Summary
ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。
Abstract
クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子(TF)、クロマチン調節因子、ヒストン修飾の全ゲノム位置をマッピングし、TF結合パターンおよびヒストンポスト修飾を明らかにするための全ゲノムを検出するための強力で広く使用されている分子技術です。ヒストンメチル化などのクロマチン修飾作用は、特定の遺伝子調節配列に採用されることが多く、クロマチン構造の局所的な変化を引き起こし、特定の転写効果を生じる。米の爆発は、世界中の米に壊滅的な真菌病であり、真菌と植物の相互作用を研究するためのモデルシステムです。しかし、ヒストン修飾が Magnaporthe oryzae の毒性遺伝子をどのように調節するかの分子メカニズムは依然として不可解である。より多くの研究者は、ヒストンエピジェネティック修飾が標的遺伝子をどのように調節するかを研究するためにChIP-seqを使用する必要があります。また、動物や植物のタンパク質とDNAの相互作用を研究するために広く使用されていますが、植物病理学の分野ではあまり使用されておらず、十分に開発されていません。本論文では 、M.オリザ エの機能性標的遺伝子に結合するヒストンメチル化(H3K4me3など)のゲノム全体分布を同定するための、ChIP-seqの実験過程と操作方法について述べた。ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。
Introduction
エピジェネティクスは、遺伝子の塩基配列を変化させることなく遺伝子発現の遺伝性変化を指す遺伝子研究の一分野です。エピジェネティックな調節が真核細胞の増殖と発達において重要な役割を果たしていることを示す研究が増えているが、折りたたみと組み立ての動的過程を通じて遺伝子発現を制御し、影響を与えるクロマチンを含む1,2.クロマチンリモデリングおよび共有ヒストン修飾は、クロマチンポリマーの変動を通じてクロマチンの機能および構造に影響を及ぼし、それにより遺伝子発現3、4、5、6を調節する機能を達成する。ヒストンの翻訳後修飾には、アセチル化、リン酸化、メチル化、モノユビキチン化、相総化、およびADPリボシル化7、8、9が含まれる。ヒストンH3K4メチル化、特にトリメチル化は、真核生物10,11における転写複製、再結合、修復、およびRNA処理に関連する転写開始部位にマッピングされている。
ChIP-seq技術は2007年に導入され、転写制御およびエピジェネティック機構12,13のゲノム全体解析の実験基準となっている。この方法は、ゲノムワイドスケールで、DNA結合タンパク質のDNAセグメントを含むヒストンまたは転写因子相互作用情報を得るのに適している。目的のタンパク質に架橋されたDNA配列は、クロマチン複合体の一部として共沈殿します。新世代シーケンシング技術は、36-100bpのDNAを配列するためにも使用され、その後、対応する標的ゲノムと一致する。
植物病原性真菌では、最近、ヒストンメチル化修飾が病原性の過程で標的遺伝子をどのように調節するかを研究し始めている。いくつかの以前の研究は、ヒストンメチラーゼ関連遺伝子の調節が主に遺伝子サイレンシングおよび二次代謝産物(SM)の産生を触媒することに反映されることを証明した。MoSet1は、MオリザエのH3K4メチラーゼです。この遺伝子のノックアウトは、H3K4me3改変14の完全な欠失をもたらす。野生型株と比較して、変異体における遺伝子MoCEL7Cの発現は、CMC誘発状態および非誘導状態(グルコースまたはセロビオース)において阻害され、MoCEL7Cの発現は15増加した。Fusarium graminearumでは、KMT6はH3K27me3のメチル化修飾を触媒し、真菌の正常な発達を調節し、SM遺伝子クラスター16、17、18、19を含む「暗号ゲノム」を調節するのに役立つ。2013年、コノリーは、H3K9およびH3K27メチル化が、標的遺伝子20の阻害を調節する二次代謝産物およびエフェクター因子を通じて真菌の病原性プロセスを調節すると報告した。アスペルギルスにおいて、ヒストンH3K4me2およびH3K4me3の改変は、遺伝子活性化に関連しており、SM遺伝子クラスター21のクロマチンレベル調節を制御する上で重要な役割を果たす。M.オリザエにおいて、Tig1(酵母および哺乳動物におけるTig1に相同性)はHADC(ヒストンデアセチラーゼ)22である。Tig1遺伝子のノックアウトは、ヌル突然変異体における病原性および胞胞体産生能力の完全な喪失をもたらす。感染性ヒphphae22を産生できない過酸素環境に対してより敏感である。
M.oryzae.によって引き起こされる米の爆発は、世界で最も深刻な米の病気の一つです19.その代表的な感染過程のために、M.oryzaeは多くの重要な病原性真菌の感染過程に類似している。容易に分子遺伝学的操作を行うことができるので、真菌は真菌と植物の相互作用を研究するためのモデル生物23となっている。M.オリザエの感染過程のすべてのステップを遮断すると、感染が失敗する可能性があります。感染過程における形態変化は、ゲノム機能全体と遺伝子転写によって厳密に調節される。中でも、ヒストンメチル化などのエピジェネティック修飾は、機能性遺伝子24,25の転写調節に不可欠な役割を果たす。しかし、これまでのところ、M.オリザエにおける病原性遺伝子の転写におけるヒストンメチル化およびヒストンアセチル化などのエピジェネティック修飾の分子機構に関する研究はほとんど行われていない。したがって、これらの病原性遺伝子の上流および下流の調節ネットワークを研究しながら、稲芽菌のエピジェネティックな調節機構をさらに開発することは、米爆風予防および制御戦略の開発に役立つ。
特にエピジェネティクスにおけるChIP-seqなどの機能性ゲノミクスの開発により、このハイスループットデータ取得法により染色体の研究が加速されました。ChIP-seq実験技術を用いて 、M.オリザエ および他の糸状菌におけるヒストンメチル化(H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3など)のゲノム全体の分布を同定することができる。したがって、この方法は、エピジェネティック修飾が植物病理における真菌病因の間に候補標的遺伝子を調節する方法の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。
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Protocol
1. Mオリザエからのプロトプラストの調製
- オートミールトマト寒天(OTA)を準備します。
- オートミールの30〜50gの重量を量り、20分間水(ddH2O)の800 mLでそれを沸騰させます。ガーゼの2層を通してフィルタリングし、濾液を取ります。
- 熟したトマトを選び、皮をむきます。ジュースを絞り、2層のガーゼを通して濾過し、濾過されたジュースの150 mLを集めます。
- すべてのトマトジュースと準備したオート麦を十分に混ぜ、ddH2Oを1000 mLまで加えます。
- 500 mL の円錐フラスコに OTA 250 mL と 2.5 g の寒天粉末を加え、オートクレーブを 20 分間追加します。25°Cで保管。
- オートクレーブしたOTAをガラス5cm x 5cmのペトリ皿に25mL注ぎます。これらのペトリ料理の合計10を準備します。OTAがペトリ料理に固まった後、25°Cで料理を逆さまに保管してください。
- 殺菌された爪楊枝を使用して 、M.オリザエ (野生型株P131、ノックアウト株 Δmobre2、Δmospp1、Δmoswd2)から菌糸体の小片を掘り出し、準備されたOTA料理に置きます。光条件下で28°Cで4~6日間培養します。
注:汚染を防ぐためにペトリ皿を逆さまにしてください。 - 1000 μL の液体コンプリートミディアム(CM)(0.6%酵母エキス、0.3%酵素カゼイン加水分解物、0.3%酸性カゼイン加水分解物、1%グルコース)を1000 μL ピペットを使用してOTAディッシュに添加します。
注:4-6日間OTA料理に催眠術が生えました。 - 野生型のひずみとノックアウトの菌株を接種ループで削ります。
- ミセリアの破片を収集し、液体コンプリートミディアム(CM)の250 mLに転送します。
- 150 rpmで振る28°Cで36時間の三角形フラスコで真菌の破片を成長させる。
- 漏斗を使用して、真菌のヒファをフィルタリングして収集します。
- 真菌性ヒファを0.7 M NaCl溶液の500 mLで洗浄します。
- 真菌菌糸体を収集し、それを量る。
注:菌糸体は計量前に乾燥する必要はありません。 - 菌糸菌の1gあたり溶解酵素透過液の〜1 mLを加えます。
- トリコデルマ・ハルジアナムの溶解酵素を0.7M NaClに溶解させて、20mg/mL溶解酵素透過液を調製します。
- 150 rpmで振りながら、28°Cで3〜4時間に合わせる場合にヒファエを置きます。
- 溶解したヒファエを0.7 M NaCl溶液の50 mLで洗浄します。
- プロトプラストと遠心分離機を2,000 x g および4 °Cで15分間回収します。
- 遠心後、上清を慎重に捨てます。プロトプラストを4°Cで0.7 M NaCIバッファーの20 mLに再懸濁します。
2. 生体内架橋と超音波処理
- 55 μLのホルムアルデヒドを加え(最終濃度が1%になるまで滴下してホルムアルデヒドを加えて)、架橋用のプロトプラストを含むNaCIバッファーの2mLに添加します。
- プロトプラストを25°Cで10分間インキュベートします。
- 各チューブに20μLの10μLのグリシンを加え、未反応のホルムアルデヒドを急がせます。
- 25°Cで5分間混合してインキュベートします。
- 2,000 x g および 4 °C で 15 分間の遠心分離機。
- 遠心後、上清を慎重に捨てます。ペレットを0.7 M NaCI溶液の1 mLに再懸濁します。
- 2,000 x g および 4 °C で 10 分間の遠心分離機。
- 遠心後、上清を慎重に捨てます。750 μL の RIPA バッファー(50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、プロテアーゼ阻害剤) でペレットを再懸濁します。
- 20xプロテアーゼ阻害剤の37.5 μLを加えます。
- 前のステップから1.5 mL遠心分離管にプロトプラストを移します。
- 超音波処理(25%W、出力3 s、5 s、4°C)を超音波処理を約10分間超音波処理器で直ちに行います。このステップの目的は、最良の条件を決定するために一定期間架橋ライセートを超音波処理することです。
注:このステップで-80°Cで凍結することができます。 - 超音波処理の最適条件が既に決定されている場合は、次の手順に進みます。
- 必要に応じて、アガロースゲル分析用に5μLのプロトプラスト(未シェレドDNA)を除去します。
- 8分間超音波ホモジナイザー(25%W、出力3s、ストップ5 s、4°C)で超音波処理によってクロマチンを剪断します。
- サンプルが超音波破断された後、サンプルの一部を「入力」として取り出します。入力はChIP実験を行うものではなく、サンプルが超音波処理された後に放出されるすべてのDNAおよびタンパク質を含む。
- 超音波処理の後、DNA断片の長さを分析するために1%アガロースゲル電気泳動を実行します。
注:アガロースゲル電気泳動の結果は、DNA断片の長さが200-500 bpであることを示しています(図4)。 - タンパク質の分解を防ぐために、超音波チューブを氷の上に置きます。
- 遠心分離機 10,000 x g および 4 °C で 10 分間
- 遠心分離後、遠心分離された上清を新しい1.5mL遠心管に移し、後で使用するために-80°Cで保管してください。この工程で得られたクロマチン溶液は、後続のIPに使用することができる。
- IP実験を行う前に、1x RIPAバッファでクロマチンサンプルを1:10の比率に希釈します(例えば、10 μLのクロマチンサンプルを1×RIPAバッファの1μLに加えます)。
3. 架橋タンパク質/DNAのIP
- ピペット50 μLの超常磁性タンパク質ビーズを2 mL遠心分離チューブに入る。チューブを磁気スタンドに置きます。磁気ビーズを沈殿させましょう。上清を取り除く。
- 1x RIPAバッファー(氷上で予冷)の1 mLをチューブに加え、超常磁性タンパク質ビーズを洗浄します。洗浄後、チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り除きます。各チューブに1x RIPAバッファ100μLを加えます。
- 300 μLのチョルマチンサンプル(2 x 107 細胞を使用)、100 μLの超常磁性タンパク質ビーズ、4 μLのH3K4me3抗体をチューブに加えます。
- 陰性コントロールとしてマウス IgG を使用したサンプルを使用します。
注:このプロトコルで使用されるマウスIgGは0.01 Mリン酸バッファーと0.15 M NaClを含み、20°C以下の凍結状態を保ちます( 材料表を参照)。 - よく混合した後、回転式シェーカーの上にサンプルを置き、4°C、30 x gで一晩インキュベート。
注:免疫沈降(IP)のインキュベーション時間を短縮することができるかもしれません。インキュベーション時間は異なる因子(例えば、抗体、遺伝子標的、細胞タイプなど)に依存し、経験的に試験する必要があります。
4. IP製品の収集とリンス
- 磁石スタンドに置いて超常磁性タンパク質ビーズをペレットにする。吸引し、上清を捨てる。
- 1x RIPAバッファーの1 mLでビーズを再懸濁して、超常磁性タンパク質ビーズ抗体/クロマチン複合体を洗浄します。
- ロータリーシェーカーでチューブを5分間リンスし、上清を30xgで取り除 きます。
- 低塩免疫複合洗浄バッファー(0.1%SDS、1%トリトンX-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1、および150 mM NaCl)を1 mL添加します。
- ロータリーシェーカーでチューブを5分間すすいで、上清を取り除きます。
- 遠心管に高塩免疫複合洗浄バッファー(0.1%SDS、1%トリトンX-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1、および500 mM NaCl)を1 mL加えます。
- ロータリーシェーカーにチューブを5分間置き、上清を取り除きます。
- 遠心分離管に1 mLのLiCl(0.25 M LiCl、1%NP-40、1%デオキシコール酸、1 mM EDTA、および10 mM Tris-HCl pH 8.1)を用いてリンスします。
- ロータリーシェーカーにチューブを5分間置き、上清を取り除きます。
- 試験管を0.25 M LiCIバッファーの1 mLで再びすすいで、ピペットで上清を取り除き、上清を捨てます。
- TE バッファーを 1 mL 追加します (10 mM トリス-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA)。
- 30 x g で 5 分間回転式シェーカーにチューブを置 きます。
- 1 mL TE バッファーでチューブを再度洗い、ピペットで上清を取り除きます。
- ビーズを収集します。
5. タンパク質/DNA複合体の溶出
- 溶出バッファー(20% SDSの10 μL、1 M NaHCO3の20 μL、滅菌蒸留H2 Oの170 μL)を全てのIPおよび入力チューブに準備します。
- 各遠心チューブに溶出バッファーの100 μLを追加します。
- 65°Cで15分間溶出。
- 10,000 x g および4 °Cで1分間の遠心分離機を、上清を新しい遠心管に集めます。
- ステップ 5.2 ~ 5.4 を繰り返し、溶出を組み合わせます。190 μL の溶出バッファーを入力DNAの 10 μL に加えます。(総体積= 200 μL)。
6. タンパク質/DNA複合体の逆架橋
- 5 M NaClの8 μLを全てのチューブに加え、65°Cで4~5時間または一晩インキュベートしてDNA-タンパク質の架橋を逆にします。
注: このステップの後、サンプルを -20 °C に保存し、必要に応じて次の日にプロトコルを続行します。 - RNase Aを1 μL加え、37°Cで30分間インキュベートします。
- 各チューブに4μLのプロテイナーゼK(H2Oに溶解して20mg/mLで溶解し、-20°Cで保存)を加え、45°Cで1〜2時間インキュベートします。
7. DNAの精製と回収
- 550 μL のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合物(25:24:1の比率)を遠心分離管に加えます。
- 混合物を1分間徹底的に渦液にする。
- 10,000 x g で15分間遠心分離機を使用し、上清を吸引します。
- 抽出した上清を前工程から新しい1.5 mL遠心管に移します。
- 1/10量の3 M酢酸ナトリウム溶液、2.5容量の絶対エタノール、3 μLのグリコーゲン(20 mg/mL)をチューブに加えます。
- サンプルを一晩-20°Cの冷蔵庫に入れて沈殿させます。
- 遠心分離機 15分間、10,000 x g および 4 °C.
- 遠心後に上清を捨てます。ペレットを1mLの75%エタノール(新鮮な調製が必要)で3回10,000xgで洗浄します。
- 洗浄した沈殿物を清潔なベンチに置き、アルコールを乾燥させます。
- 50μLの無菌脱イオン化H2Oを加え、沈殿を十分に溶解する。
- シーケンシングアダプターをDNAフラグメントにリゲートし、ハイスループットシーケンシングプラットフォームを使用してDNAを配列します。
8. DNA修復とソレクサ図書館の建設
- DNAエンドリペアキット(1-34 μL DNA、10倍のエンドリペアバッファーの5 μL、各dNTP2.5 mMの5 μL、10 mM ATPの5 μL、エンドリペア酵素1μL、およびH2Oを使用して、反応体積を49μLに調整する)を使用して、DNA末端を修復して鈍末DNAを生成します。
- PCR精製キットまたはフェノール:クロロホルム抽出を使用してDNAを精製します。1x TE pH 7.4の30 μLでDNAをエルテまたは再中断します。
- 3'末端に「A」を加えます(ステップ2から30μL、H2Oの2μL、10x Taqバッファの5 μL、1 mM dATPの10 μL、および3 μLのTaq DNAポリメラーゼを含む)。0.2 mL PCR遠心分離チューブに試薬を加え、よく混合し、72°CのPCRマシンで10分間反応させます。
- 10 μLのDNA、9.9 μLのH2O、T4 DNAリガーゼバッファーの2.5 μL、アダプタオリゴミックスの0.1 μL、T4 DNAリガーゼの2.5 μLを混合してリンカーライゲーションを行います。0.2 mL PCR遠心チューブに試薬を加え、よく混ぜます。16°Cで4時間インキュベートします。
- メーカーのプロトコルに従って PCR 精製キットを使用して DNA を精製します。溶出バッファーの 20-25 μL とエルルート.
- DNAライブラリーが確立される前に、精製されたDNAの濃度を特定し、その後のシーケンシング実験での使用を確認します。
- 蛍光計を使用してDNA濃度を検出します。氷の上で試料を溶かし、1000 x g と4°Cで30sの遠心分離機を十分に混ぜます。 次に、適切な量のサンプルを取り、波長260nmの蛍光計で測定します。
- シーケンシング用のイルミナシーケンシングプラットフォームに、適格な品質と濃度のDNAサンプルを配置します。
- シーケンシングの前に、PCRプライマー、PE1.0およびPE2.0、および2x高忠実度マスターミックス(DNA 10.5 μL、2倍の高忠実度マスターミックスの12.5 μL、PCRプライマーPE1.0の1 μL、PCRプライマーPE2.0の1 μL)を使用してDNAを増幅します。0.2 mL PCR遠心チューブに試薬を加え、よく混ぜます。
- PCR マシンで PCR 反応を実行します: 95 °C 2 分間の予分化;その後、10 sのための95°C変性の35サイクル、15 sのための60°Cで焼鈍、5 sのための72°Cで延長;72°Cで5分間の最終延長。最後に、4°Cで反応をインキュベートする。
- DNAをクラスター生成に使用し、イルミナヒセク2000でシーケンシングを行います。
注: このプロトコルでは、クラスタ生成にイルミナ フロー セルが使用されていました。合成によるシーケンシングは、メーカーの指示に従ってイルミナゲノムアナライザーで行われました。
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Representative Results
図1に、ChIP-seq メソッドの全体のフローチャートを示します。ChIP-seq実験は、野生型株P131におけるH3K4me3に対する抗体と、m.オリザエにおけるヒストンH3K4me3分布の全ゲノムワイドプロファイルを検証するために、mobre2、mospp1、およびmoswd2遺伝子を欠いていた3つのヌル変異株に対する抗体を用いて行った。野生型株のプロトプラスト、Δモブレ2、Δmospp1、およびΔmoswd2は、25%Wで超音波処理し、出力3s、ストップ5s、4°Cで調製した。 また、クロマチンをH3K4me3抗体及びダイナビーズタンパク質A/Gで免疫精製した。続いて、シーケンシングライブラリを構築するフェノールクロロホルム法を用いてDNA断片を抽出し、ハイスループットシーケンシングプラットフォーム上でシングルエンドで配列決定した。
野生型の代表的な結果は、Δre2、Δmospp1、およびH3K4me3抗体を用いたChIP-seq法によるΔmoswd2株を用いた結果を図2に示す。Δmobre2、Δmospp1、Δmoswd2のH3K4me3信号は、その機能的標的領域で有意に減少した。図2に示すように、選択された標的遺伝子の中には、MGG_14897、MGG_04237、MGG_04236、MGG_04235を含むいくつかの候補遺伝子が、H3K4me3分布に対してマッピングされた。野生型株P131と比較して、Δモブレ2、Δmospp1、およびΔmoswd2欠失変異体における富化H3K4me3-ChIP-seq読み取りの信号は大きく減少した(図2)26。これらの結果は、H3K4me3修飾がM.oryzaeにおける標的遺伝子発現を調節する上で重要な役割を果たしていることを示唆している。
図 1.M オリ ザエ における ChIP-seq 法のフローチャート。(A)M オリ ザエ のゲノムDNAを1%ホルムアルデヒドと架橋した 。 (B) ライセド型爆発菌細胞、壊れたDNA、遊離DNA、ヒストン結合DNAが続いて得られた。 (C) ヒストンに結合したDNA断片を、H3K4me3抗体に特異的結合により抽出した。 (D) 逆架橋を介して、精製されたDNAは、H3K4me3ヒストンによって修飾されたDNA断片を得た。 (E-F) DNA断片を配列決定し、シーケンシング結果を比較し 、M.オリザエ DNA群で配列を同定した。 (G)M オリ ザエ におけるH3K4me3ヒストンの特異的遺伝子および遺伝子座を取り出した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.このモブΔre2、Δmospp1、Δmoswd2欠失変異体は、標的領域におけるH3K4me3プロファイルを有意に減少させた。Δmobre2、Δmospp1、Δmoswd2欠失変異体における重なり合った遺伝子のコード領域の周囲の富化ピークのH3K4me3-ChIP-seq分布は、MGG_14897、MGG_04237、MGG_04236およびMGG_04235遺伝子26における野生型株と比較して減少する。[0-2074]とラベル付けされたWT(入力)の数はゲノムDNAの範囲におけるChIPの結果を意味する[0-2074]。[0-2074]は、0-2074bpの染色体6を指し、この図は、染色体6上のDNA分布のみを表すシーケンシング結果のランダムな選択を示す。完全なシーケンシング結果がGenbankに提出されました。(https//www.ncbi.nlm.nih.gov/バイオプロジェクト/649321加盟)26.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| シリアル番号 | サンプル名 | シリアル番号の例 | チューブの数 | 合計(μg) | フラグメント分布 | データベースの種類 | 備考 | ||||
| 1 | インプット | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | 主なピークは100bp以下ですが、100bp-500bpの間にDNA分布があります | チェップセク | フラグメントが小さすぎます | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | インプット | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | 主なピークは100bp以下ですが、100bp-500bpの間にDNA分布があります | チェップセク | フラグメントが小さすぎます | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | 入力 Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | 主なピークは100bp以下ですが、100bp-500bpの間にDNA分布があります | チェップセク | フラグメントが小さすぎます | ||||
| 4 | 入力 Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | 主なピークは100bp以下ですが、100bp-500bpの間にDNA分布があります | チェップセク | フラグメントが小さすぎます | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | 主なピークは100bp-500bpの間にある | チェップセク | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | 主なピークは100bp-500bpの間にある | チェップセク | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | 主なピークは100bp-500bpの間にある | チェップセク | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | 主なピークは100bp-500bpの間にある | チェップセク | |||||
表 1.この実験におけるDNAの総量.入力P131(2)の総量は2.7948μg、Δモブレ2(3)(入力)の総量は2.4748μg、 Δmospp1(4)(入力)の合計量は3.22μg、Δmoswd2(5)( 入力)の合計量は3.97μg、P131(2)の総量は0.0735μg、Δモブレ2(3)の合計量は0.0491μg、 Δmospp1(4)の合計量は0.0288 μgで、Δmoswd2(5)の合計量は0.0527 μgです。
図 3.超音波後のDNAの電気泳動検出 超音波超音波処理の後、DNAは、DNA断片の長さを分析するために1%アガロースゲル実験を行う。超音波処理されたDNA断片の長さは200〜500bpであり、これらのDNA断片は、ChIP-seqの以下のステップに使用することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.バイオアナライザーの入力およびChIPサンプルのトレース。この図は、各サンプルのフラグメント分布を示しており、ここで、abscissaはフラグメントサイズを表し、縦軸はピークサイズを表しています。バイオアナライザー上で実行されているサンプルは、入力P131(2)、Δモブレ2(3)(入力)、Δmospp1(4)(入力)、Δmoswd2(5)(入力)、P131(2)、Δモブレ2(3)、Δmospp1(4)、Δモスド(5)です。中でも、入力P131(2)、Δmobre2(3)(入力)、Δmospp1(4)(入力)、Δmoswd2(5)(入力)の分布は、主ピークが100bp未満であることを示すが、100〜500bpでのDNA分布がある。P131(2)、Δmobre2(3)、Δmospp1(4)、およびΔmoswd2(5)の真の分布は、メインピーク26として100-500 bpの間である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
近年、ChIP-seqは、特定のヒストンによって改変されたTFまたは濃縮部位の結合部位を決定するためのゲノム解析法として広く用いられている。従来のChIP-seqテクノロジーと比較すると、新しいChIP-seq技術は高感度で柔軟性に優れています。核酸の非特異的なハイブリダイゼーションによって生じるノイズ信号など、負の影響を受けることなく高解像度で得られます。これは一般的な遺伝子発現解析ですが、多くの計算方法が検証されており、ノイズと変動性の観点からChIP-seqデータの複雑さが、この問題を克服することは特に困難です。データ分析の面では、ChIP-seq実験で生成された大量のデータの管理と分析も、まだ十分に対処されていない課題です。
ChIP-seq 実験には、いくつかの重要なステップがあります。まず、プロトプラストの調製は非常に重要です。高品質のプロトプラストを収集できるように、崩壊時間を制御する必要があります。超音波も非常に重要であり、超音波時間が制御されるべきであり、長すぎるか短すぎる動作しません。第二に、添加される抗体の量は、タンパク質に結合するより多くのDNA断片の濃縮を容易にするのに十分であるべきである。ChIP-seq実験で沈殿したDNAの質と量を検証する際に、クビットフルオロメーターを使用した。Agilent 2100は、DNAの質量濃度および断片分布を検出するために使用され、これは、サンプルが後続のライブラリ確立およびシーケンシング実験に使用できるかどうかを示す基礎となる。
全体として、このプロトコルは、病原体感染中の病原性遺伝子を調節するエピジェネティック修飾の全ゲノム全体の分布の理解を高める。この方法は、エピジェネティック修飾の分子機構の同定に寄与し 、M.オリザエ および他の糸状菌における真菌発生および病原体誘導病原体の病原体の新しい標的遺伝子を同定する。
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Disclosures
著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(31871638グラント)、北京農業大学特別科学研究プロジェクト(YQ201603)、北京教育委員会の科学プロジェクト(KM201610020005)、BUA(GJB2021005)の高レベル科学研究育成プロジェクトによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
