Summary
Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.
Abstract
La rétine du poussin est depuis longtemps un système modèle important en neurobiologie du développement, avec des avantages tels que sa grande taille, son développement rapide et son accessibilité pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Cependant, sa principale limite technique était l’absence d’approches robustes de perte de fonction pour les analyses de la fonction des gènes. Ce protocole décrit une méthodologie de silençage génique dans la rétine du poussin en développement qui implique l’expression transgénique de microARN artificiels (miARN) à l’aide du système de transposon Tol2. Dans cette approche, un plasmide transposon Tol2 contenant une cassette d’expression pour le marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des séquences artificielles de pré-miARN contre un gène cible est introduit dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo . Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans notre étude précédente, nous avons démontré que l’expression de Nel, une glycoprotéine qui exerce de multiples fonctions dans le développement neuronal, peut être supprimée de manière significative dans la rétine du poussin en développement en utilisant cette technique. Nos résultats indiquent que cette méthodologie induit une suppression stable et robuste de l’expression des gènes et fournit ainsi une approche efficace de la perte de fonction pour les études du développement rétinien.
Introduction
La rétine des vertébrés est un système modèle important pour l’étude du développement neuronal. Malgré son emplacement périphérique, la rétine est anatomiquement et développementalement une extension du système nerveux central, et le nerf optique, qui se compose d’axones de cellules ganglionnaires rétiniennes, représente un tractus dans le système nerveux central. La rétine du poussin présente des avantages significatifs en tant que système modèle pour étudier le mécanisme moléculaire du développement neuronal : elle est grande et se développe rapidement ; il présente des similitudes structurelles et fonctionnelles avec la rétine humaine ; Il est très accessible pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Les mécanismes moléculaires de la prolifération et de la différenciation cellulaires, de la morphogenèse et du guidage axonale au cours du développement neuronal ont été largement étudiés à l’aide de la rétine de poulet.
L’électroporation in ovo a été utilisée avec succès au cours des deux dernières décennies pour introduire des gènes ectopiques dans les cellules de l’embryon de poussin en développement. Cette technique permet de marquer les cellules en développement, de tracer le destin cellulaire et de tracer la migration cellulaire et les voies axonales, ainsi que l’expression ectopique des gènes pour l’analyse in vivo de la fonction des gènes. Les conditions de l’électroporation in ovo pour une expression ectopique efficace des gènes chez les embryons de poussins ont été bien établies 1,2,3.
Malgré ces avantages, l’absence d’une technique stable de perte de fonction pour l’étude de la fonction des gènes a été une limitation technique majeure de l’embryon de poussin. Alors que les embryons de poussins électroporés avec de petits ARN interférents (siRNAs)4 ou des vecteurs d’expression pour les ARN courts en épingle à cheveux (shRNAs)5 montrent l’inactivation du gène ciblé, la suppression des gènes dans ces approches est transitoire car les effets disparaissent une fois que les cellules perdent les ARN ou les ADN introduits. Une suppression génique plus stable peut être obtenue en délivrant des siRNA dans des embryons de poussin par un système rétrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. Le vecteur viral s’intègre dans le génome de l’hôte et les gènes ectopiques sont exprimés de manière stable. Cependant, le rétrovirus ne peut s’intégrer dans le génome des cellules en division que pendant la phase mitotique (M) du cycle cellulaire, ce qui peut imposer une limitation sur les stades de développement et/ou les types de cellules pour lesquels cette approche de perte de fonction peut être appliquée. De plus, l’expression des transgènes par RCAS apparaît plus lente et moins robuste que celle induite par l’électroporation in ovo 7.
Les transposons sont des éléments génétiques qui se déplacent d’un endroit à un autre du génome. L’élément Tol2 fait partie de la famille des éléments transposables hAT et contient un gène interne codant pour une transposase qui catalyse la réaction de transposon del’élément 8 de Tol2. Lorsqu’un vecteur plasmidique porteur d’une cassette d’expression génique flanquée des séquences des extrémités gauche et droite des éléments Tol2 (200 pb et 150 pb, respectivement) est introduit dans des cellules de vertébrés avec une construction d’expression de la transposase Tol2, la cassette d’expression est excisée du plasmide et intégrée dans le génome de l’hôte, ce qui favorise une expression stable du gène ectopique (Figure 1). Il a été démontré que l’élément transposable Tol2 peut induire la transposition de gènes de manière très efficace chez différentes espèces de vertébrés, y compris le poisson-zèbre9,10, les grenouilles 11, les poussins 12 et les souris 13, et constitue donc une méthode utile de transgénèse et de mutagenèse insertionnelle. Le système de transposons Tol2 a été utilisé avec succès pour l’inactivation conditionnelle d’un gène cible par intégration génomique de siRNA qui est traité à partir d’un long ARN double brin14.
Ce protocole décrit une approche de perte de fonction dans l’embryon de poussin qui implique l’introduction de microARN artificiels (miARN) par le système de transposons Tol215,16. Dans cette approche, une cassette d’expression du marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des miARN artificiels contre un gène cible est clonée dans un vecteur transposon Tol2. La construction du transposon Tol2 est ensuite introduite dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo. Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans nos études précédentes, nous avons réussi à inhiber l’expression de Nel, une glycoprotéine extracellulaire principalement exprimée dans le système nerveux, dans la rétine du poussin en développement (voir Résultats représentatifs). Nos résultats indiquent qu’une suppression génique stable et efficace peut être obtenue in ovo par cette technique.
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Protocol
1. Construction de vecteurs d’expression de miARN
REMARQUE : Les procédures de construction de vecteurs d’expression de miARN (étapes 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sont optimisées pour le kit d’expression de miARN, kit d’expression d’ARN miR Block-iT Pol II avec EmGFP, comme décrit précédemment15,16. Le kit fournit le vecteur d’expression conçu pour permettre l’expression des miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vecteur de contrôle (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-plasmide de contrôle négatif), des réactifs accessoires et des instructions pour produire des vecteurs d’expression des miARN (voir le tableau des matériaux)17.
- Conception d’oligos d’ADN simple brin codant pour des pré-miARN contre le gène cible : Concevoir des oligos d’ADN simple brin (oligos « brin supérieur » (pré-miARN cible) et oligos « brin inférieur » (compléments des oligos brin supérieur)) à l’aide de l’outil en ligne RNAi Designer (voir Tableau des matériaux). Voir la figure 2 pour les caractéristiques requises des oligos monocaténaires (figure 2A) et des exemples de séquences cibles (figure 2B).
REMARQUE : Il est recommandé de générer 5 à 10 séquences de pré-miARN pour un gène cible donné et de les cribler in vitro pour les activités de knockdown (étape 1.4). - Recuit des oligos des brins supérieur et inférieur pour générer un oligo double brin
- Mettre en place la réaction de recuit suivante (tableau 1) dans un tube de microcentrifugation stérile de 0,5 ml.
- Incuber le mélange réactionnel à 95 °C pendant 4 min. Recuire les oligos des brins supérieur et inférieur pour générer un oligo double brin en laissant le mélange réactionnel refroidir à température ambiante (RT) pendant 5 à 10 minutes. Centrifuger brièvement l’échantillon (~5 s).
REMARQUE : Les oligos recuits peuvent être stockés à -20 °C sans dégradation pendant au moins un an.
- Clonage des oligos double brin dans le vecteur d’expression des miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (fourni dans le kit d’expression des miARN)) : Cloner des oligos double brin individuels dans le vecteur d’expression des miARN linéarisé, selon le manuel du fabricant17.
- Évaluation des effets de knockdown
REMARQUE : Il est recommandé de tester l’efficacité de la suppression génique in vitro des séquences de miARN individuelles avant de les appliquer in ovo. L’efficacité du knockdown peut être testée en transfectant des plasmides d’expression de miARN dans une lignée cellulaire qui exprime le gène cible. Alternativement, les plasmides d’expression de miARN individuels peuvent être co-transfectés dans des lignées cellulaires avec une construction d’expression pour le gène cible. Pour les gènes cibles codant pour des protéines qui ne sont pas ancrées dans leur membrane à l’état natif (par exemple, les protéines solubles), une protéine de fusion de phosphatase alcaline (AP) peut être utilisée pour surveiller l’expression de la protéine cible. Une séquence d’ADNc codant pour la protéine cible peut être fusionnée dans le cadre à la phosphatase alcaline placentaire humaine dans des vecteurs AP-tag (APtag-1- APtag-5 ; voir Tableau des matériaux) et introduite dans les cellules18. Lorsqu’elle est exprimée dans des cellules de culture (par exemple, des cellules HEK293T), la protéine cible marquée par AP est sécrétée à des niveaux élevés dans les milieux de culture, et les effets de knockdown des séquences de miARN peuvent donc être évalués en mesurant la diminution de l’activité AP dans les milieux de culture des cellules transfectées par des miARN (sous-étapes 1.4.1-1.4.4).- Cultivez HEK293T cellules dans une plaque à 24 puits (8 x 10,4 cellules/puits) pendant la nuit. Transfecter transitoirement les cellules avec des constructions individuelles d’expression de miARN avec un plasmide d’expression d’une protéine cible marquée AP. Utilisez le plasmide de contrôle négatif pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (fourni dans le kit d’expression des miARN) comme témoin. (Si des lignées cellulaires exprimant de manière stable une protéine cible marquée AP sont utilisées, transfectez les cellules uniquement avec des constructions d’expression de miARN individuelles.)
REMARQUE : Un réactif de lipofection conventionnel (voir le tableau des matériaux) est utilisé pour la transfection. - Recueillir le milieu conditionné 48 à 72 h après la transfection et inactiver l’activité endogène de l’AP dans un bain-marie à 65 °C pendant 5 min. Éjectez les débris dans une microcentrifugeuse de bureau à vitesse maximale pendant 5 min.
- Tamponnez le surnageant avec 10 mM HEPES, pH 7,0 et passez-le à travers un filtre de 0,45 μm.
- Prélever 100 μL (pour la mesure dans un lecteur de plaques) ou 500 μL (pour un spectrophotomètre) du surnageant et ajouter une quantité égale de tampon de substrat AP 2x (Tableau 2). Vérifiez l’activité de l’AP en mesurant OD405 dans un lecteur de plaques ou un spectrophotomètre.
REMARQUE : Si l’activité AP du milieu conditionné est trop élevée pour une mesure précise, diluez-le avec un tampon HBAH (solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), 0,5 mg/mL d’albumine sérique bovine, 20 mM HEPES (pH 7,0)) ou un autre tampon contenant une protéine porteuse. N’utilisez pas de tampons contenant du phosphate (p. ex., PBS) car le phosphate inorganique agit comme un inhibiteur compétitif de la PA.
- Cultivez HEK293T cellules dans une plaque à 24 puits (8 x 10,4 cellules/puits) pendant la nuit. Transfecter transitoirement les cellules avec des constructions individuelles d’expression de miARN avec un plasmide d’expression d’une protéine cible marquée AP. Utilisez le plasmide de contrôle négatif pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (fourni dans le kit d’expression des miARN) comme témoin. (Si des lignées cellulaires exprimant de manière stable une protéine cible marquée AP sont utilisées, transfectez les cellules uniquement avec des constructions d’expression de miARN individuelles.)
- Chaînage de séquences de miARN
REMARQUE : Les effets de knockdown peuvent être améliorés en chaînant différents miARN contre le même gène cible ou en répétant le même miARN. Le vecteur d’expression des miARN prend en charge le chaînage de plusieurs séquences de pré-miARN et leur expression co-cistronique17.- Enchaîner deux séquences de pré-miARN différentes (contre le même gène cible) qui montrent les activités de knockdown les plus élevées dans les essais in vitro (étape 1.4), selon les instructions du fabricant17.
- Évaluer l’efficacité de la suppression génique des constructions chaînées à l’aide d’essais in vitro , comme décrit à l’étape 1.4. Si trois séquences pré-miARN ou plus montrent des activités de knockdown élevées similaires, testez différentes combinaisons de deux séquences et utilisez les combinaisons qui montrent l’activité de knockdown la plus élevée (voir Résultats représentatifs).
- Transfert de la cassette d’expression EmGFP-pre-miRNA vers le vecteur transposon Tol2
NOTE : La cassette d’expression contenant l’ADNc EmGFP et deux séquences de pré-miARN est transférée dans le vecteur transposon Tol2 (vecteur pT2K-CAGGS, voir le tableau des matériaux). À cette fin, la cassette d’expression (englobant l’extrémité 3' du promoteur CMV jusqu’au site d’amorce de séquençage inverse des miARN du vecteur d’expression des miARN) est amplifiée par PCR à l’aide d’amorces avec un site enzymatique de restriction artificiel, et le produit de PCR est cloné dans le vecteur transposon Tol2. Le vecteur transposon Tol2 contient le promoteur CAGGS omniprésent, qui pilote l’expression de la cassette d’expression insérée. Le promoteur CAGGS et la cassette d’expression sont flanqués des séquences Tol2 (Figure 1).- Amplification par PCR de la cassette d’expression EmGFP-pre-miRNA : Suivre la configuration de la réaction et les conditions de thermocyclage décrites dans le tableau 3.
- Lier le produit PCR purifié par gel (environ 1,3 kb) dans le vecteur transposon Tol2 digéré par l’enzyme de restriction. Électroporer le plasmide dans des cellules E. coli compétentes (voir le tableau des matériaux) et sélectionner les recombinants (constructions de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
- Préparez le plasmide à l’aide d’un kit maxiprep conventionnel (voir le tableau des matériaux). Vérifier la structure et la séquence du plasmide par cartographie de restriction et en utilisant les amorces utilisées pour la PCR, respectivement.
2. Stockage et incubation des œufs
- Achetez des œufs fécondés de Leghorn blanche (Gallus gallus) auprès de fermes locales ou de vendeurs commerciaux.
REMARQUE : Les œufs peuvent être conservés à une température de 12 à 16 °C ou à 4 °C jusqu’à 1 semaine avant l’incubation sans perte importante de viabilité ni retard de développement pendant l’incubation. - Étiquetez les œufs avec la date de début de l’incubation et marquez la face supérieure de l’œuf (où l’embryon sera positionné). Incuber les œufs fécondés en position horizontale à 38 °C jusqu’à ce que les embryons aient atteint les stades Hamburger et Hamilton (HH) 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19.
3. Électroporation in ovo
- Préparation à l’électroporation in ovo
- Préparation de la solution Fast Green à 0,25 % : Dissoudre 25 mg de Fast Green FCF dans 10 mL de PBS. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre pour seringue de 0,2 μm. La solution peut être stockée chez RT.
- Cocktail d’ADN : Préparer la solution injectable en mélangeant les plasmides de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x individuels (sous-étape 1.6.3) avec le plasmide d’expression de la transposase Tol2 (vecteur pCAGGS-T2TP ; voir le tableau des matériaux) (5 μg/μL chacun) dans un rapport de 2 :1. Ajouter 1/10 de volume de solution verte rapide à 0,25 % pour visualiser la zone injectée.
REMARQUE : La concentration optimale d’ADN peut varier en fonction des constructions. - Mise en place de l’appareil de micro-injection (Figure 3A,B) : L’appareil de micro-injection se compose des éléments suivants (voir le tableau des matériaux) : seringue Hamilton, aiguille de 18 G (longueur de l’aiguille = 2 »), tube en PVC (polychlorure de vinyle) (longueur de 2 cm), aiguille de micropipette (peut être fabriqué en tirant des tubes capillaires avec une fibre de point oméga (1 mm de diamètre extérieur X 0,75 mm de diamètre intérieur) avec un extracteur de micropipette).
- Remplissez une seringue Hamilton d’huile minérale lourde. Fixez une aiguille de 18 G à la seringue et remplissez l’espace intérieur de l’aiguille avec de l’huile en appuyant sur le piston de la seringue.
- Fixez un morceau de tube en PVC de 2 cm de long à l’extrémité de l’aiguille et remplissez le tube avec l’huile.
- Fixez une aiguille de micropipette tirée sur le tube. Cassez la pointe de l’aiguille de la micropipette à un diamètre de 10 à 20 μm à l’aide d’une pince fine pour faire une petite ouverture. Remplissez toute l’aiguille d’huile.
REMARQUE : Il faut veiller à ne pas piéger de bulles d’air dans le système, car elles inhiberaient l’écoulement de la solution d’ADN.
- Déposer 5 μL du cocktail d’ADN coloré (sous-étape 3.1.2) dans une boîte de Pétri stérile. Sous le microscope à dissection, placez la pointe de l’aiguille de la micropipette dans la solution d’ADN sur la boîte de Pétri stérile et aspirez lentement la solution dans l’aiguille.
- Attendez que la pression s’équilibre à l’intérieur et à l’extérieur de l’aiguille (pour éviter que l’air ne pénètre dans l’aiguille) et retirez la pointe de l’aiguille de la solution d’ADN. Garder la pointe de l’aiguille immergée dans du PBS stérile dans un petit bécher jusqu’à l’injection.
- Mise en place de l’appareil d’électroporation (Figure 3A,C) :
- Placez une paire d’électrodes en platine avec un porte-électrode sur un micromanipulateur. Ajustez l’espacement entre la pointe des électrodes à 2 mm (Figure 3C,E).
- Connectez les électrodes à un générateur d’impulsions d’onde carrée à l’aide de câbles (voir le tableau des matériaux).
- Micro-injection d’une solution d’ADN (Figure 3D)
- Retirez un œuf de poule de l’incubateur et essuyez la surface de l’œuf avec un papier de soie imbibé d’éthanol à 70 %.
- Fixez une aiguille de 18 G à une seringue de 10 ml. Insérez l’aiguille dans l’extrémité émoussée de l’œuf, inclinée vers le bas (45°) pour éviter d’endommager le jaune.
- Prélever 2 à 3 mL d’albumine de l’œuf. Scellez le trou avec un morceau de ruban adhésif. Confirmez que l’embryon et la membrane vitelline sont détachés de la coquille en « mirant » l’œuf avec de la lumière.
- Retirez un morceau de coquille d’œuf (cercle de 2 à 3 cm de diamètre) du haut de l’œuf à l’aide de ciseaux et d’une pince pour exposer l’embryon. Ne fendez pas plus de cinq ovules à la fois pour éviter le dessèchement des embryons pendant l’électroporation.
REMARQUE : S’il est difficile d’ouvrir une fenêtre sans casser l’œuf, tout le dessus de l’œuf peut être recouvert de ruban adhésif ou de ruban adhésif avant de retirer un morceau de coquille d’œuf. - Insérez la pointe de l’aiguille dans la vésicule optique à partir de son côté proximal à un angle de 45° et injectez le cocktail d’ADN en appuyant lentement (ou en tapotant sur) le piston jusqu’à ce que la solution de couleur bleue remplisse la lumière (Figure 3D).
REMARQUE : Il est également possible d’utiliser un système de micro-injection sous pression (voir le tableau des matériaux) pour l’injection de solutions d’ADN. - Retirez l’aiguille et replacez sa pointe dans le PBS.
- Électroporation (Figure 3E)
- Réglez les paramètres d’impulsion de l’électroporateur comme suit : Tension : 15 V, Longueur d’impulsion : 50 ms, Intervalle d’impulsion : 950 ms, Nombre d’impulsions : 5
- Ajouter quelques gouttes de HBSS sur la membrane vitelline sur l’embryon. Abaissez les électrodes dans le HBSS à l’aide du micromanipulateur, perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur de l’embryon.
REMARQUE : Alternativement, cette procédure peut être effectuée sans ajouter HBSS, car l’albumine est un bon conducteur électrique qui permet une électroporation efficace. - Placez les électrodes de chaque côté (côté antérieur (nasal) et côté postérieur (temporal)) de la vésicule optique (Figure 3E). Assurez-vous que les électrodes ne touchent pas l’embryon ou les vaisseaux sanguins. Appliquer des champs électriques pulsés.
- Retirez les électrodes et nettoyez-les délicatement avec un coton-tige stérile imbibé d’eau pour éviter l’accumulation d’albumine.
- Scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et réincubez l’embryon jusqu’au stade de développement souhaité.
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Representative Results
Construction de constructions de transposons Tol2 pour l’expression de miARN artificiels contre Nel
Le nel (facteurde croissance pidermique (EGF)-Like (N eural E) est une glycoprotéine extracellulaire. Il présente des similitudes structurelles avec la thrombospondine-1 et est principalement exprimé dans le système nerveux20,21. Nous avons précédemment démontré que Nel régule la différenciation et la survie des cellules ganglionnaires de la rétine15 et agit comme un signal de guidage inhibiteur pour les axones rétiniens22,23,24. Dans la rétine du poussin en développement, l’expression de Nel est détectée dans l’épithélium pigmentaire présumé à HH15 (jour embryonnaire (E) 2,5). À HH20 (E3.5), l’expression de Nel est également observée dans les cellules ganglionnaires rétiniennes nouvellement différenciées. Une forte expression de Nel dans l’épithélium pigmentaire et les cellules ganglionnaires de la rétine se poursuit au moins jusqu’à E1815.
Pour examiner la fonction de Nel dans le développement des cellules ganglionnaires rétiniennes, l’expression du gène Nel a été inhibée en introduisant des miARN artificiels dans la rétine en développement à l’aide de l’électroporation in ovo et du système de transposons Tol215,16. Tout d’abord, des paires d’oligonucléotides d’ADN simple brin ont été conçues pour 10 séquences cibles potentielles dans la région codant pour les protéines de l’ADNc de Nel de poulet (numéro d’acquisition GenBank : NM_001030740.1) à l’aide de l’outil de conception d’ARNi en ligne (voir le tableau des matériaux). Les paires d’oligonucléotides ont été recuites et clonées individuellement dans le vecteur d’expression des miARN. Ensuite, les constructions individuelles ont été transfectées dans HEK293T cellules qui expriment de manière stable Nel-AP, et leurs efficacités de knockdown ont été évaluées en mesurant l’activité AP dans les milieux de culture. Le plasmide de contrôle négatif pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative a été utilisé comme témoin (Figure 4A).
Trois séquences pré-miARN Nel qui ont montré les effets d’inhibition les plus élevés ont été sélectionnées (contre les nucléotides 482-502, 910-930 et 2461-2481 de l’ADNc Nel de poulet, respectivement), et deux séquences pré-miARN ont été clonées en tandem dans le vecteur d’expression des miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pré-miARN), selon les instructions du fabricant17. Les cassettes d’expression codant pour les deux pré-miARN et EmGFP ont été amplifiées par PCR avec un site EcoRI artificiel aux deux extrémités (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ et 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) et clonées dans le vecteur pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pré-miARN). La séquence de la cassette d’expression a été confirmée à l’aide des amorces utilisées pour la PCR. Les constructions pré-miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel ont été co-transfectées individuellement avec le vecteur d’expression de la transposase Tol2 (pCAGGS-T2TP) dans HEK293T cellules qui expriment de manière stable Nel-AP, et les effets inhibiteurs sur l’expression de Nel-AP ont été évalués en mesurant les activités AP dans les milieux de culture. Comme le montre la figure 4B, l’efficacité du knockdown a été significativement améliorée par le chaînage de deux séquences de miARN. Une suppression robuste de l’expression de Nel-AP (plus de 90 %) a été observée au moins jusqu’à 13 jours après la transfection (Figure 4B).
Suppression stable de l’expression de Nel dans la rétine du poussin en développement
Une construction pré-miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel (contenant les séquences cibles des nucléotides 482-502 et 2461-2481 de l’ADNc Nel de poulet) a été co-transfectée avec le vecteur d’expression de la transposase (pCAGGS-T2TP) dans la face temporale ou nasale de la rétine du poussin par électroporation in ovo à HH9-11 (Figure 3, Figure 5A). Des coupes ont été préparées à partir de rétines E4.5 ou E8, et les effets sur l’expression de Nel ont été évalués par immunohistochimie à l’aide d’anticorps anti-Nel22. À E4.5, l’expression de Nel dans l’épithélium pigmentaire rétinien a été significativement réduite dans les cellules exprimant EmGFP (Figure 5B-D). À E8, des diminutions de l’expression de Nel ont également été clairement observées dans les cellules ganglionnaires de la rétine (Figure 5E-I). La suppression significative de l’expression de Nel s’est poursuivie au moins jusqu’à E18 (données non présentées). L’introduction de miARN témoins n’a pas affecté l’expression de Nel dans la rétine (Figure 5J-O).
Figure 1 : Transposition d’ADNc flanqués de Tol2 par transposase. Schéma montrant la transposition d’une cassette d’expression flanquée de Tol2 pour EmGFP et d’une chaîne de deux séquences de pré-miARN (2x pré-miARN) par transposase. Lorsqu’un vecteur transposon Tol2 contenant la cassette d’expression (construction de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x) est introduit dans des cellules avec une construction d’expression de transposase Tol2 (pCAGGS-T2TP), la cassette d’expression flanquée de Tol2 est excisée du vecteur et intégrée dans le génome de l’hôte par l’activité de transposase. L’expression de l’EmGFP et des miARN est pilotée par le promoteur omniprésent CAGGS. Ce chiffre a été modifié à partir de Nakamoto et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Structure du pré-miARN modifié. (A) La séquence pré-miARN conçue est basée sur la séquence miR-155 murine17. L’oligo du brin supérieur contient (de l’extrémité 5' à l’extrémité 3') un surplomb de quatre nucléotides (TGCT (bleu)), une séquence cible antisens (21 nucléotides), une séquence de boucle terminale (rouge) et une séquence cible de détection (19 nucléotides). La séquence cible antisens représente la séquence de miARN mature. L’oligo du brin inférieur contient un surplomb de 5' à quatre nucléotides (CCTG (bleu)) et la séquence du complément inverse de l’oligo du brin supérieur, mais il manque le surplomb de quatre nucléotides à l’extrémité 3' (AGCA-3' : complément inverse du 5'-TGCT de l’oligo du brin supérieur). La séquence cible sensorielle est dépourvue des nucléotides 9 et 10 de la séquence cible. Les deux nucléotides « supplémentaires » de la séquence cible antisens forment une boucle interne dans la structure tige-boucle de la molécule de miARN mature, ce qui se traduit par un taux de knockdown plus élevé17. (B) Un exemple de séquence cible contre le poulet Nel. Les séquences sensées et antisens dans les brins supérieur et inférieur d’une séquence cible du gène Nel du poulet (numéro d’acquisition GenBank NM_001030740.1, nucléotides 482-502) sont présentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Micro-injection et électroporation in ovo. (A) Poste de travail pour la micro-injection et l’électroporation in ovo. (1) Microscope à dissection. (2) Appareil d’injection. (3) Appareil d’électroporation. (4) Double illuminateur de microscope à col de cygne. (5) Électroporator. (B) Appareil d’injection. Une seringue Hamilton (6) munie d’une aiguille de 18 G (7) est reliée à un tube en PVC (8) et à une aiguille de micropipette tirée (9) et placée sur un micromanipulateur (10). L’espace intérieur de l’appareil est rempli d’huile minérale lourde. (C) Appareils d’électroporation. Un jeu d’électrodes en platine (11) avec un porte-électrode (12) est placé sur un micromanipulateur (13). Les électrodes sont reliées à l’électroporateur par des câbles (14). (D) Micro-injection d’une solution de cocktail d’ADN dans la vésicule optique à HH 10-11. L’aiguille de la micropipette est insérée dans la vésicule optique par son côté proximal. Une solution cocktail d’ADN avec du vert rapide (bleu) est injectée dans la vésicule optique jusqu’à ce que le colorant remplisse toute la lumière. (E) Électroporation dans la vésicule optique. Les électrodes sont placées en parallèle (la distance entre les électrodes est de 2 mm) et de manière à ce que la vésicule optique injectée soit située entre les électrodes : une électrode est située près de la surface antérieure (nasale) de la vésicule optique, et l’autre se trouve dans la partie postérieure de l’embryon au niveau du cerveau postérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Évaluation in vitro de séquences de pré-miARN individuelles ou chaînées pour l’efficacité de la suppression du gène Nel. (A) Effets d’inhibition des séquences individuelles de pré-miARN. Les résultats de cinq constructions représentatives (séquences cibles antisens correspondant aux numéros de nucléotides 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 et 2461-2481 de l’ADNc de poulet Nel (numéro d’acquisition GenBank : NM_001030740.1)) sont présentés. Des constructions individuelles d’expression de miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pré-miARN) ont été transfectées dans HEK293T cellules qui expriment de manière stable Nel-AP. Le plasmide de contrôle négatif pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative a été utilisé comme témoin. L’expression de Nel-AP a été évaluée en mesurant les activités de l’AP dans les milieux de culture 48 à 96 h après la transfection. Trois constructions d’expression pré-miARN de Nel (contre les nucléotides 482-502, 910-930 et 2461-2481, respectivement) ont montré une suppression significative de l’expression de Nel. (B) Effets de knockdown des séquences de pré-miARN chaînées. Deux des trois séquences pré-miARN les plus puissantes (contre les nucléotides 482-502, 910-930 et 2461-2481) ont été clonées en tandem dans le vecteur pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR, et la cassette d’expression (contenant les deux séquences pré-miARN et l’ADNc EmGFP) a été transférée sur le vecteur pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pré-miARN). Les constructions de pré-miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel ont été co-transfectées individuellement avec des vecteurs d’expression de la transposase Tol2 (pCAGGS-T2TP) dans HEK293T cellules qui expriment de manière stable Nel-AP, et l’expression de Nel-AP a été évaluée en mesurant les activités AP dans les milieux de culture de 2 à 13 jours après la transfection. Les trois combinaisons (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) ont montré des activités de suppression accrues par rapport aux séquences individuelles de pré-miARN non chaînées. Une suppression significative de l’expression de Nel-AP a été observée du jour 2 au jour 13 au moins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Inhibition stable de l’expression de Nel dans la rétine du poussin en développement par l’intégration du transgène MiRNA médiée par le transposon Tol2. Une construction de transposon Tol2 contenant une cassette d’expression de deux séquences de pré-miARN Nel et EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) ou une construction de contrôle qui exprime un miARN et un EmGFP non apparentés (J-O) a été co-transfectée avec un vecteur d’expression de la transposase (pCAGGS-T2TP) dans la moitié temporale ou nasale de la vésicule optique par in ovo électroporation à HH9-HH11 (E1.5). Des coupes rétiniennes ont été préparées à E4.5 (B-D, J-L) ou E8 (E-I, M-O), et l’efficacité de la suppression du gène Nel a été examinée par immunohistochimie à l’aide d’anticorps anti-Nel (rouge). Étant donné que l’ADN est chargé négativement, les transgènes sont électroporés dans le tissu du côté de l’anode ; ainsi, seule la moitié de la rétine a été marquée avec EmGFP (côté transfection (TF), vert). (A) Expression du gène marqueur EmGFP dans la moitié temporale de la rétine à E4.5. La fissure optique (flèche blanche) représente la limite entre les côtés transfectés et non transfectés (témoins). (B-I) Inactivation de l’ARNi de l’expression de Nel dans la rétine du poussin en développement. (B-D) À E4.5, l’expression de Nel est significativement réduite (B,D) dans les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (PE) qui expriment EmGFP (C,D). Notez le schéma complémentaire de l’immunomarquage de Nel et de l’expression d’EmGFP chez D. NR, rétine neurale. (E-I) À E8, l’expression de Nel (E,G) dans l’épithélium pigmentaire rétinien et la couche de cellules ganglionnaires (GCL) est diminuée du côté de la transfection (F,G). (H, I) Vues à fort grossissement d’une zone de transfection et d’une zone de contrôle correspondante en E (indiquées par de petits rectangles), respectivement. (D,G) Images fusionnées des deux images de gauche. (J-O) Expression du miARN témoin. L’introduction de la construction de contrôle négative n’affecte pas l’expression de Nel dans la rétine E4.5 (J-L) ou E8 (M-O). (L,O) Images fusionnées des deux images de gauche. La limite entre les côtés de transfection et de contrôle est indiquée par une ligne pointillée en C, F, K et N. Des barres d’échelle de 50 μm. (A) et (B-I) ont été modifiées à partir de Nakamoto, M. et Nakamoto, C 16 et Nakamoto et al.15, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Configuration de la réaction de recuit | |
| Oligo brin supérieur (200 μM dans le tampon TE) | 5 μL (concentration finale 50 μM) |
| Oligo brin inférieur (200 μM dans le tampon TE) | 5 μL (concentration finale 50 μM) |
| 10x tampon de recuit Oligo* | 2 μL |
| Eau exempte de DNase/RNase* | 8 μL |
| Total | 20 μL |
| * Fourni dans le kit d’expression des miARN (voir Tableau des matériaux) | |
Tableau 1 : Configuration de la réaction de recuit
| 2x tampon de substrat AP | |
| 10 M diéthanolamine (pH 9,8) | 4 ml |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-Homoarginine | 45 mg (en anglais seulement) |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 10 mg (en anglais seulement) |
| p-nitrophénylphosphate | 63 mg (en anglais seulement) |
| H2O | Ajouter pour obtenir un volume total de 20 mL |
Tableau 2 : 2 tampons de substrat AP. La solution doit être conservée en aliquotes à -20 °C et à l’abri de la lumière car le p-nitrophénylphosphate est sensible à la lumière.
| Configuration de la réaction | |||
| Plasmide pré-miARN pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x (Extrait de la section 1.5) ou plasmide témoin négatif pour pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x tampon Pfu | 5 μL | ||
| Mélange dNTP (10 mM de chacun des dATP, dCTP, dGTP et dTTP) | 1 μL | ||
| Amorce directe EmGFP* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3' ; 10 μM) | 1 μL | ||
| amorce inverse de miARN* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3' ; 10 μM) | 1 μL | ||
| ADN polymérase Pfu (5 unités/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Volume total | 50 μL | ||
| * Fourni dans le kit d’expression des miARN. | |||
| Conditions de thermocyclage | |||
| 94 °C | 5 min (en anglais) | ||
| 30 cycles des éléments suivants : | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 min (en anglais) | ||
| 72 °C | 2 min (en anglais) | ||
| 72 °C | 10 min (en anglais) | ||
Tableau 3 : Configuration de la réaction et conditions de thermocyclage.
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Discussion
Ce protocole fournit un guide détaillé sur le silençage génique dans la rétine du poussin en développement par l’expression transgénique de miARN artificiels à l’aide de l’électroporation in ovo et du système de transposon Tol2.
Les facteurs suivants sont d’une importance cruciale pour l’exécution réussie de cette technique. Tout d’abord, il est essentiel d’utiliser des séquences de miARN dont il est confirmé qu’elles exercent des effets de knockdown robustes. Avant de les appliquer pour l’électroporation in ovo , testez les séquences individuelles de pré-miARN pour l’efficacité de la suppression des gènes dans les essais in vitro (étape 1.4) et enchaînez deux séquences de pré-miARN qui montrent les activités de knockdown les plus élevées (étape 1.5). Deuxièmement, il est important de ne pas endommager la vésicule optique et les tissus nerveux environnants lors de l’insertion de l’aiguille de micropipette pour l’injection de la solution d’ADN. Des dommages excessifs sur les embryons peuvent entraîner une malformation embryonnaire et la mort. Pour éviter d’endommager les tissus, introduisez la micropipette dans la vésicule optique dans le bon sens. Des pointes plus petites et plus pointues de l’aiguille de la micropipette rendraient la pénétration de la vésicule optique plus douce et entraîneraient moins de dommages tissulaires. Cependant, les aiguilles à très petites pointes ont du mal à charger et à libérer la solution d’ADN. Dans l’étude décrite ici, des aiguilles avec une ouverture de pointe de 10 à 20 μm de diamètre ont été utilisées. Troisièmement, assurez-vous de remplir toute la vésicule optique avec la solution d’ADN (comme le montre la propagation du vert rapide). Quatrièmement, placez les électrodes dans les positions optimales pour cibler l’ADN dans la zone souhaitée de la vésicule optique (par exemple, côté temporal, côté nasal). Les molécules d’ADN chargées négativement se déplaceront vers le côté de l’anode ; Par conséquent, le placement et l’orientation précis des électrodes affectent de manière critique les résultats finaux. Enfin, utilisez les concentrations optimales d’ADN et les paramètres d’électroporation.
Si aucun signal fluorescent n’est observé après 24 h d’électroporation, les éléments suivants doivent être envisagés : (1) Confirmer que les plasmides électroporés ont des séquences correctes. (2) Revérifier la concentration et la pureté des plasmides individuels. (3) Assurez-vous que la solution d’ADN remplit la lumière de la vésicule optique et qu’elle ne se diffuse pas dans le tube neural. (4) Vérifiez que les paramètres d’électroporation utilisés sont corrects. (5) Vérifiez que les électrodes sont en contact avec la membrane vitelline pendant l’application des impulsions électriques.
La combinaison de l’électroporation in ovo et d’une méthode d’intégration génique médiée par transposon dans ce protocole offre plusieurs avantages distincts. Tout d’abord, il favorise la production stable de miARN et donc la suppression persistante des gènes cibles. Le développement de la rétine du poussin commence à E1,5 et se poursuit jusqu’à l’éclosion (les cellules ganglionnaires de la rétine sont produites sur la période de E2 à E9). Pour l’analyse de la perte de fonction des gènes, l’expression des miARN artificiels doit être maintenue de manière stable pendant cette période. L’expression des séquences d’ARNi à l’aide de vecteurs d’expression conventionnels est généralement transitoire car la construction de l’expression ne parvient pas à être intégrée efficacement dans les chromosomes. Dans la méthode décrite ici, cependant, l’intégration chromosomique de la cassette d’expression est médiée par l’activité de la transposase co-électroporée, ce qui se traduit par une expression stable des transgènes.
Deuxièmement, dans cette méthode, le même promoteur CAGGS induit l’expression co-cistronique de plusieurs séquences de miARN et du marqueur EmGFP dans les cellules transfectées, contournant ainsi le risque d’interférence du promoteur, qui est l’une des complications courantes avec les vecteurs rétroviraux contenant deux promoteurs pour atteindre l’expression d’un double gène25.
Enfin, contrairement aux vecteurs rétroviraux compétents pour la réplication, le transgène électroporé par cette méthode n’est pas transféré aux cellules voisines. Par conséquent, la zone de transfection peut être contrôlée avec plus de précision en utilisant les types d’électrodes appropriés et en les plaçant dans les bonnes positions.
Malgré les avantages décrits ci-dessus, la méthode actuelle présente également des limites inhérentes à l’électroporation ovo . Par exemple, les taux de transfection et de suppression génique peuvent varier d’un embryon à l’autre, et un nombre relativement important d’embryons peut devoir être transfecté à des fins d’analyse. De plus, l’électroporation dans la rétine embryonnaire in ovo à des stades de développement ultérieurs (par exemple, E4-E5) présente des difficultés expérimentales car les yeux sont situés à proximité du cœur à ces stades, ce qui augmente le risque d’arrêt cardiaque après électroporation.
Le système décrit ici permet une suppression rapide et robuste des gènes dans la rétine du poussin en développement. Cette approche peut également être appliquée à d’autres parties de l’embryon de poussin, y compris les tissus neuraux et non neuraux. Nous nous attendons donc à ce que ce système puisse contribuer à l’élucidation des mécanismes moléculaires du développement des poussins.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les vecteurs pT2K-CAGGS et pCAGGS-T2TP ont été aimablement fournis par Yoshiko Takahashi (Université de Kyoto, Kyoto, Japon) et Koichi Kawakami (Institut national de génétique, Mishima, Japon), respectivement. Nous remercions Michael Berberoglu pour sa lecture cruciale du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Royal Society et du Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Royaume-Uni) à M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
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