Detección y análisis automatizados de exocitosis

Summary

Desarrollamos un software automatizado de visión por computadora para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensibles al pH. Aquí, demostramos el uso de una interfaz gráfica de usuario y RStudio para detectar eventos de fusión, analizar y mostrar parámetros espaciotemporales de fusión y clasificar eventos en distintos modos de fusión.

Abstract

La microscopía TIRF de lapso de tiempo de GFP sensible al pH (pHluorin) unida a las proteínas SNARE de vesícula es un método eficaz para visualizar eventos exocíticos de vesícula única en cultivo celular. Para realizar una identificación y análisis imparcial y eficiente de dichos eventos, se desarrolló e implementó en MATLAB un enfoque basado en la visión por computadora. La canalización de análisis consiste en un algoritmo de segmentación celular e identificación de eventos exocíticos. El enfoque de visión por computadora incluye herramientas para investigar múltiples parámetros de eventos individuales, incluida la vida media de la desintegración por fluorescencia y el pico de ΔF / F, así como el análisis de células enteras de la frecuencia de la exocitosis. Estos y otros parámetros de fusión se utilizan en un enfoque de clasificación para distinguir distintos modos de fusión. Aquí, una GUI recién construida realiza la canalización de análisis de principio a fin. La adaptación adicional de la función K de Ripley en R Studio se utiliza para distinguir entre la ocurrencia agrupada, dispersa o aleatoria de eventos de fusión tanto en el espacio como en el tiempo.

Introduction

Las construcciones VAMP-pHluorin o el receptor de transferrina (TfR)-pHuji son excelentes marcadores de eventos exocióticos, ya que estos fluoróforos sensibles al pH se apagan dentro de la luz de la vesícula ácida y la fluorescencia inmediatamente después de la apertura del poro de fusión entre la vesícula y la membrana plasmática¹. Después de la apertura del poro de fusión, la fluorescencia decae exponencialmente, con cierta heterogeneidad que revela información sobre el evento de fusión. Aquí, se describe una aplicación de interfaz gráfica de usuario (GUI) que detecta y analiza automáticamente los eventos exocióticos. Esta aplicación permite ....

Protocol

1. Elija conjuntos de datos y directorio

1. Para seleccionar conjuntos de datos para su análisis, haga clic en el botón Buscar conjuntos de datos ( Figura2A, cuadro rojo 1) para navegar a la carpeta donde se depositan los datos (por ejemplo, la carpeta RawData). Los archivos de datos rellenarán automáticamente los archivos de datos como una lista. Puede haber más de un conjunto de datos en la carpeta.
2. Haga clic en el botón Elegir directorio y seleccione el directorio (por ejemplo, Prueba) donde se depositarán los archivos analizados(Figura 2A,

Results

Aquí se utilizó la GUI(Figura 2A)para analizar eventos exocíticos de tres neuronas que expresan VAMP2-pHluorin a 3 DIV utilizando microscopía TIRF (fluorescencia de reflexión interna total). Se aislaron las neuronas corticales E15.5, seguidas de la transfección con VAMP2-pHluorin y el recubrimiento utilizando los protocolos descritos en Winkle et al., 2016 y Viesselmann et al., 2011^11,12. La metodología de los parámetros de imagen es.......

Discussion

Al utilizar el software de detección y análisis exocítico, tenga en cuenta que el programa solo acepta la compresión sin pérdidas .tif archivos como entrada. Los archivos de imagen .tif pueden ser imágenes de escala de grises (un solo canal) de 8 bits, 16 bits o 32 bits. Otros formatos de imagen deben convertirse a uno de estos tipos antes de la entrada. Como referencia, los ejemplos utilizados aquí son imágenes en escala de grises de 16 bits.

Inherentes al proceso de detección automatizada, l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Equipo
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Rstudio	, Rstudio, PBC		https://rstudio.com/