Artículo de método

Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

DOI:

10.3791/62398

⸱

14 de febrero de 2022

 ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D2O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para retrasar y prevenir la propagación de infecciones resistentes a los antimicrobianos, se necesitan urgentemente pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) para determinar cuantitativamente los efectos antimicrobianos sobre los patógenos. Por lo general, lleva días completar el AST mediante métodos convencionales basados en el cultivo a largo plazo, y no funcionan directamente para muestras clínicas. Aquí, informamos un método rápido de AST habilitado por imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de la incorporación metabólica de óxido de deuterio (D2O). La incorporación metabólica deD2Oen la biomasa y la inhibición de la actividad metabólica tras la exposición a antibióticos a nivel de bacteria única se monitorean mediante imágenes SRS. La concentración de inactivación del metabolismo unicelular (SC-MIC) de las bacterias tras la exposición a antibióticos se puede obtener después de un total de 2,5 h de preparación y detección de la muestra. Además, este método rápido de AST es directamente aplicable a muestras bacterianas en entornos biológicos complejos, como orina o sangre total. Las imágenes metabólicas SRS de la incorporación de deuterio son transformadoras para la rápida AST fenotípica unicelular en la clínica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una amenaza mundial creciente para el tratamiento eficaz de las enfermedades infecciosas1. Se predice que la RAM causará 10 millones de muertes adicionales por año y una pérdida del PIB mundial de $ 100 billones para 2050 si no se toman medidas para combatir las bacterias resistentes a los antibióticos 1,2. Esto pone de relieve la necesidad urgente de métodos de diagnóstico rápidos e innovadores para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) de las bacterias infecciosas para frenar la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y reducir la tasa de mortalidad relacionada3. Para garantizar el mejor resultado clínico posible, es crucial introducir una terapia efectiva dentro de las 24 h. Sin embargo, el método estándar de oro actual, como la difusión en disco o el método de dilución en caldo, generalmente requiere al menos 24 h para el procedimiento de preincubación para muestras clínicas y 16-24 h adicionales para obtener los resultados de concentración inhibitoria mínima (CMI). En general, estos métodos consumen demasiado tiempo para guiar una decisión inmediata para el tratamiento de enfermedades infecciosas en la clínica, lo que conduce a la aparición y propagación de resistencia a los antimicrobianos4.

Se han desarrollado métodos genotípicos de AST, como las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)5, para la detección rápida. Tales técnicas miden las secuencias genéticas de resistencia específicas para proporcionar resultados rápidos de AST. No dependen del cultivo celular que consume mucho tiempo; Sin embargo, solo se prueban secuencias genéticas específicas conocidas con resistencia. Por lo tanto, su aplicación se limita a diversas especies bacterianas o diferentes mecanismos de resistencia. Además, no pueden proporcionar resultados de CMI para las decisiones terapéuticas 6,7. Además, se están desarrollando nuevos métodos fenotípicos para AST rápido para superar estas limitaciones8, incluidos los dispositivos microfluídicos 9,10,11,12,13, los dispositivos ópticos14,15,16, AST fenotípico que cuantifica la copia de ácidos nucleicosnúmero 17,18 y los métodos espectroscópicos Raman 19, 20,21,22,23,24. Estos métodos reducen el tiempo para guiar los resultados de AST, sin embargo, la mayoría de ellos solo son aplicables a aislados bacterianos, no directamente a muestras clínicas, y aún requieren una preincubación prolongada.

En este trabajo, presentamos un método para la determinación rápida de la susceptibilidad de las bacterias en la orina y la sangre total a través del monitoreo de la actividad metabólica celular mediante imágenes SRS. El agua (H2O) participa en la gran mayoría de los procesos esenciales de síntesis biomolecular en las células vivas. Como un isotopólogo del agua, a través de la reacción de intercambio H/D catalizada por enzimas entre el átomo de hidrógeno redox activo en NADPH y el átomo D en D2O, el deuterio puede incorporarse a la biomasa dentro de una celda25,26. Una reacción de síntesis de ácidos grasos deuterados está mediada por el NADPH marcado con deuterio. La incorporación deD2Oen reacciones de aminoácidos (AAs) resulta en la producción de proteínas deuteradas26 (Figura 1). De esta manera, las biomoléculas recién sintetizadas que contienen enlaces C-D en células microbianas individuales pueden emplearse como un marcador general de actividad metabólica para ser detectado. Para leer los enlaces C-D sintetizados de novo, la espectroscopia Raman, una herramienta analítica versátil que proporciona información química específica y cuantitativa de biomoléculas, se usa ampliamente para determinar la susceptibilidad antimicrobiana y reducir significativamente el tiempo de prueba a unas pocas horas27,28,29,30 . Sin embargo, debido a la baja eficiencia inherente del proceso de dispersión Raman, la espectroscopia Raman espontánea es de baja sensibilidad de detección. Por lo tanto, es difícil obtener resultados de imágenes en tiempo real utilizando espectroscopia Raman espontánea. La dispersión Raman coherente (CRS), incluida la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS), ha alcanzado una alta sensibilidad de detección debido al campo de luz coherente para generar órdenes de magnitud mayores que la espectroscopia Raman espontánea, lo que representa imágenes químicas de alta velocidad, específicas y cuantitativas a nivel de una sola célula. 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Aquí, basándonos en nuestro trabajo más reciente40, presentamos un protocolo para la determinación rápida de la actividad metabólica y la susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes SRS C-D de femtosegundo de la incorporación de bacteriasD2Oen el medio normal, orina y ambiente de sangre total a nivel unicelular. La imagen SRS de femtosegundo facilita el monitoreo de la concentración de inactivación del metabolismo de una sola célula (SC-MIC) contra antibióticos a nivel de bacteria única dentro de las 2,5 h. Los resultados de SC-MIC se validan mediante una prueba MIC estándar mediante microdilución en caldo. Nuestro método es aplicable para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de patógenos de infecciones del tracto urinario (ITU) e infecciones del torrente sanguíneo (BSI) con un tiempo de ensayo muy reducido en comparación con el método convencional, lo que abre la oportunidad de AST fenotípica rápida en la clínica a nivel de una sola célula.

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Protocolo

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El uso de muestras de sangre humana está de acuerdo con las pautas del IRB de la Universidad de Boston y los Institutos Nacionales de Salud (NIH). En concreto, los ejemplares proceden de un banco y están completamente desidentificados. Estos especímenes no son considerados sujetos humanos por la oficina de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Boston.

1. Preparación de la solución madre de bacterias y antibióticos

  1. Preparar la solución madre de antibióticos (sulfato de gentamicina o amoxicilina) a una concentración de 1 mg/ml disuelta en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o dimetilsulfóxido (DMSO) en microtubos de 1,5 ml. Disuelva el sulfato de gentamicina en una solución estéril de PBS y la amoxicilina en un disolvente DMSO estéril. A partir de entonces, conservar la solución antibiótica a 2-8 °C como se sugiere.
  2. Para hacer que los medios de caldo Mueller-Hinton (MHB) que contengan D 2 O ajustados en cationes, agregue 220 mg de base de caldo MHB a 10 ml de D 2 O para hacer un medio que contenga 100% de D2O. Esterilizar la solución filtrando con filtros de 200 nm de tamaño de poro.
    NOTA: Utilice este protocolo siempre para hacer y esterilizar soluciones medianas en pasos posteriores.
  3. Para preparar muestras bacterianas para imágenes de SRS, agregue 2 ml de medio MHB normal, que no contenga deuterio, a un tubo de cultivo estéril de fondo redondo y luego precaliéntelo a 37 ° C.
  4. Utilice un asa estéril para seleccionar una colonia bacteriana (Escherichia coli BW 25113 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) del cultivo fresco en una placa tríptica de agar soja. Luego suspenda en el medio de cultivo precalentado y voltee suavemente para preparar la suspensión de bacterias.
  5. Incubar bacterias a 37 °C en un agitador a 200 revoluciones por minuto (rpm) hasta que alcance la fase logarítmica.

2. D2O tratamiento de incorporación en presencia de antibióticos (Figura 2a)

  1. Compruebe la concentración bacteriana midiendo la densidad óptica (OD) con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
  2. Diluir la solución bacteriana utilizando el medio MHB normal, que no contiene deuterio, para alcanzar una concentración celular final de 8 x 105 UFC/ml. Vórtice suavemente para mezclar las células bacterianas.
  3. Preparar 300 μL de alícuotas de la solución bacteriana en siete microtubos de 1,5 ml y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 ml.
  4. Añadir 4,8 μL de solución madre antibiótica (gentamicina o amoxicilina) (1 mg/ml) en el microtubo que contiene 600 μL de la solución bacteriana, para que la concentración final de antibióticos sea de 8 μg/ml.
  5. Tome 300 μL de solución de los 8 μg/ml de solución de bacterias que contienen antibióticos, y agregue a otros 300 μL de solución bacteriana, para hacer una solución doble diluida que contiene antibióticos diluidos (4 μg/ml) que contienen bacterias.
  6. Repita la dilución en serie doble de los antibióticos de prueba, gentamicina o amoxicilina, hasta que se alcance el microtubo con la concentración más baja (0,25 μg/ml) y deseche 300 μL del tubo. Tanto para la gentamicina como para la amoxicilina, las concentraciones seriadas oscilan entre 0,25 μg/ml y 8 μg/ml.
    1. Deje un tubo sin antibióticos para el control en blanco. Este será el control positivo para inspeccionar la actividad metabólica bacteriana sin tratamiento antibiótico pero con tratamientoD2O.
    2. Deje un tubo sin antibióticos y sinD2Opara el control negativo.
  7. Incubar la alícuota bacteriana con cierto antibiótico (gentamicina o amoxicilina) que contiene medio MHB durante 1 h.
  8. Durante la incubación, preparar una dilución seriada de antibióticos con medio que contenga 100% deD2Ocon el mismo gradiente de concentración de antibióticos preparados en el paso 2.6. Tanto para la gentamicina como para la amoxicilina, las concentraciones seriadas oscilan entre 0,25 μg/ml y 8 μg/ml.
  9. Después de 1 h de tratamiento antibiótico, añadir 700 μL de antibiótico diluido en serie y medio MHB 100% D 2 O a los 300 μL de bacterias pretratadas con antibióticos en la misma concentración de antibiótico (preparado en el paso2.6), respectivamente.
    1. Por ejemplo, agregue 700 μL de medio MHB 100% D2que contiene O (que contiene 8 μg/ml de antibiótico) a los 300 μL de 8 μg/ml de bacterias pretratadas con antibióticos 8 μg/ml. De la misma manera, transfiera a los tubos correspondientes de la siguiente concentración y homogeneice pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    2. Añadir 700 μL de medio MHB 100% D 2 Osin antibióticos a 300 μL de bacterias libres de antibióticos (preparado en el paso 2.6.1) como control en blanco.
    3. Incubar a 37 °C en un agitador de incubación a 200 rpm durante 30 minutos adicionales.
      NOTA: En este paso, la concentración final deD2Oen el medio para la prueba es del 70%.
  10. Primero centrifugar 1 ml de antibiótico y muestra bacteriana tratada con D2O a 6200 x g durante 5 min a 4 °C, y luego lavar dos veces con agua purificada. Finalmente, fijar las muestras en una solución de formalina al 10% y almacenarlas a 4 °C.

3. Preparación de bacterias en el medio de la orina (Figura 2b)

  1. Para preparar E. coli BW 25113 en la fase logarítmica, siga los pasos de 1.4 y 1.5.
  2. Compruebe la concentración bacteriana midiendo el OD con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
  3. Para imitar las muestras clínicas de ITU 14,18,41, introduzca la solución de E. coli en 10 ml de orina desidentificada para alcanzar una concentración celular final de 10 6 UFC/ml.
  4. Filtrar la orina con E. coli con púas usando un filtro de 5 μm, y luego dividir la solución bacteriana en 300 μL alícuotas en siete microtubos de 1,5 ml y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 ml.
  5. Realizar el tratamiento de incorporación deD2Oen presencia de antibióticos y recogida de muestras como se describe en los pasos anteriores de 2,4 a 2,10.

4. Preparación de bacterias en el medio sanguíneo (Figura 2c)

  1. Para preparar Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 en la fase logarítmica, siga los pasos en 1.4 y 1.5.
  2. Para imitar las muestras clínicas de infecciones del torrente sanguíneo42,43, pico P. aeruginosa en 1 mL de sangre humana desidentificada para alcanzar una concentración de 107 UFC/mL.
  3. Agregue 9 ml de agua purificada estéril para lisar la sangre.
  4. Filtrar la sangre con púas de P. aeruginosa con un filtro de 5 μm. Luego cosechar bacterias a 1 ml de volumen por centrifugación a 6200 x g durante 5 min a 4 °C.  Agregue 9 ml de MHB normal precalentado en la solución de bacterias y vórtice suavemente. La concentración final de bacterias es de 106 UFC/ml
  5. Dividir la solución de sangre con púas de P. aeruginosa en alícuotas de 300 μL en siete microtubos de 1,5 ml y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 ml.
  6. Realizar el tratamiento de incorporación deD2Oen presencia de antibióticos y recogida de muestras como se describe en los pasos anteriores de 2,4 a 2,10.

5. Imágenes SRS de la incorporación metabólica deD2Oen una sola bacteria

  1. Lavar 1 ml de solución fija de bacterias con agua purificada y luego centrifugar a 6200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante. Enriquecer la solución bacteriana a unos 20 μL.
  2. Deposite la solución bacteriana en un vidrio de cubierta recubierto de poli-L-lisina. Coloque la muestra en sándwich y selle la muestra para obtener imágenes SRS.
  3. Imagen de bacterias a la frecuencia vibratoria C-D a 2168 cm-1 usando un microscopio SRS.
    1. Ingrese y ajuste la longitud de onda de la bomba a 852 nm utilizando el software de control en una computadora.
    2. Mida la potencia del láser con un medidor de potencia. Ajuste la potencia del láser de la bomba en la muestra a ~8 mW y la potencia del láser Stokes en la muestra a ~40 mW ajustando la placa de media onda delante de la salida del láser.
      NOTA: En el microscopio SRS, un láser de femtosegundo sintonizable con una tasa de repetición de 80 MHz proporciona los láseres de excitación de bomba (680 a 1300 nm) y Stokes (1045 nm).
  4. Ajustando los tornillos de los espejos reflectantes, alinee espacialmente la bomba y los haces de Stokes y dirija los dos haces a un microscopio vertical equipado con un sistema de espejo galvo 2D para escaneo láser.
    1. Utilice un objetivo de inmersión en agua 60x para enfocar la bomba y los láseres Stokes en la muestra.
    2. Utilice un condensador de aceite para recoger las señales de la muestra en la dirección de avance.
    3. Use un filtro de paso de banda para filtrar el láser Stokes antes de dirigirlo a un fotodiodo.
    4. Extraiga la señal Raman estimulada mediante un amplificador de bloqueo y detecte las señales por el fotodiodo.
  5. Configure cada imagen SRS para que contenga 200 x 200 píxeles y el tiempo de permanencia de píxeles de 30 μs en el panel de control del software. El tiempo total de adquisición de una imagen es ~1.2 s. Establezca el tamaño de paso en 150 nm, de modo que el tamaño de la imagen sea de aproximadamente 30 x 30 μm2. Imagine al menos tres campos de visión para cada muestra.

6. Procesamiento de imágenes y análisis de datos ( Figura 3)

  1. Para obtener la intensidad media de la señal C-D, abra y procese imágenes SRS con el software ImageJ.
  2. Primero, convierta imágenes SRS en imágenes de tipo 8 bits con color invertido haciendo clic en Imagen | Tipo | 8 bits y, a continuación, Editar | Invertir botones en el software ImageJ.
  3. A continuación, filtre las imágenes con desenfoque gaussiano haciendo clic en Procesar | Filtros | Botones de desenfoque gaussiano y ajuste el Sigma (Radio) a 1.
  4. Utilice el ajuste del umbral de imagen para seleccionar el área bacteriana. Haga clic en | imagen Ajustar | Umbral para garantizar que los tamaños bacterianos seleccionados coincidan con los de las imágenes SRS originales. Elimine las partículas pequeñas ajustando el umbral de tamaño para determinar las partículas. Haga clic en Aplicar.
  5. Aplicar Analizar | Botones de análisis de partículas para etiquetar y determinar el área de bacterias.
  6. Al hacer clic en el botón Mostrar todo en el administrador de ROI a la imagen SRS original sin procesar, etiquete la misma área de bacterias, determine la intensidad promedio de cada punto de datos haciendo clic en el botón Medir en el administrador de ROI.
  7. Encierre en un círculo el área de fondo en la imagen SRS original y mida la intensidad media del fondo. Las intensidades C-D promedio de cada bacteria se obtienen deduciendo la intensidad de la señal de fondo.

7. Cuantificación de la susceptibilidad antimicrobiana a través de SC-MIC

NOTA: El valor de corte en 0,60 para determinar la CMI-SC se establece de acuerdo con el análisis estadístico de las intensidades SRS C-D de las condiciones de metabolismo activo e inhibido del metabolismo para bacterias en diversas concentraciones de exposición al fármaco40. Las intensidades C-D para los grupos susceptibles a los antibióticos y resistentes a los antibióticos se ajustaron con una distribución normal.

  1. Trazar la curva de características operativas del receptor (ROC) y evaluar el umbral de corte en 0,60. Sobre la base de este valor de corte, se puede definir la CMI SC como indicador de la eficacia de los antibióticos para determinar el grupo metabólicamente inactivo y metabólicamente activo.
  2. Para analizar cuantitativamente los datos de imágenes SRS, trace los histogramas de las intensidades de señal C-D para cada grupo de bacterias tratadas con la concentración de antibióticos diluidos en serie. Los puntos de datos coloreados representan diferentes bacterias individuales.
  3. Normalizar las intensidades C-D del grupo tratado con antibióticos a la intensidad media del grupo control sin tratamiento antibiótico. Determinar los resultados de SC-MIC de diferentes combinaciones de bacterias y antibióticos cuantificando las intensidades de señal SRS en la región C-D frente a varias concentraciones de antibióticos utilizando el valor de corte en 0.60.
  4. Valide y compare la lectura SC-MIC con la MIC determinada mediante un ensayo de microdilución en caldo convencional.
  5. Según el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI), la categoría de susceptibilidad basada en los resultados de imágenes metabólicas de SRS para cada cepa bacteriana probada se interpreta como "susceptible", "resistente" o "intermedia".

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Resultados

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El efecto del tiempo de incubación en la incorporación de deuterio se mide mediante microespectroscopia Raman espontánea en las regiones C-D (2070 a 2250 cm-1) y C-H (2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Los espectros Raman unicelulares de lapso de tiempo de P. aeruginosa cultivados en medio que contiene 70% de D 2 O muestran un aumento de la intensidad de CD / CH durante el tiempo de incubación de 0 a 180 min. (Figura 4b) La creciente...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se puede obtener AST rápida evaluando la respuesta de la actividad metabólica bacteriana al tratamiento con antibióticos utilizando imágenes metabólicas SRS de una sola célula dentro de las 2,5 h desde la muestra hasta los resultados de SC-MIC. La respuesta de la actividad metabólica bacteriana y la susceptibilidad antimicrobiana se pueden detectar mediante la monitorización de la incorporación metabólica deD2Opara la síntesis de biomoléculas utilizando imágenes SRS de enlaces C-D. Dado que el agua se usa ubic...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por NIH R01AI141439 a J.-X.C y M.S, y R35GM136223 a J.-X.C.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Modulación acústico-ópticaGooch& HousegoR15180-1.06-LTDRayo láser modulante de stokes
AmoxicilinaSigma AldrichA8523-5G
Filtro de paso de bandaChromaHQ825/150mBloquea el rayo láser de stokes antes del fotodiodo
Cloruro de calcioSigma AldrichC1016-100GAjuste catiónico
Ajustado a cationes Caldo Mueller-HintonFisher ScientificB12322Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos mediante métodos de dilución en caldo
CentrífugaThermo Scientific75002542
CubreobjetosVWR16004-318
Tubo de cultivo con tapón a presiónMarca Fisher149569B
DaptomicinaAcrosA0386346
Óxido de151882Disolvente orgánico para disolver antibióticos
Óxido de deuterio-d6Sigma Aldrich156914Disolvente orgánico como estándar para calibrar el sistema de imagen SRS
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Tubos de microcentrífuga de polipropileno Eppendorf 1,5 mLMarca Fisher05-408-129
Sulfato de gentamicinaSigma AldrichG4918
Filtros hidrofílicos de fluoruro de polivinilidenoMillipore-SigmaSLSV025NBtamaño de poro 5 y micro; m
Software ImageJNIH Versión: 2.0.0-rc-69/1.52tProcesamiento y análisis de imágenes
Agitador orbital de incubación ajustado a 37 ° CVWR97009-890
Bucle de inoculaciónSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee láser pulsado de femtosegundoSpectra-PhysicsModelo: insight X3Fuente láser sintonizable y fuente láser fija a 1045 nm para imágenes SRS
Amplificador de bloqueoZurich InstrumentHF2LIDemodula las señales SRS
Condensador de aceiteOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)Colección de cultivos tipo americanoATCC 47085
FotodiodoHamamatsuS3994-01Detector
Tubo cónico de polipropileno 15 mLFalcon14-959-53A Filtros
polipropilenoThermo Scientific726-2520 tamaño deporo 0.2 y micro; m
Placas de Petri estérilesCorning07-202-031
Jeringa 10 mLMarca Fisher14955459
Espectrofotómetro UV/VisBeckman CoulterModelo: DU 530Medición de la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm
Mezclador de vórticeVWR97043-562
Objetivo de aguaOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2
deuterio de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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