Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

Resumen

El método de cultivo de órganos tipo Trowell se ha utilizado para desentrañar redes de señalización complejas que gobiernan el desarrollo de los dientes y, más recientemente, para estudiar la regulación involucrada en las células madre del incisivo de ratón en continuo crecimiento. Los modelos animales de reporteros fluorescentes y los métodos de imágenes en vivo facilitan los análisis en profundidad de las células madre dentales y su microambiente de nicho específico.

Resumen

El desarrollo, la función y la regeneración de órganos dependen de las células madre, que residen dentro de espacios anatómicos discretos llamados nichos de células madre. El incisivo de ratón en continuo crecimiento proporciona un excelente modelo para estudiar células madre específicas de tejido. Las células madre específicas del tejido epitelial del incisivo se encuentran en el extremo proximal del diente en un nicho llamado asa cervical. Proporcionan una afluencia continua de células para contrarrestar la abrasión constante de la punta autoafilada del diente. Aquí se presenta un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo del extremo proximal del incisivo de ratón que alberga células madre y su nicho. Este es un protocolo modificado de cultivo de órganos tipo Trowell que permite el cultivo in vitro de piezas de tejido (explantes), así como los cortes gruesos de tejido en la interfaz líquido / aire en un filtro soportado por una rejilla metálica. El protocolo de cultivo de órganos descrito aquí permite manipulaciones de tejidos no factibles in vivo , y cuando se combina con el uso de un informador fluorescente, proporciona una plataforma para la identificación y el seguimiento de poblaciones de células discretas en tejidos vivos a lo largo del tiempo, incluidas las células madre. Varias moléculas reguladoras y compuestos farmacológicos pueden ser probados en este sistema por su efecto sobre las células madre y sus nichos. En última instancia, esto proporciona una herramienta valiosa para estudiar la regulación y el mantenimiento de las células madre.

Introducción

Los incisivos de ratón crecen continuamente debido a la preservación de por vida de las células madre (SC) que apoyan la producción incesante de componentes dentales. Estos incluyen SC epiteliales, que generan amemeloblastos productores de esmalte, y células madre mesenquimales (MSC), que generan odontoblastos productores de dentina, entre otras células¹. Los SC epiteliales en los incisivos de crecimiento continuo se identificaron inicialmente como células que retienen la etiqueta^2,3 y desde entonces se ha demostrado que expresan una serie de genes de tallo bien conocidos^, incluido Sox2....

Protocolo

Este protocolo implica el uso de animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités de Ética sobre el Uso y Cuidado de Animales y el Animalario de la Universidad de Helsinki.

1. Preparación de la placa de cultivo de órganos

1. Realice todos los procedimientos en una campana de flujo laminar. Limpie las superficies de trabajo con etanol al 70% y utilice instrumentos y soluciones de vidrio esterilizados en autoclave. Esterilice las tijeras y otros equipos metálicos en un esterilizador de cuentas de vidrio.
2. Prepare filtros normalmente almacenados en etanol al 70% lavándolos tres veces en 1x PBS para eliminar ....

Resultados

Los SC epiteliales residen en un nicho llamado asa cervical, que se encuentra en el extremo proximal del incisivo (Figura 3A). Los asas cervicales son estructuras morfológicamente distintas compuestas de epitelio del esmalte interno y externo que encierran el retículo estrellado, un núcleo de células epiteliales poco dispuestas (Figura 3B, C). Hay dos asas cervicales en cada incisivo (Figura 3A), pero solo el asa ce.......

Discusión

El cultivo de órganos in vitro se ha utilizado ampliamente para estudiar el potencial inductivo y las interacciones epitelial-mesenquimales que gobiernan el crecimiento de los órganos y la morfogénesis. El laboratorio de Thesleff ha demostrado cómo adaptar la modificación de Saxén del cultivo de órganos tipo Trowell y utilizarla para estudiar el desarrollo dental¹⁴. Las condiciones reproducibles y los avances en los reporteros fluorescentes han hecho de este un método útil para monitorear.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringas de plástico de 1 ml Agujas
hipodérmicas desechables de calibre 20/26	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Gibco	14287
Tijeras Bonn extrafinas	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS Sudamericano (CE)	LifeTechn.	10270106	divida en alícuotas, almacene a -20 grados; C
Esterilizador de perlas de vidrio, Steri 250 Seconds-Esterilizador	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filtros, 0,1 mmm 25 mm de diámetro	MerckMillipore	VCTP02500	Almacenar en etanol al 70% a temperatura ambiente.
Ácido L-Ascóbico	Sigma	A4544-25g	diluido 100 mg/ml en MilliQ, filtro strerilizado y dividido en 20μ l alícuotas, almacenar en la oscuridad, -20 y grados; C
Agarosa de bajo punto de fusión	TopVision	R0801
Rejillas metálicas			Disponibles comercialmente, o de fabricación propia con malla de acero inoxidable (resistente a la corrosión, tamaño de la malla 0,7 mm). Corte un disco de aproximadamente 30 mm de diámetro y doble los bordes para dar una altura de 3 mm. Usa clavos para hacer agujeros.
Micro pinza	Medicon	07.60.03
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich
Penicilina-Estreptomicina (10.000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Placas de Petri, vidrio de Soda-Cálcica	DWK Life Sciences 9170442
Petridish 35 mm, con respiradero	Duran	237554008
Petridish 90 mm, sin ventilación clásico	Thermo Fisher	101RT/C
Tijeras pequeñas