Artículo de método

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

DOI:

10.3791/62393

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14 de mayo de 2021

 ,  ,  , 
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La unión covalente de la ubiquitina (Ub) a los residuos internos de lisina de una proteína de sustrato, un proceso denominado ubiquitilación, representa una de las modificaciones post-traduccionales más importantes en los organismos eucariotas. La ubiquitilación está mediada por una cascada secuencial de tres clases de enzimas, incluidas las enzimas activadoras de ubiquitina (enzimas E1), las enzimas conjugantes de ubiquitina (enzimas E2) y las ligasas de ubiquitina (enzimas E3) y, a veces, los factores de elongación de la cadena de ubiquitina (enzimas E4). Aquí, se proporcionan protocolos in vitro para ensayos de ubiquitilación, que permiten la evaluación de la actividad de la ubiquitina ligasa E3, la cooperación entre pares E2-E3 y la selección de sustratos. Los pares E2-E3 que cooperan se pueden detectar mediante el monitoreo de la generación de cadenas libres de poli-ubiquitina y / o la auto-ubiquitilación de la ligasa E3. La ubiquitilación del sustrato se define por la unión selectiva de la ligasa E3 y puede detectarse mediante western blotting de la reacción in vitro. Además, se describe un ensayo de descarga E2 ~ Ub, que es una herramienta útil para la evaluación directa de la cooperación funcional E2-E3. Aquí, la transferencia de ubiquitina dependiente de E3 se sigue desde la enzima E2 correspondiente a aminoácidos de lisina libre (imitando la ubiquitilación del sustrato) o lisinas internas de la propia ligasa E3 (auto-ubiquitilación). En conclusión, se proporcionan tres protocolos in vitro diferentes que son rápidos y fáciles de realizar para abordar la funcionalidad catalítica de la ligasa E3.

Introducción

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La ubiquitilación es el proceso por el cual Ub se une covalentemente a una proteína de sustrato1. La modificación de Ub es catalizada por sucesivas reacciones enzimáticas que involucran la acción de tres clases diferentes de enzimas, es decir,enzimas activadoras de Ub (E1s), enzimas conjugantes de Ub (E2s), ligasas de Ub (E3s) y posiblemente factores de elongación de la cadena ub (E4s)2,3,4,5. Después de la activación dependiente de trifosfato de adenosina (ATP) y magnesio (Mg2+)de Ub por E1, la cisteína del sitio activo de E1 ataca la glicina C-terminal de Ub, formando un complejo tioéster (Ub ~ E1). La energía extraída de la hidrólisis de ATP hace que el Ub alcance un estado de transición de alta energía, que se mantiene a lo largo de la siguiente cascada de enzimas. A continuación, la enzima E2 transfiere el Ub activado a su cisteína catalítica interna, formando así un enlace tioéster Ub ~ E2 transitorio. Posteriormente, Ub se transfiere a la proteína del sustrato.

Esto se puede hacer de dos maneras. La ligasa E3 puede unirse primero a E2, o la ligasa E3 puede unirse directamente a Ub. Esta última forma da como resultado la formación de un intermedio E3 ~ Ub. En cualquier caso, Ub está unido a la proteína sustrato mediante la formación de un enlace isopéptido entre el grupo carboxilo C-terminal de Ub y el grupo lisina Ɛ-amino del sustrato6. El genoma humano codifica dos E1, aproximadamente 40 E2, y más de 600 ligasas de ubiquitina putativas7. Sobre la base del mecanismo de transferencia ub del E3, las ligasas de Ub se dividen en tres categorías que involucran ligasas homólogas a E6AP C-Terminus (HECT), really interesting New Gene (RING)/U-box-type y RING entre ligasas de tipo RING (RBR)8. En este estudio, la caja U que contiene ligasa, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), se utiliza como una enzima E3 representativa. En contraste con las enzimas E3 de tipo HECT que forman tioésteres Ub ~ E3, el dominio U-box de CHIP se une a E2 ~ Ub y promueve la posterior transferencia Ub / sustrato directamente desde la enzima E28,9. Basado en la importancia de la U-box para la función enzimática, un mutante chip U-box inactivo, CHIP(H260Q), se utiliza como control. CHIP(H260Q) no se une a sus E2 cognados, perdiendo así su actividad de ligasa E310.

La ubiquitilación de proteínas juega un papel crucial en la regulación de una multitud de eventos celulares en las células eucariotas. La diversidad de resultados celulares que son promovidos por la unión reversible de las moléculas de Ub a las proteínas de sustrato se puede atribuir a las características moleculares de Ub. Como la propia Ub contiene siete residuos de lisina (K) para una mayor ubiquitilación, existe una rica variedad de tipos de cadenas de Ub con diferentes tamaños y/o topologías11. Por ejemplo, los sustratos pueden ser modificados por una sola molécula de Ub en una (mono-ubiquitilación) o múltiples lisinas (multi mono-ubiquitilación), e incluso por cadenas de Ub (poli-ubiquitilación)11. Las cadenas de Ub se forman homo o heterotípicamente a través de los mismos o diferentes residuos de lisina de Ub, lo que incluso podría dar lugar a cadenas de Ub ramificadas9. Por lo tanto, la ubiquitilación de proteínas conduce a diversos arreglos de moléculas de Ub que proporcionan información específica, por ejemplo,para la degradación, activación o localización de proteínas conjugadas12,13. Estas diferentes señales Ub permiten una reprogramación rápida de las vías de señalización celular, que es un requisito importante para la capacidad de la célula para responder a las necesidades ambientales cambiantes.

Un aspecto central de la ubiquitilación está relacionado con el control de calidad de las proteínas. Las proteínas mal plegadas o dañadas irreversiblemente deben ser degradadas y reemplazadas por proteínas recién sintetizadas para mantener la homeostasis o proteostasis de las proteínas14. La ligasa E3 de control de calidad, CHIP, colabora con chaperonas moleculares en la degradación dependiente de Ub de proteínas dañadas9,15,16,17. Aparte de eso, CHIP regula la estabilidad de la chaperona dirigida por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que está estrechamente coordinada con la función muscular y las desviaciones de los niveles óptimos conducen a la miopatía humana18,19,20,21. La degradación de UNC-45B por el proteasoma 26S está mediada por la unión de una cadena poli-Ub ligada a K489. En ausencia de proteínas de sustrato, CHIP realiza la auto-ubiquitilación10,22,23,que es característica de las ligasas de ubiquitina RING/U-box E324,25 y se considera que regula la actividad de la ligasa26. La aplicación de los métodos de ensayo de ubiquitilación in vitro descritos en este artículo ayudó a identificar sistemáticamente las enzimas E2 que se asocian con CHIP para promover la formación de cadenas libres de poli-Ub y / o la auto-ubiquitilación de CHIP (protocolo sección 2). Además, se observó ubiquitilación dependiente de CHIP de UNC-45B, que es un sustrato conocido de la ligasa E318,19 (protocolo sección 3). En última instancia, se monitorizó la transferencia dependiente de CHIP de Ub activado desde el tioéster Ub~E2 (sección 4 del protocolo).

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Protocolo

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1. Preparación de tampones y reactivos

NOTA: Los tampones y reactivos que se prepararon manualmente en el laboratorio se enumeran a continuación. Todos los demás tampones y reactivos utilizados en los protocolos se compraron de diferentes fuentes y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

  1. Prepare 10x solución salina tamponada con fosfato (10x PBS). Para este propósito, mezcle 1.37 M de cloruro de sodio (NaCl), 27 mM de cloruro de potasio (KCl), 80 mM de dihidrato de hidrógeno-fosfato disódico (Na2HPO4.2H2O) y 20 mM de fosfato de potasio-dihidrógeno (KH2PO4) en 1 L de H2O de doble destilación (ddH2O). Autoclave el PBS 10x y prepare una solución de PBS 1x en ddH2O.
    1. El autoclave se realiza durante 15 min a 121 °C y 98,9 kPa.
      NOTA: El autoclave se lleva a cabo en estas condiciones para todos los búferes y soluciones. Si no se indica lo contrario, las soluciones se almacenan a temperatura ambiente (RT).
  2. Prepare 1 L de solución PBS-Tween (PBS-T) agregando 0.1% Tween a 1 L de 1x PBS.
  3. Preparar 10 ml de una solución madre de L-lisina de 0,5 M disolviendo L-lisina en ddH2O. Alícuota de L-lisina en porciones de 1 ml, y almacenarlas a -20 °C hasta su uso posterior.
    NOTA: La L-lisina se puede congelar y descongelar repetidamente.
  4. Preparar una solución de ácido tetra acético (EDTA) de etileno diamina de 0,25 M disolviendo EDTA en 200 mL de ddH2O.
    1. Ajuste el pH a 8.0 con hidróxido de sodio (NaOH).
    2. Ajuste el volumen a 250 ml con ddH2O.
    3. Autoclave la solución.
  5. Preparar 10 ml de una solución de albúmina sérica bovina (BSA) de 20 mg/ml disolviendo BSA en ddH2O. Conservar a -20 °C en alícuotas de 200 μL.
    NOTA: BSA se puede congelar y descongelar repetidamente.
  6. Prepare 1 L de ácido 2-(N-morfolino)etano sulfónico (MES) ejecutando tampón disolviendo 50 mM MES, 50 mM base Tris, 3.47 mM dodecil sulfato de sodio (SDS) y 1.03 mM EDTA en 0.9 L de ddH2O. Después de mezclar correctamente, ajuste el volumen a 1 L.
    1. El pH del tampón 1x es 7.6. No ajuste el pH con ácido o base.
  7. Prepare 200 ml de solución bloqueadora (5% de leche) disolviendo 10 g de leche en polvo en 1x PBS-T. Guarde la solución de bloqueo a 4 °C durante un máximo de una semana.
  8. Prepare 1 L de tampón de transferencia (consulte la Tabla de materiales) deacuerdo con las instrucciones del fabricante.
  9. Prepare 2x tampón de muestra SDS disolviendo 125 mM de base Tris, 4% SDS, 4% de glicerol, 0.03% de azul de bromofenol y 50 μL / ml de β-mercaptoetanol en 50 mL ddH2O. Alícuota en porciones de 1 ml y guárdela a -20 ° C hasta su uso.

2. Ensayo de auto-ubiquitilación in vitro

  1. Preparación y ejecución de ensayos
    1. Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción en función de las molaridades dadas de las proteínas y las concentraciones de proteínas de las soluciones proteicas. Por reacción de auto-ubiquitilación, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 y 50 μM Ub. Ajuste el volumen de la reacción a 20 μL con ddH2O.
      NOTA: La solución de ATP y el búfer de ubiquitilación se compraron como soluciones de stock 10x y se utilizaron a 1x.
    2. Prepare un esquema de pipeteo para todas las reacciones. Pruebe nueve enzimas E2 diferentes para determinar su capacidad para funcionar (I) con CHIP, (II) con un mutante CHIP (H260Q) catalíticamente inactivo y (III) sin CHIP en reacciones de ubiquitilación individuales.
    3. Para evitar errores de pipeteo, prepare una mezcla maestra sobre hielo que contenga el volumen requerido para todas las reacciones más una reacción adicional. Calcule la cantidad de mezcla maestra requerida por reacción.
      NOTA: Los componentes de la mezcla maestra son reactivos que son igualmente necesarios para cada reacción, es decir,E1, E3, Ub, ATP y tampón de ubiquitilación.
    4. Agregue ddH2O y mezcla maestra a los tubos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mantenga los tubos en hielo.
    5. Antes de iniciar las reacciones de ubiquitilación añadiendo las enzimas E2, configure un termociclador pcr con el siguiente programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.
    6. Añadir 1 μM de las enzimas E2 en los tubos respectivos, e incubar las muestras en el termociclador de PCR durante el período de tiempo indicado.
    7. Después de 2 h, agregue el búfer de muestra SDS a cada reacción y mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
      NOTA: El volumen requerido del tampón de muestra depende de la concentración de existencias del tampón de muestra. Aquí, se agregaron 20 μL de tampón de muestra SDS 2x a cada reacción.
    8. Hervir las muestras inmediatamente a 95 °C durante 5 min, y continuar con la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Conservar las proteínas desnaturalizadas a -20 °C.
  2. Electroforesis en gel y western blot
    1. Después de la descongelación, gire las muestras durante aproximadamente 10 s y cargue el gel SDS-PAGE. Utilice una escalera de proteínas como referencia de tamaño.
      NOTA: Aquí, se utilizaron geles de gradiente Bis-Tris al 4-12% y 3 μL de escalera de proteínas. Divida los volúmenes de muestra y cargue dos geles por igual utilizando 20 μL de cada muestra.
    2. Ejecute el gel a 160-200 V durante aproximadamente 30-45 minutos para que el frente de la muestra llegue a la parte inferior del gel.
    3. Transfiera cada gel a un recipiente de plástico lleno de tampón secante semiseco e incube durante 2-5 minutos en RT. Retire el gel de apilamiento.
    4. Prepare dos trozos de papel secante del tamaño de un gel y una membrana de nitrocelulosa del tamaño de un gel por gel SDS y sumérjalo previamente en un tampón de secado semiseco. Ensamble el sándwich western blot (WB) en una cámara WB de abajo hacia arriba en el siguiente orden: papel secante, membrana de nitrocelulosa, gel SDS-PAGE, papel secante.
    5. Retire las burbujas de aire que puedan haber quedado atrapadas entre las capas sándwich. Para este propósito, use un rodillo para enrollar cuidadosamente el sándwich varias veces.
    6. Cierre la cámara y permita que el exceso de amortiguación de manchas se drene.
    7. Coloque la cámara en el dispositivo de borrado respectivo y use el siguiente programa para el borrado semiseco: 25 V, 1.0 A, 30 min.
    8. Transfiera la membrana filtrada a un recipiente de plástico lleno de solución de bloqueo e incube durante 30 minutos en RT.
    9. Prepare la solución primaria de anticuerpos agregando el anticuerpo a 10 ml de PBS-T que contenga un reactivo bloqueador (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La concentración de trabajo del anticuerpo es específica del anticuerpo. En este caso, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-ubiquitina de ratón a una dilución de 1:5.000. Para el segundo gel, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-CHIP de conejo a 1:5.000 en PBS-T/reactivo bloqueador.
    10. Reemplace la solución de bloqueo con la solución de anticuerpos primarios e incube durante la noche a 4 ° C en un balancín.
    11. Lave la membrana tres veces durante 10 min con PBS-T.
    12. Prepare la solución secundaria de anticuerpos agregando el anticuerpo respectivo a 10 ml de PBS-T.
      NOTA: Aquí, los anticuerpos anti-ratón de cabra y anti-conejo de ratón se utilizan en una dilución de 1:10.000.
    13. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario durante 1 h a RT en un balancín.
    14. Lave la membrana tres veces durante 5 min con PBS-T.
  3. Análisis de datos
    1. Agregue reactivos de detección de western blot para anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a la membrana lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y capture la señal HRP mediante el uso de películas de rayos X o una cámara de dispositivo de carga acoplada(Figura 1).

3. Ensayo de ubiquitilación de sustrato in vitro

  1. Preparación y ejecución de ensayos
    1. Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción, basado en las molaridades dadas de las proteínas y las concentraciones de proteínas de las soluciones proteicas. Por reacción de ubiquitilación del sustrato, utilice 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM de sustrato y 50 μM Ub. Use 10x solución de ATP y 10x buffer de ubiquitilación a 1x. Ajuste el volumen de la reacción de ubiquitilación del sustrato a 20 μL con ddH2O.
    2. Prepare un esquema de pipeteo para todas las reacciones. Incluya reacciones de control adecuadas que verifiquen que la ubiquitilación del sustrato es específica de E3. Utilice la proteína UNC-45B como sustrato representativo de CHIP y un mutante CHIP catalíticamente inactivo (H260Q) como control. Prepare las siguientes reacciones: E1, E2, ub mix (incluyendo Ub, ATP, tampón de ubiquitilación); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; y E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Para evitar errores de pipeteo, prepare una mezcla maestra sobre hielo que contenga el volumen requerido para todas las reacciones más una reacción adicional. Calcule el volumen de la mezcla maestra que se requiere por reacción.
      NOTA: Los componentes maestros de la mezcla para este ensayo incluyen E1, E2, Ub, ATP y tampón de ubiquitilación.
    4. Agregue componentes de reacción en el siguiente orden: ddH2O, sustrato, ligasa E3.
    5. Antes de comenzar la reacción de ubiquitilación mediante la adición de la mezcla maestra, configure un termociclador de PCR con el siguiente programa: 2 h, 37 ° C seguido de 4 ° C, infinitamente.
    6. Añadir la mezcla maestra a cada tubo, e incubar las muestras en el termociclador PCR durante el periodo de tiempo indicado.
    7. Después de 2 h, agregue 2x tampón de muestra SDS a cada reacción y mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    8. Después de la ejecución, hierva las muestras inmediatamente a 95 °C durante 5 min, y continúe con PAGE. Alternativamente, almacene las proteínas desnaturalizadas a -20 °C.
  2. Electroforesis en gel y western blot
    1. Realizar electroforesis en gel y western blot como se describe en la sección 2.2. Utilizar anticuerpos específicos para la detección del sustrato y de la ligasa E3, respectivamente.
      NOTA: Aquí, UNC-45B se fusiona con una etiqueta de proteína polipeptídica derivada del producto del gen c-myc que permite el uso de un anticuerpo monoclonal anti-MYC de ratón. Anti-MYC se utiliza a 1:10.000.
  3. Análisis de datos
    1. Realizar el análisis de los datos como se describe en la sección 2.3 (Figura 2).

4. Ensayo de descarga de lisina

  1. Preparación y ejecución de ensayos
    1. Carga de la enzima E2 con Ub por E1
      1. Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción en función de las molaridades dadas de las proteínas y las concentraciones de proteínas de las soluciones proteicas. Por reacción de carga, use 2 μM E1, 4 μM E2 y 4 μM de ubiquitina libre de lisina (Ub K0). Use 10x ATP y 10x buffer de ubiquitilación a 1x. Ajuste el volumen de la reacción de carga a 20 μL con ddH20.
        NOTA: El mutante Ub K0 libre de lisina se utiliza para imponer la producción exclusiva de E2 monoubiquitilado. También se puede utilizar Ub de tipo salvaje; sin embargo, esto podría conducir a diversas modificaciones de E2 ~ Ub(por ejemplo,poli-ubiquitilación de E2), que son más difíciles de analizar. Para el uso por primera vez o cuando se utiliza una nueva enzima E2, determine el nivel de carga Ub en E2 que se puede lograr con E1. Para determinar el rendimiento de la carga, visualice E2 sin carga frente a E2 cargado a través de la tinción de Coomassie. Aquí, aproximadamente la mitad de Ub K0 se convirtió de manera confiable a UBE2D2 ~ Ub cuando se usaron relaciones equimolares de UBE2D2 y Ub K0(Figura suplementaria S2A).
      2. Prepare un esquema de pipeteo para la reacción de carga. Ajuste el volumen de la reacción de carga a las reacciones de descarga posteriores de su elección, por ejemplo,use CHIP y CHIP (H260Q) en reacciones de descarga individuales. Por lo tanto, prepare el doble del volumen de una reacción de carga.
        NOTA: Para su primer uso, pruebe diferentes concentraciones de la ligasa E3 de elección para monitorear las condiciones óptimas de descarga y analícelas mediante western blotting. En una condición ideal, la descarga de Ub de E2 aumentará con el tiempo hasta que la respectiva banda de proteína E2 ~ Ub desaparezca.
      3. Incubar la reacción de carga durante 15 min a 37 °C.
    2. Terminación de la reacción de carga
      1. Detenga la reacción de carga mediante la adición de apirasa a una concentración final de 1,8 U/ml. Realizar la incubación con apirasa durante 5 min en RT, seguido de la adición de EDTA a una concentración final de 30 mM. Ajuste el volumen de la reacción de carga a 30 μL con ddH2O.
        NOTA: La apirasa se utiliza para convertir las moléculas de ATP en moléculas de ADP (difosfato de adenosina). Como la actividad de la enzima E1 es dependiente de ATP, E1 ya no puede cargar E2. El EDTA también se utiliza para garantizar que el E1 se inhiba apagando los iones Mg2+ que son cofactores necesarios para E1. El volumen de apirasa que se requiere para detener la reacción puede variar entre las condiciones del ensayo. Aunque la apirasa sola ya apaga las moléculas de ATP disponibles, una combinación de apirasa y EDTA fue más efectiva para detener la reacción de carga para el par E1-UBE2D2. Como detener la reacción es un factor crítico para la reproducibilidad del ensayo, se debe probar una parada eficiente para los nuevos pares E1-E2. Para este propósito, configure una reacción de carga, deténgala y recolecte muestras en puntos de tiempo específicos, por ejemplo,después de 2, 5, 10 y 15 minutos. Los niveles no cambiantes de E2 ~ Ub indican que la reacción se ha detenido y que el tioéster fue estable durante ese período de tiempo (Figura suplementaria S2B).
    3. Descarga de E2 ~ Ub por E3
      1. Preparar cuatro tubos correspondientes a los diferentes puntos de tiempo (t0, t1, t2, t3); agregue un tampón de muestra no reductor (6,7 μL de 4 tampón de dodecil sulfato de litio (LDS)) a cada tubo.
        NOTA: No utilice agente reductor en el búfer de muestra.
      2. Retire 6 μL de la reacción de carga detenida para t0y ajuste el volumen a 20 μL con ddH2O.
      3. Incubar la muestra t0 durante 10 min a 70 °C.
        NOTA: No hierva la muestra extendiendo el tiempo de incubación ya que los tioésteres son lábiles a temperaturas más altas.
      4. Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción de descarga. Use los 24 μL restantes de la E2 cargada y agregue 10 mM de L-lisina, 1 mg/ml de BSA y 500 nM de la ligasa E3. Utilice el tampón de ubiquitilación a 1x y ajuste el volumen a 80 μL con ddH2O.
      5. Prepare un esquema de pipeteo para todas las reacciones de descarga y use CHIP(H260Q) como control además de CHIP(WT).
      6. Configure las reacciones de descarga en hielo agregando los componentes requeridos en el siguiente orden: ddH2O, tampón de ubiquitilación, BSA, lisina, ligasa E3 y E2 cargado para iniciar la reacción.
      7. Incubar la reacción de descarga en RT.
      8. Tome muestras después de 5, 30 y 60 min transfiriendo 20 μL de la reacción de descarga a los respectivos tubos de muestra.
        NOTA: Los puntos de tiempo adecuados que permiten un monitoreo adecuado de la descarga pueden variar entre los pares E2-E3.
      9. Vórtice la muestra inmediatamente e incube a 70 °C durante 10 min.
      10. Proceda directamente con PAGE.
        NOTA: Los tioésteres E2 ~ Ub pueden ser lábiles incluso después de desnaturalizarse en el tampón de muestra. Por lo tanto, la electroforesis en gel debe realizarse directamente después de la ejecución del ensayo.
  2. Electroforesis en gel y western blot
    1. Realizar la electroforesis en gel y el western blotting tal y como se describe en la sección 2.2. Use un anticuerpo específico de Ub y, si está disponible, también use un anticuerpo específico de E3 que se haya criado en una especie diferente, lo que permite la detección simultánea de la señal de la ligasa Ub y E3.
  3. Análisis de datos
    1. Realizar el análisis de los datos como se describe en la sección 2.3(Figura 3).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para identificar las enzimas E2 que cooperan con la ubiquitina ligasa CHIP, se probó un conjunto de candidatos E2 en reacciones individuales de ubiquitilación in vitro. Los pares E2-E3 cooperantes fueron monitoreados por la formación de productos de ubiquitilación dependientes de E3, es decir,auto-ubiquitilación de la ligasa E3 y la formación de polímeros Ub libres. Los productos de ubiquitilación fueron analizados por western blotting. La interpretación de los datos se basa en la comparación del tamaño...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe los métodos básicos de ubiquitilación in vitro para el análisis de la función de la ligasa E3. Al realizar ensayos de ubiquitilación in vitro, se debe considerar que algunas enzimas E2 pueden realizar auto-ubiquitilación debido al ataque de su cisteína activa sobre sus propios residuos de lisina que se encuentran muy cerca del sitio activo30. Para evitar este problema, se recomienda el uso de un mutante E2 en el que el residuo de lisina respectivo se interc...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio por la discusión crítica y los consejos útiles sobre el manuscrito. Nos disculpamos por no haber citado contribuciones valiosas debido a la limitación de tamaño. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 y Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD a TH. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2030 - 390661388 y - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 a T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Amershan Protran 0.1 y micro; m NCGE Healthcare10600000membrana de nitrocelulosa
Anti-CHIPCell Signaling2080Anticuerpo monoclonal anti-CHIP de conejo, clon C3B6
Anti-MYCRocheOP10Anticuerpo anti-MYC monoclonal de ratón, clon 9E10
Anti-ubiquitinaUpstate05-944Anticuerpo anti-Ub monoclonal de ratón, clon P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
Tampón de muestras LDS (4x)novexB0007
L-LisinaSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Productos químicos2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGEInvitrogenantioxidante NP0005
NuPAGE Transferencia tampón (20x)novexNP0006-1
Regla de página plusThermo Fisher26619Escalera de proteínas
RotiBlockRothA151.1Reactivo de bloqueo
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 TermocicladorBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUSistema de transferencia
Tris baseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH Juego de enzimasBostonBiochemK-980BE2 enzimas
UbiquitinaBostonBiochemU-100H Enzima
activadora de ubiquitina E1EnzoBML-UW941U-0050
Tampón de ubiquitilación (10x)EnzoBML-KW9885-001
Papel secante WhatmanBio Rad1703969Papel de filtro extra grueso

Referencias

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  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6(2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740(2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385(2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

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