Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones
En este artículo
Aviso de erratum
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumen
Resumen
La inmunidad mediada por células T desempeña un papel crucial en las respuestas inmunes contra los tumores, con los linfocitos T citotóxicos (CTL) desempeñando el papel principal en la erradicación de las células cancerosas. Sin embargo, los orígenes y la reposición de las células T CD8+ específicas del antígeno tumoral dentro del microambiente tumoral (TME) permanecen oscuros. Este protocolo emplea la línea celular de melanoma B16F10-OVA, que expresa de manera estable el neoantígeno sustituto, la ovoalbúmina (OVA) y los ratones ot-I transgénicos T Tcr, en los que más del 90% de las células T CD8 + reconocen específicamente el péptido derivado de OVAOVA 257-264 (SIINFEKL) unido a la molécula H2-Kb del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I. Estas características permiten el estudio de las respuestas de las células T específicas del antígeno durante la tumorigénesis.
Combinando este modelo con la cirugía de trasplante tumoral, los tejidos tumorales de los donantes se trasplantaron a ratones receptores singénicos compatibles con tumores para rastrear con precisión la afluencia de células inmunes derivadas del receptor en los tejidos de donantes trasplantados, lo que permitió el análisis de las respuestas inmunes de CD8 + específico del antígeno inherente al tumor y originado en la periferia. Células T. Se encontró que se produjo una transición dinámica entre estas dos poblaciones. En conjunto, este diseño experimental ha proporcionado otro enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunes de las células T CD8 + en TME, lo que arrojará nueva luz sobre la inmunología tumoral.
Introducción
La respuesta inmune mediada por células T CD8 + juega un papel fundamental en el control del crecimiento tumoral. Durante la tumorigénesis, las células T CD8+ naïve se activan tras el reconocimiento de antígenos de una manera restringida a MHC clase I y posteriormente se diferencian en células efectoras y se infiltran en la masa tumoral 1,2. Sin embargo, dentro del microambiente tumoral (EMT), la exposición prolongada al antígeno, así como los factores inmunosupresores, llevan a las células T CD8+ infiltradas específicas del tumor a un estado hiporesponesivo conocido como "agot....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los lineamientos de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Tercera Universidad Médica Militar. Use ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad y ratones transgénicos OT-I ingenuos que pesen 18-22 g. Use tanto hombre como mujer sin aleatorización o "cegamiento".
1. Preparación de medio y reactivos
- Prepare el medio de cultivo celular D10 como se describió anteriormente29 agregando 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina en el medio águila modificada de Dulbe....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El esquema de este protocolo se muestra en la Figura 1. Ocho días después de la inoculación tumoral, se inyectaron células OT-I CD45.1+ y CD45.1+CD45.2+ en ratones C57BL/6 portadores de tumores B16F10-OVA. El tumor se diseccionó quirúrgicamente de ratones implantados con células OT-I CD45.1 + (donante) el día 8 posterior a la transferencia y se trasplantó a ratones implantados con células OT-I CD45.1 + CD45.2 + compatibles con.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La inmunidad mediada por células T juega un papel crucial en las respuestas inmunes contra los tumores, con las CTL desempeñando el papel principal en la erradicación de las células cancerosas. Sin embargo, no se han dilucidado los orígenes de las CTL específicas de antígeno tumoral dentro de laEMT 30. El uso de este protocolo de trasplante tumoral ha proporcionado una pista importante de que las células T CD8 + específicas del antígeno intratumoral pueden no persistir durante mucho tie.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Fondo Nacional de Ciencias Naturales para Jóvenes Académicos Distinguidos (No. 31825011 a LY) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31900643 a QH, No. 31900656 a ZW).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y mu; filtro m | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL jeringa de tuberculina | KDL BB000925 | ||
| tubo de centrífuga de 1,5 mL | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U jeringa de insulina | BD Biosciences | 320310 | |
| tubo cónico de 15 mL | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-metil-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μ m colador de células de nylon | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-ratón CD45.1 | BioLegend | 110714 | clon:A20 |
| B16F10-OVA línea celular | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (albúmina sérica bovina) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Ratón Anti-Ratón CD45.2 | BD Horizon 562895 | clon:104 | |
| placa | de cultivo celularCentrífuga BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| Eppendorf | 5810R-A462/5424R | ||
| ciclofosfamida | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medio | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Ratón CD8+ Kit de aislamiento de células | T Tecnologías de células madre | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| Tubos FACS | BD Falcon | 352052 | |
| suero fetal bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Citómetro de flujo | BD | FACSCanto II | |
| hemocitómetro | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurano | RWD ciencias de la vida | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano reparable, para excitación de 633 o 635 nm | Life Technologies | L10199 | |
| portador de aguja | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehído | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-ratón TCR Vα 2 | clon de BioLegend | 127808 | : B20.1 |
| Pluma Estreptococo glutamina (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-ratón CD8a BioLegend | 100734 | Clon: 53-6.7 | |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| azida de sodio | Sigma | S2002 | |
| pinza quirúrgica | RWD Life Science | F12005-10 | |
| tijera quirúrgica | RWD Life Science | S12003-09 | |
| hilo de sutura | RWD Life Science | F34004-30 | |
| tripsina-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referencias
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
