El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.
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Artículo de método
Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La fagocitosis es un proceso orquestado que implica distintos pasos: reconocimiento, unión e internalización. Los fagocitos profesionales absorben los parásitos Leishmania por fagocitosis, que consiste en reconocer ligandos en las superficies del parásito por múltiples receptores de células huésped. La unión de Leishmania a las membranas de macrófagos ocurre a través del receptor del complemento tipo 1 (CR1) y el receptor del complemento tipo 3 (CR3) y los receptores de reconocimiento de patrones. El lipofosfoglicano (LPG) y la glicoproteína de 63 kDa (gp63) son los principales ligandos implicados en las interacciones macrófago-leishmania . Tras el reconocimiento inicial de los ligandos del parásito por los receptores de la célula huésped, los parásitos se internalizan, sobreviven y se multiplican dentro de las vacuolas parasitóforas. El proceso de maduración de las vacuolas inducidas por Leishmania implica la adquisición de moléculas de vesículas intracelulares, incluidas las proteínas G monoméricas Rab 5 y Rab 7, la proteína de membrana lisosomal asociada 1 (LAMP-1), la proteína de membrana lisosomal asociada 2 (LAMP-2) y la proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3).
Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped utilizando microscopía confocal, incluyendo (i) unión (ii) internalización y (iii) maduración del fagosoma. Al agregar al cuerpo de conocimiento que rodea estos determinantes del resultado de la infección, esperamos mejorar la comprensión de la patogénesis de la infección por Leishmania y apoyar la eventual búsqueda de nuevos objetivos quimioterapéuticos.
Introducción
La leishmaniasis es una enfermedad tropical desatendida causada por parásitos protozoarios del género Leishmania, que da lugar a un amplio espectro de manifestaciones clínicas en el huésped vertebrado, incluyendo leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea y leishmaniasis visceral1. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que más de mil millones de personas están en riesgo, con más de un millón de nuevos casos reportados por año2.
Leishmania spp. son protozoos intracelulares obligados que sobreviven dentro de las células huésped, incluyendo monocitos, macrófagos....
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Protocolo
Las células se obtuvieron de donantes sanos tras la aprobación de los procedimientos por parte de los Comités Nacionales de Ética en Investigación (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultivos celulares
- Macrófagos humanos derivados de monocitos
NOTA: Para obtener macrófagos derivados de monocitos humanos para la diferenciación in vitro en macrófagos, recolectar sangre de donantes sanos y purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como lo describen D. English y B. R. Andersen21.- Después de recolectar sangre periférica (50 ml), viértala en un tubo heparinizado y luego diluya la s....
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Resultados
Este informe tiene como objetivo evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de L. braziliensis aislada de pacientes que presentan L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL forma de CL. Utilizando microscopía confocal, investigamos los principales eventos asociados con la fagocitosis de los parásitos: unión, internalización y maduración del fagosoma. Primero evaluamos la unión a L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL y la fagocitosis por macrófagos humanos deriva.......
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Discusión
La interacción leishmania-macrófagos es un proceso complejo e involucra varios pasos que pueden influir en el desarrollo de la enfermedad5. Para comprender mejor los mecanismos implicados en la interacción de la Leishmania no opsonizada y las células huésped, hemos descrito un protocolo que emplea microscopía de fluorescencia confocal para evaluar la fagocitosis desde las etapas tempranas hasta las últimas de la infección por Leishmania. El uso de técnicas de fluorescenc.......
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Divulgaciones
Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación o el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Instituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahía, Brasil y al departamento de microscopía por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por INOVA-Fiocruz número 79700287000, P.S.T.V. tiene una beca para productividad en investigación del CNPq (305235/2019-2). Los plásmidos fueron amablemente proporcionados por Mauricio Terebiznik, Universidad de Toronto, CA. Los autores desean agradecer a Andris K. Walter por la revisión del idioma inglés y la asistencia en la edición de manuscritos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugado cabra anti-conejo IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 anticuerpo | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Rojo (CMTPX) Tinte | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrí fuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacina | Isofarma | X | |
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Microscopio de fluorescencia (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicina | Gibco | 15750045 | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etano-sulfónico) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Suero normal de cabra | Sigma | NS02L | |
| Dispositivo Nucleofector 2b | Lonza | AAB-1001 | |
| Solución nucleofectora | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehído | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Acetato de miristato de forbol (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Solución tampón de fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Kit antidecoloración | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio | Gibco | 11875-093 | |
| Saponina | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Medio para insectos de Schneider | Sigma | S0146 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S5761 | |
| Piruvato de sodio | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referencias
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
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Reimpresiones y permisos
