Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.
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Artículo de método
Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra se ha convertido en un importante modelo animal para estudiar las enfermedades humanas, especialmente el cáncer. Junto con las robustas tecnologías de edición transgénica y genómica aplicadas en el modelado del pez cebra, la facilidad de mantenimiento, la productividad de alto rendimiento y las potentes imágenes en vivo en conjunto hacen del pez cebra un valioso sistema modelo para estudiar la metástasis y las bases celulares y moleculares subyacentes a este proceso in vivo. El primer modelo de metástasis de neuroblastoma (NB) del pez cebra se desarrolló sobreexpresando dos oncogenes, MYCN y LMO1, bajo control del promotor dopamina-beta-hidroxilasa (dβh). La coexpresión de MYCN y LMO1 condujo a la reducción de la latencia y al aumento de la penetrancia de la neuroblastomagénesis, así como a la metástasis a distancia acelerada de las células tumorales. Este nuevo modelo reitera de manera confiable muchas características clave de la NB metastásica humana, incluida la participación de alteraciones genéticas clínicamente relevantes y asociadas a metástasis; desarrollo natural y espontáneo de metástasis in vivo; y sitios conservados de metástasis. Por lo tanto, el modelo de pez cebra posee ventajas únicas para diseccionar el complejo proceso de metástasis tumoral in vivo.
Introducción
El pez cebra ha sido ampliamente utilizado y aplicado a varias áreas de investigación, especialmente en cáncer. Este modelo proporciona muchas ventajas, como su reproducción robusta, mantenimiento rentable y visualización versátil del crecimiento tumoral y la metástasis, todo lo cual hace del pez cebra una herramienta poderosa para estudiar e investigar las bases celulares y moleculares de la tumorigénesis y la metástasis. Las nuevas técnicas para el mapeo del genoma a gran escala, la transgénesis, la sobreexpresión o eliminación de genes, el trasplante de células y las pantallas químicas han aumentado enormemente el poder del modelo del pez cebra1
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Protocolo
Todos los métodos de investigación con pez cebra y cuidado/mantenimiento de animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales de Mayo Clinic.
1. Preparación y microinyección de constructos transgénicos para el desarrollo de línea de pez cebra transgénico LMO1 con sobreexpresión en PSNS
- Para desarrollar el clon de entrada LMO1-pDONR221 , amplifique la región codificante del LMO1 humano a partir del ADNc obtenido de la línea celular humana mediante PCR.
- Realice una reacción de 25 μL como se detalla aquí: 2,5 μL de tampón de reacción Taq estándar 10x, 0,125 μL de ADN....
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Resultados
Para determinar si LMO1 se sinergiza con MYCN para afectar la patogénesis de NB, se inyectaron construcciones transgénicas que impulsan la expresión de LMO1 (dβh: LMO1 y dβh: mCherry) o MYCN (dβh: EGFP-MYCN) en las células PSNS bajo control del promotor dβh en embriones de pez cebra13. Como se ilustra en la Figura 1A, después del desarrollo de líneas transgénicas estables y la validación de sus ge.......
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Discusión
El pez cebra se ha utilizado comúnmente en la investigación durante las últimas décadas, especialmente en la investigación del cáncer, por razones obvias, como su facilidad de mantenimiento, reproducción robusta y claras ventajas para la imagen in vivo1,28. El modelo de pez cebra puede manipularse fácilmente embrionariamente debido a su fertilización y desarrollo externo, lo que complementa bien a los organismos modelo de mamíferos, como ratas y ratones,.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención R01 CA240323 (S.Z.) del Instituto Nacional del Cáncer; una subvención W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) del Departamento de Defensa de los Estados Unidos (DoD); un premio V Scholar de la V Foundation for Cancer Research (S.Z.) y una beca platform del Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); y el apoyo del Centro Oncológico de Mayo Clinic y del Centro de Medicina Individualizada (S.Z.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3,3'-diaminobenzidina (DAB) Kit | Vector | SK-4100 | |
| Ácido acético | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarosa GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (TH) | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidina/Biotina Kit de bloqueo | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND diluyente de anticuerpos primarios | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| Instrumento BOND-MAX IHC Leica | Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | sistema de tinción IHQ totalmente automatizado |
| CH211-270H11 clon BAC | Centro de recursos BACPAC (BRFC) | N/A | |
| Microscopio compuesto equipado con cámara DP71 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (medio de montaje a base de xileno) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | listo para usar (no se necesita preparación) |
| Etanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expandir sistema de PCR de plantilla larga | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Mezcla de enzimas Clonasa II | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Mezcla de enzimas clonasa II | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Anticuerpo secundario anti-Rb de cabra (biotinilado) | Dako | E0432 | |
| Solución de hematoxilina, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Ácido clorhídrico | Solutions | 4360-1L | |
| Peróxido de hidrógeno, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzima | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Sulfato de kanamicina | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Profesional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Carbonato de litio | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtomo para seccionar | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Químicamente competente E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. de Utah | N/A | un generoso regalo (Por favor, consulte la página web http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page para obtener material, que se distribuye gratuitamente como se describe.) |
| Cera de parafina | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin a parafina |
| Paraformaldehído | Alfa Aesar | A11313 | |
| vector pDEST (vector de destino modificado que contiene sitios de reconocimiento I-SceI) | Dr. C. Grabher, Instituto de Tecnología de Karlsruhe, Karlsruhe, Alemania | N/A | un generoso regalo |
| pDONR 221 vector donante de pasarela | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R vector | donante Dr. Chi-Bin Chien, Univ. de Utah | N/A | un generoso regalo |
| Rojo de fenol, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius kit de tinción roja | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinasa K, recombinante, grado PCR | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Descalcificador rápido | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Azida de sodio (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Microscopio de fluorescencia estereoscópica | Leica | MZ10F | |
| Microscopio de fluorescencia estereoscópico equipado con una mira digital Cámara DS-U1 para la adquisición de imágenes | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 Procesador de infiltración al vacío AI | Sakura | N/A | Modelo #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xileno | Thermo Fisher Scientific X3P1GAL |
Referencias
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
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Reimpresiones y permisos
