In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

Leonie Müller; Carl Elias Kutzner; Vishnu Balaji; Thorsten Hoppe

doi:10.3791/62393

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Artículo de método

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

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DOI:

10.3791/62393

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14 de mayo de 2021

Leonie Müller¹ , Carl Elias Kutzner¹^,² , Vishnu Balaji¹ , Thorsten Hoppe¹^,²

¹Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, ²Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

En este artículo

Resumen

El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.

Resumen

La unión covalente de la ubiquitina (Ub) a los residuos internos de lisina de una proteína de sustrato, un proceso denominado ubiquitilación, representa una de las modificaciones post-traduccionales más importantes en los organismos eucariotas. La ubiquitilación está mediada por una cascada secuencial de tres clases de enzimas, incluidas las enzimas activadoras de ubiquitina (enzimas E1), las enzimas conjugantes de ubiquitina (enzimas E2) y las ligasas de ubiquitina (enzimas E3) y, a veces, los factores de elongación de la cadena de ubiquitina (enzimas E4). Aquí, se proporcionan protocolos in vitro para ensayos de ubiquitilación, que permiten la evaluación de la actividad de la ubiquitina ligasa E3, la cooperación entre pares E2-E3 y la selección de sustratos. Los pares E2-E3 que cooperan se pueden detectar mediante el monitoreo de la generación de cadenas libres de poli-ubiquitina y / o la auto-ubiquitilación de la ligasa E3. La ubiquitilación del sustrato se define por la unión selectiva de la ligasa E3 y puede detectarse mediante western blotting de la reacción in vitro. Además, se describe un ensayo de descarga E2 ~ Ub, que es una herramienta útil para la evaluación directa de la cooperación funcional E2-E3. Aquí, la transferencia de ubiquitina dependiente de E3 se sigue desde la enzima E2 correspondiente a aminoácidos de lisina libre (imitando la ubiquitilación del sustrato) o lisinas internas de la propia ligasa E3 (auto-ubiquitilación). En conclusión, se proporcionan tres protocolos in vitro diferentes que son rápidos y fáciles de realizar para abordar la funcionalidad catalítica de la ligasa E3.

Introducción

La ubiquitilación es el proceso por el cual Ub se une covalentemente a una proteína de sustrato¹. La modificación de Ub es catalizada por sucesivas reacciones enzimáticas que involucran la acción de tres clases diferentes de enzimas, es decir,enzimas activadoras de Ub (E1s), enzimas conjugantes de Ub (E2s), ligasas de Ub (E3s) y posiblemente factores de elongación de la cadena ub (E4s)²^,³^,⁴^,⁵. Después de la activación dependiente de trifosfato de adenosina (ATP) y magnesio (Mg²⁺⁾de Ub por E1, la ci....