLegend	348506	2 μ g/mL*
* Los conjugados fluorescentes de anticuerpos deben optimizarse en función del clasificador de células utilizado. A continuación se presentan las concentraciones finales utilizadas en este estudio.