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Biology

मौखिक गुहा से सिम्बायोटिक सैकरबैक्टीरिया की स्थिर बाइनरी संस्कृतियों की स्थापना

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62484
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1The Forsyth Institute, 2Harvard School of Dental Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम दंत पट्टिका को छानकर और मेजबान बैक्टीरिया के साथ सह-संस्कृति को फ़िल्टर करके उपन्यास बैक्टीरियल फिलम, सैकरिब्टीरिया के कठिन-से-बढ़ने वाले सदस्यों को अलग-थलग करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

कई जीवाणु प्रजातियों मानक तरीकों का उपयोग कर प्रयोगशाला में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, पृथ्वी पर माइक्रोबियल विविधता के बहुमत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा प्रस्तुत । उपन्यास दृष्टिकोण इन असंस्कारी बैक्टीरिया संस्कृति के लिए आवश्यक है ताकि जांचकर्ताओं प्रभावी ढंग से प्रयोगशाला में उपलब्ध शक्तिशाली उपकरणों का उपयोग कर अपने शरीर विज्ञान और जीवन शैली का अध्ययन कर सकते हैं । उम्मीदवार फिला विकिरण (सीपीआर) अकृषित बैक्टीरिया के सबसे बड़े समूहों में से एक है, जिसमें पृथ्वी पर रहने वाली विविधता का ~ 15% शामिल है। इस ग्रुप का पहला आइसोल्यूज सैकरबैक्टीरिया फिलम,नैनोसिनबैक्टर टाइटस स्ट्रेनटीएम7एक्स का सदस्य था। TM7x एक असामान्य रूप से छोटा जीवाणु है जो एक बैक्टीरियल होस्ट, Schaalia odontolytica, तनाव XH001 के सीधे संपर्क में एक सहजीवी के रूप में रहता है। असामान्य रूप से छोटे सेल आकार और एक सहजीवी जीव के रूप में इसकी जीवन शैली का लाभ उठाते हुए, हमने दंत पट्टिका से तेजी से संस्कृति सैकरिबाक्टेरिया के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। यह प्रोटोकॉल दिखाएगा कि 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से दंत पट्टिका के निलंबन को कैसे फ़िल्टर किया जाए, फिर एकत्र सैकरिबाक्टेरिया कोशिकाओं को केंद्रित करें और मेजबान जीवों की संस्कृति को संक्रमित करें। परिणामस्वरूप कूकल्चर को किसी भी सामान्य जीवाणु संस्कृति के रूप में पारित किया जा सकता है और पीसीआर द्वारा संक्रमण की पुष्टि की जाती है। परिणामस्वरूप बाइनरी संस्कृति प्रयोगशाला में बनाए रखा जा सकता है और भविष्य के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया। जबकि संदूषण एक संभावना है, बाइनरी संस्कृति को या तो आगे फ़िल्टर करने और मेजबान के पुनर्निर्ण द्वारा, या संक्रमित उपनिवेशों के लिए बाइनरी संस्कृति और स्क्रीनिंग चढ़ाना द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि इस प्रोटोकॉल को अन्य नमूना प्रकारों और वातावरण में विस्तारित किया जा सकता है, जिससे सीपीआर में कई और प्रजातियों की खेती होती है।

Introduction

बैक्टीरिया की उपन्यास प्रजातियों को तैयार करना और उन्हें प्रयोगशाला में लाना शक्तिशाली प्रयोगों के लिए उनके माइक्रोबियल समुदाय के भीतर उनके शरीर विज्ञान और व्यापक बातचीत को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है। हालांकि इन प्रश्नों (जैसे, "मेटा-ओमिक्स") से पूछताछ करने के संस्कृति-मुक्त तरीके हैं, विविध माइक्रोबियल आबादी की जटिल बातचीत से एकल चर को अलग करना और सार्थक निष्कर्ष तक पहुंचना मुश्किल हो जाता है। जबकि बैक्टीरिया की खेती के कई फायदे हैं, एक जीवाणु को अलग करने और इसे शुद्ध संस्कृति में उगाने के लिए कई संभावित बाधाएं हैं । संभावित विशिष्ट विकास आवश्यकताओं में पीएच, ऑक्सीजन तनाव, विटामिन, विकास कारक, संकेत अणुओं या यहां तक कि प्रत्यक्ष कोशिका संपर्क को विकास1प्रकाश में लाना शामिल है । हालांकि, यह माना जाता है कि विशिष्ट auxotrophies बैक्टीरिया की नई प्रजातियों को बनाने के लिए प्राथमिक निवारक हैं । मानक मीडिया योगों में विशिष्ट विटामिन या कार्बन स्रोतों जैसे अकृषित बैक्टीरिया द्वारा आवश्यक कई पोषक तत्वों की कमी होती है। ये लापता अणु असंस्कारी बैक्टीरिया के शरीर विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं और आमतौर पर माइक्रोबियल समुदाय या मेजबान जीव में किसी अन्य जीव द्वारा प्रदान किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, म्यूसिन जैसे जटिल कार्बोहाइड्रेट पशु मेजबानों द्वारा प्रदान किए जा सकते हैं। इन्हें मीडिया में जोड़ने से जानवरों की हिम्मत से कई बैक्टीरिया की खेती की अनुमति मिली है, जिनमें अक्करमैंसिया म्यूसिनीफिला और मुसिनिवरान्स हिरुडिनिस2,3,4शामिल हैं । कई रोगजनक बैक्टीरिया ने पशु कोशिकाओं में हेमिन से बंधे लोहे का उपयोग करने की क्षमता विकसित की है, जिसमें मौखिक रोगजनक पोर्फाइट्रोमोनास जिंगिवलिस5शामिल हैं। प्रयोगशाला में, पोर्फाइट्रोमोनास और अन्य जीवों के विकास को हेमिन6के अलावा उत्तेजित किया जा सकता है।

हाल ही में, बैक्टीरिया के उपन्यास आइसोलेट को बनाने में कई सफलताएं सह-संस्कृति के माध्यम से आई हैं, जो उनके विकास के लिए आवश्यक असंस्कारी बैक्टीरिया को विशिष्ट कारक प्रदान करने के लिए "फीडर" जीव का उपयोग कर रही हैं। वर्तौकियन और उनके सहयोगियों के एक सुरुचिपूर्ण अध्ययन से पता चला है कि बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित लोहे के बंधन वाले अणुओं ने कई उपन्यास मौखिक आइसोलेशन के विकास को प्रेरित किया। छद्ममोनाडप्रजातियों द्वारा उत्पादित एक प्रकार के साइडरोफोर, पाइवरेडिन्स को एक उपन्यास प्रीवोटेला प्रजाति7के विकास को काफी सुविधाजनक बनाने के लिए दिखाया गया था। इसी अध्ययन में, फिलम क्लोरोफ्लेक्सी के लिए पहली मौखिक आइसोलेट की खेती की गई थी, साथ ही एफ न्यूलेटम का उपयोग एक सहायक के रूप में कुछ अभी तक अज्ञात यौगिक7प्रदान करने के लिए किया गया था। हाल ही में, रुमिनोकोसीसी जीनस से एक जीवाणु को सहायक जीव8के रूप में बैक्टीरियोइड कमजोरता का उपयोग करके अलग किया गया था। बाद में यह दिखाया गया कि प्रयोगशाला मीडिया पर विकास के लिए एक निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमीटर गामा अमीनोबुटिरिक एसिड (गाबा) की आवश्यकता थी। फीडर जीवों का उपयोग करना विशिष्ट माइक्रोएनवायरमेंट्स की नकल करने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति साबित हुआ है जहां असंस्कारी बैक्टीरिया बढ़ते हैं, जो विभिन्न सांद्रता में विभिन्न योजकों के साथ विकास मीडिया को लगातार सुधारने की तुलना में अधिक कुशल हैं।

असंस्कारी बैक्टीरिया के सबसे बड़े समूहों में से एक "उम्मीदवार फायला विकिरण" (सीपीआर) में हैं, जो कई उम्मीदवार बैक्टीरियल फिला9,10का मोनोफिलेटिक समूह है। इस लेखन के रूप में, सीपीआर के भीतर केवल Saccharibacteria phylum के सदस्यों को सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में सुसंस्कृत किया गया है । पहला आइसोलेटेड,'नैनोसिनबैक्टर lyticus' तनाव TM7x, एंटीबायोटिक स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग करके अलग किया गया था, जिसे असंस्कारी TM711, 12के लिए समृद्ध करने की भविष्यवाणी की गई थी। इस काम की एक महत्वपूर्ण खोज यह थी कि नया आइसोले एक बैक्टीरियल होस्ट, स्चालिया ओडोन्टोलिटिकाके साथ सीधे संपर्क में बढ़ते परजीवी के रूप में बढ़ा, और माइक्रोस्कोपी से पता चला कि ये परजीवी अल्ट्रास्मॉल बैक्टीरिया थे।

इन सुरागों का उपयोग करके, हमने 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से दंत पट्टिका और अन्य मौखिक नमूनों को फ़िल्टर करके अपने भागीदारों के साथ सैकरिबेक्टेरिया के बाइनरी कोकल्चर को जल्दी से स्थापित करने के लिए एक विधि तैयार की, अपकेंद्री द्वारा फिलेट में कोशिकाओं को इकट्ठा किया और उम्मीदवार मेजबान बैक्टीरिया की संस्कृतियों को संक्रमित करने के लिए उनका उपयोग किया। इस विधि से संवर्धन संस्कृतियों से बचने का लाभ है, जो तेजी से बढ़ते जीवों से अभिभूत हो सकता है। यह एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग से भी बचता है, जो या तो लक्षित सैकरबैक्टीरिया प्रजातियों या उनके मेजबानों के विकास को रोक सकता है । यहां प्रदर्शित विधि का उपयोग करते हुए, हमने सैकरिबाक्टेरिया फिलम से 32 आइसोलेटेड को सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय आईआरबी की मंजूरी मांगी गई और उसे मंजूरी दी गई (#14-10) और सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई ।

1. तैयारी

  1. मानव विषयों के साथ काम करते समय, आवश्यक आईआरबी अनुमोदन प्राप्त करें और सूचित सहमति प्राप्त करें।
  2. जल्दी स्थिर चरण के लिए विकसित करने के लिए पर्याप्त समय के साथ मेजबान बैक्टीरिया की संस्कृतियों शुरू करते हैं। उदाहरण के लिए, 0.1% खमीर निकालने के साथ ट्राइप्टिक सोया शोरबा के 2-5 मिलीलन आरेक्निया प्रोपियोनिका के साथ जोड़ा गया (TSBY) और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. ट्रैक-नक़्क़ाशीदार 0.2 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के साथ फ़िल्टर धारकों को इकट्ठा करें। विधानसभा को पन्नी में लपेटें और ऑटोक्लेविंग करके निष्फल करें।
  4. अपकेंद्रित्र ट्यूब और कैप असेंबली को स्टरलाइज करें।

2. मौखिक बैक्टीरिया का नमूना प्राप्त करें

नोट: जबकि कई मौखिक नमूनों में सैकरिबाक्टेरिया (उदाहरण के लिए, लार, टॉन्सिल, जीभ स्क्रैपिंग के झाड़ू) दंत पट्टिका नियमित रूप से सबसे सफल होती है।

  1. एक बाँझ कागज बिंदु, ग्रेसी क्यूरेट, या, यदि स्वयं नमूना, एक बाँझ टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग कर एक पट्टिका खुरचन ले लो । एक उपयुक्त बफर में पट्टिका स्थानांतरित करें, जैसे अधिकतम वसूली मंद (एमआरडी, 0.85% एनएसीएल, 0.1% पेप्टोन) या पीबीएस। यदि तुरंत संसाधित नहीं किया जाता है, तो नमूने को आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
  2. एक छोटे से पिपेट टिप के साथ भंवर और पिपटिंग के संयोजन का उपयोग करके एमआरडी बफर में दंत पट्टिका को तेजी से फिर से खर्च करें।
  3. एमआरडी बफर के अतिरिक्त 9 एमएल में पुनर्संरित पट्टिका नमूना जोड़ें।

3. मौखिक नमूने से फिल्ट्रेट तैयार करें

  1. एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करके, एक बाँझ फ़िल्टर असेंबली को खोलें। एक चौथाई मोड़ Untwist और फिल्टर धारक को फिर से तंग करने के लिए सुनिश्चित करें कि धागे ठीक से लगे हुए है और उपकरण ठीक से बंद कर दिया है । एक सिरिंज का उपयोग करके, उपकरण के माध्यम से एमआरडी बफर के 10 एमएल को पारित करके झिल्ली को धोएं। अनुचित विधानसभा फिल्टर धारक से बाहर लीक तरल पदार्थ द्वारा इस कदम पर पता चला है । यदि रिसाव होता है, तो एक और बाँझ फ़िल्टर असेंबली प्राप्त करें और वॉश स्टेप दोहराएं।
  2. धोया फिल्टर करने के लिए नमूना लागू होते हैं। एक सिरिंज से प्लंजर निकालें और इसे फिल्टर उपकरण से संलग्न करें। फैलाया दंत नमूना डालो, अब एमआरडी बफर के 10 एमएल में, एक सिरिंज में और यह फिल्टर पर लोड ।
  3. फिलट्रेट को पकड़ने के लिए फिल्टर उपकरण के नीचे एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें, फिर फिल्टर के माध्यम से नमूना पुश करने के लिए प्लंजर पर हल्का दबाव लागू करें।
  4. झिल्ली को धोने के लिए एमआरडी बफर के एक और 10 एमएल के साथ प्रक्रिया दोहराएं, फ़िल्टर किए गए नमूने के समान ट्यूब में प्रवाह-थ्रिल इकट्ठा करें। ट्यूब को उपयुक्त रूप से कैप करें।

4. अपकेंद्रित्र द्वारा सैकरिबाक्टेरिया कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करें

  1. ट्यूब और कैप पर ओरिएंटेशन मार्क बनाएं और ट्यूब को ऊपरी तरफ के निशान के साथ हाई-स्पीड सेंट्रलाइज में रखें । अपकेंद्रित्र से बनने वाला गोली आमतौर पर अदृश्य होती है। यह अंकन यह निर्धारित करने में मदद करेगा कि सकरीबैक्टीरिया कोशिकाओं की गोली कहां स्थित है जब अपकेंद्रित्र किया जाता है और ट्यूब को अपकेंद्रित्र से हटा दिया जाता है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 60,000 एक्स ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
    नोट: यह बल और समय सभी Saccharibacteria कोशिकाओं को गोली करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, सैकरबैक्टीरिया कोशिकाओं को कम से कम आंशिक रूप से 20,000 x ग्रामपर 20 मिनट के लिए अपकेंद्री द्वारा गोली मार दी जा सकती है।
  3. ध्यान से अपकेंद्रित्र से ट्यूबों को हटा दें। ट्यूब के ऊपरी हिस्से पर गोली रखते हुए, ट्यूब से तरल डालें।
  4. जोरदार भंवर से एमआरडी बफर के 1-2 एमएल में आमतौर पर अदृश्य गोली को फिर से खर्च करें।

5. सैकरबैक्टीरिया-समृद्ध फिल्ट्रेट के साथ मेजबान संस्कृतियों को संक्रमित करें

  1. ट्यूबों में उपयुक्त विकास मीडिया (जैसे, TSBY, BHI, आदि) के 2 मिलीएल को अलीकोट करके संस्कृति ट्यूब तैयार करें।
  2. प्रत्येक ट्यूब में मेजबान जीवों की रातोंरात संस्कृति के 200 μL जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में 100-200 माइक्रोन पुनः निलंबित, फ़िल्टर किए गए नमूने जोड़ें।
  3. मेजबान जीव के लिए उपयुक्त संयुक्त नमूनों को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस, ए प्रोपियोनिकाके लिए एरोबिक वातावरण में)।
  4. एक नई ट्यूब में ताजा विकास माध्यम के 2 एमएल के लिए बाइनरी संस्कृति के 200 μL स्थानांतरित करके हर दो से तीन दिनों में कोशिकाओं को पारित करना। यदि ऐसा लगता है कि पारित संस्कृतियों कोई विकास नहीं दिखा (यानी, संस्कृति की टर्बिडिटी/ऑप्टिकल घनत्व ताजा मीडिया में पारित होने के बाद वृद्धि नहीं करता है) Saccharibacteria भारी हो सकता है या सभी मेजबान जीव की हत्या । इसे हल करने के लिए, कोशिकाओं को पासिंग करते समय असंक्रमित मेजबान संस्कृति के 200 माइक्रोन जोड़ें। कम से कम 5 पैसेज के लिए दोहराएं।

6. पीसीआर द्वारा संक्रमण की पुष्टि करें

  1. 5 पैसेज के बाद पीसीआर से इंफेक्शन की पुष्टि करें। पीसीआर के 25 चक्रों का उपयोग करके पता लगाने की सीमा से अधिक किसी भी गैर-बढ़ती सैकरबैक्टीरिया कोशिकाओं की तुलना में पांच मार्ग सुनिश्चित करेंगे।
  2. पीसीआर मास्टरमिक्स तैयार करें। एक सुझाया नुस्खा का उपयोग करना इस प्रकार है, प्रत्येक ट्यूब के लिए आवश्यक, 12.5 माइक्रोन 2x पीसीआर बफर तैयार करें, 0.75 माइक्रोन 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0.75 माइक्रोन 10 माइक्रोन्फ्रेम रिवर्स प्राइमर (1177R13- जीएसी सीटीजी एसीए टीसीसी सीसीटी सीसीटी सीसीसी), 1 माइक्रोएल 25 एमएम एमजीसीएल2 और 9 माइक्रोन पानी। भंवर से मिलाएं।
  3. अलीकोट 24 माइक्रोन मास्टरमिक्स को 0.2 मिलील पीसीआर ट्यूब में। पीसीआर प्रतिक्रिया में सैकरबैक्टीरिया-संक्रमित संस्कृति का 1 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित प्रोटोकॉल करें: प्रारंभिक डेनैचुरेशन 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार, फिर अंतिम पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. 1% एगर उठे जेल में पीसीआर उत्पादों को लोड करें और चलाएं। ~600 कुर्सियां का एक बैंड सैकरिबाक्टेरिया की उपस्थिति का संकेत देगा।

7. शुद्धता की जांच करें और दूषित जीवों को हटाएं

  1. मेजबान जीव के विकास के लिए पर्याप्त पोषक तत्वों पर सैकरिबाक्टेरिया की सहसंस्कृति चढ़ाना द्वारा सकारात्मक संस्कृतियों की शुद्धता की पुष्टि करें। बाँझ बफर (जैसे, एमआरडी या पीबीएस) में संस्कृति के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें और एक आगर प्लेट पर 100 माइक्रोन फैलाएं। इस तरह से कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें कि आगर प्लेट पर लगभग 20-200 कॉलोनियां बढ़ रही होंगी।
  2. उचित विकास की स्थिति में संस्कृति को इनक्यूबेट करें और जीवों को दूषित करने के लिए निरीक्षण करें।
    नोट: एक्सनिक सैकरबैक्टीरिया उपनिवेशों को कभी नहीं देखा गया है, इसलिए इन प्लेटों पर केवल मेजबान जीव को बढ़ते हुए देखा जाता है। एक से अधिक कॉलोनी प्रकार आमतौर पर संदूषण को इंगित करता है। संदूषण होना चाहिए, संस्कृति को अवांछित संदूषकों को हटाने और ताजा मेजबान पर फिर से टीका लगाने के लिए फिर से फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
  3. कभी-कभी एक डबल संक्रमण होता है, जहां दो सैकरबैक्टीरिया प्रजातियां एक ही मेजबान को संक्रमित करती हैं। सैकरबैक्टीरिया प्रजातियों को अलग करने के लिए, 20 माइक्रोन बाँझ पीबीएस में व्यक्तिगत कॉलोनियों को फिर से ढर्रादार करें और सैकरबैक्टीरिया संक्रमणों वाली उपनिवेशों का पता लगाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया में निलंबन के 1 माइक्रोन का उपयोग करें।
  4. निलंबन है कि विकास के माध्यम के लिए एक सकारात्मक परिणाम दिया एक बाइनरी संस्कृति शुरू करने के लिए स्थानांतरण । सफलता की दर संस्कृति में प्रत्येक सैकरबैक्टीरिया प्रजातियों के टाइटर पर निर्भर करेगी। प्रचार-प्रसार के लिए संक्रमित को खोजने के लिए 50 से अधिक कॉलोनियों को स्क्रीन करना आवश्यक हो सकता है।

8. संस्कृतियों का भंडारण

  1. रातोंरात पर्याप्त मात्रा (10-50 एमएल) की बाइनरी संस्कृति बढ़ाएं।
  2. अपकेंद्रित्र द्वारा पैलेट कोशिकाएं (10 मिनट के लिए 4,000 x ग्राम)।
    नोट: उच्च गति अपकेंद्रित्र यहां आवश्यक नहीं है के रूप में Saccharibacteria कोशिकाओं को मेजबान की बड़ी, भारी कोशिकाओं से जुड़ा होगा और उनके साथ गोली होगा ।
  3. क्रायोप्रोप्रोटेडेंट में कोशिकाओं को फिर से एंस्ड करें। विकास मीडिया या तो 5% DMSO या 20% ग्लाइस्रोल के साथ पूरक आमतौर पर पर्याप्त है । सुनिश्चित करें कि मेजबान जीव क्रायोप्रोटेक्टेंट मीडिया के साथ संगत है (उदाहरण के लिए, ए प्रोपियोनिका का विकास ग्लिसरोल द्वारा बाधित है और जमे हुए स्टॉक पुनर्जीवित नहीं हो सकते हैं)। यह सुनिश्चित करने के लिए क्रायोप्रोप्रोटेक्टेंट के साथ एक असंक्रमित मेजबान संस्कृति की व्यवहार्यता का परीक्षण करें ताकि स्टॉक ठंड से बच सकें।
  4. संस्कृति की एक ही मात्रा (10-50 मिलीएल) में सेल पेलेट को फिर से एंसुस्पेंड करें। एलिकोट 0.5 एमएल लेबल वाले क्रायोविअल्स में। -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृतियों फ्रीज।

Representative Results

सैकरिबाक्टेरिया का पता लगाने के लिए पीसीआर सैकरिबेक्टेरिया सिम्बाइयेट्स की कम संख्या के कारण प्रारंभिक संक्रमण संस्कृतियों में नकारात्मक (यानी, कोई उत्पाद नहीं देखा गया) दिखाई दे सकती है। हालांकि, कुछ मार्गों के बाद एक मजबूत पीसीआर उत्पाद यह दिखाता दिखाई देना चाहिए कि एक स्थिर संक्रमण हुआ है(चित्रा 1 ए)। इसके विपरीत, कुछ संक्रमण शुरू में पीसीआर द्वारा सकारात्मक दिखाई देंगे, लेकिन 1-4 मार्ग (नहीं दिखाए गए) के बाद अज्ञेय तक कम हो जाएंगे। यह इंगित करता है कि प्रारंभिक फिल्ट्रेट में बड़ी मात्रा में सैकरिबाक्टेरिया कोशिकाएं मौजूद थीं लेकिन मार्ग से पतला हो गई थीं और कोई भी मेजबान संस्कृति के साथ एक स्थिर सहजीवन में प्रवेश करने में सक्षम नहीं था। मौखिक गुहा से एक ही सैकरिबाक्टेरिया फिलट्रेट के साथ कई मेजबान प्रजातियों का परीक्षण आमतौर पर कम सफलता दर(चित्रा 1B)होगा क्योंकि सहजीवी-मेजबान बातचीत बहुत विशिष्ट है। एक शोधकर्ता कई अलग-अलग विषयों से फिलट्रेट्स के साथ एक ही मेजबान का परीक्षण भी कर सकता है। यदि एक अच्छे मेजबान जीव (जैसे आरेचनिया प्रोपियोनिका या स्कालिया ओडोन्टोलिटिका)का उपयोग किया जाता है, तो 50% की सफलता दर की उम्मीद की जा सकती है।

पीसीआर द्वारा परीक्षण महत्वपूर्ण है। अनुभवी शोधकर्ताओं ने माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण की पुष्टि करने का प्रयास किया है, केवल झूठी सकारात्मक रिपोर्ट करने के लिए । सैकरबैक्टीरिया कोशिकाएं छोटे और वेसिकल्स या अनियमित सेल लिफाफा उभार के बीच अंतर करना मुश्किल होती हैं। एक पीसीआर संकेत कई मार्ग के माध्यम से स्थिर एक सफल संक्रमण की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

जैसे-जैसे संक्रमित संस्कृतियां बढ़ती हैं, सामान्य टर्बिड विकास दिखाई देना चाहिए। चूंकि सिम्बायोसिस खुद को स्थापित करता है, संक्रमित संस्कृतियां असंक्रमित मेजबान जीवों(चित्रा 2 ए)की संस्कृतियों की तुलना में कम टर्बिड दिखाई देंगी। कुछ मामलों में, संक्रमित संस्कृतियां पूरी तरह से बढ़ने से रोक सकती हैं और टर्बिड नहीं बन सकती हैं। यह एक संक्रमण के कारण हो सकता है जहां सैकरबैक्टीरिया कोशिकाएं मेजबान जीव पर भारी होती हैं। इन संस्कृतियों के लिए "ताजा" (असंक्रमित) मेजबान जोड़ना सैकरिबाक्टेरिया परजीवी के निरंतर विकास का समर्थन करने के लिए मेजबान की पर्याप्त आबादी प्रदान करनी चाहिए।

ओवरग्रोथ, या जरूरत से ज्यादा टर्बिड संस्कृतियों, या तो एक प्रयोगशाला संदूषक या एक और छोटे मौखिक जीवाणु है कि ०.२ माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित करने में सक्षम था द्वारा संदूषण का संकेत हो सकता है । कैम्पिलोबैक्टर और कैप्नोसाइटोफेगा स्पीप। इन प्रयोगों के विशिष्ट मौखिक संदूषक हैं। संस्कृति को चढ़ाना और उन उपनिवेशों की तलाश करके इसकी पुष्टि की जा सकती है जो मेजबान जीव के असामान्य हैं और 16S आरएनए अनुक्रमण के बाद। यदि संदूषण देखा जाता है, तो इन संस्कृतियों को 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करना आमतौर पर संदूषकों को हटाने के लिए पर्याप्त होता है। फिलट्रेट में सैकरिबाक्टेरिया कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र द्वारा केंद्रित किया जा सकता है और एक शुद्ध मेजबान संस्कृति को फिर से संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

एक दूषित संस्कृति को शुद्ध करने का एक और तरीका संक्रमित संस्कृति चढ़ाना से संक्रमित कालोनियों उठा कर रहा है । संक्रमित मेजबानों की उपनिवेशों को कभी-कभी असंक्रमित उपनिवेशों(चित्रा 2बी-डी)की तुलना में अनियमित कॉलोनी आकार द्वारा पहचाना जा सकता है। ये अनियमित उपनिवेश बाइनरी संस्कृति में सैकरबैक्टीरिया के टिटर पर निर्भर हैं और यदि टिटर कम है तो उपनिवेशों का एक छोटा अनुपात अनियमित दिखाई देगा। इससे संक्रमित उपनिवेशों की पहचान करना आसान हो सकता है, जिसे उठाया जा सकता है और शुद्ध बाइनरी संस्कृति शुरू करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यदि कोई अनियमित उपनिवेश एक Saccharibacteria संक्रमित संस्कृति से चढ़ाना पर देखा जाता है, यह संभव है कि सहजीवी कम टिटर पर है या अनियमित आकार का उपनिवेशों का कारण नहीं है । ऐसे मामले में, सामान्य उपस्थिति वाली पीसीआर स्क्रीनिंग कॉलोनियां सैकरबैक्टीरिया द्वारा संक्रमण दिखा सकती हैं, लेकिन कम दर (सभी कॉलोनियों का 2-10%)।

Figure 1
चित्र 1:मेजबान संस्कृतियों के सैकरिबाक्टेरिया संक्रमण के विशिष्ट पीसीआर परिणाम। (ए)सैकरबैक्टीरिया की उपस्थिति का संकेत देने वाला पीसीआर उत्पाद प्रारंभिक संक्रमण के साथ दिखाई नहीं दे सकता है लेकिन बाद के मार्गों में दिखाई दे सकता है और मजबूत हो सकता है क्योंकि सहसंस्कृति स्वयं को स्थापित करती है। (ख)सैकरबैक्टीरिया-समृद्ध फिल्ट्रेट से संक्रमित अधिकांश मेजबान सिम्बायोसिस की विशिष्टता के कारण उनके विकास का समर्थन नहीं करेंगे । इस उदाहरण में, केवल ए प्रोपियोनिका सफलतापूर्वक संक्रमित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:सैकरबैक्टीरिया संक्रमित संस्कृतियों की विकास विशेषताएं। (ए)संक्रमित और असंक्रमित संस्कृतियों के विकास घटता संक्रमित संस्कृति को दिखाने से असंक्रमित नियंत्रण उतना घनत्व नहीं बढ़ेगा और कम टर्बिड दिखाई देगा । (बी-डी) कॉकल्चर की चढ़ाना अनियमित उपनिवेशों का उत्पादन कर सकता है, जो सैकरिबेरिया संक्रमण के कारण होता है। अनियमित कॉलोनियों में कॉकल्चर में सैकरबैक्टीरिया के टाइटर के सापेक्ष अनुपात में कमी आएगी। (ख)साकरिबाक्टेरिया के उच्च स्तर के साथ मेजबान । (ग)10 गुना पतला सैकरबैक्टीरिया(डी)असंक्रमित मेजबान संस्कृति । सफेद तीर अनियमित उपनिवेशों के उदाहरणों को इंगित करते हैं। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

पट्टिका को छानने और मेजबान जीवों की शुद्ध संस्कृतियों पर इसे लागू करने की हमारी विधि काफी हद तक पहले संस्कारी सैकरिबाक्टेरिया,'नैनोसिनबैक्टर लितस' तनाव टीएम 7एक्स11,14,15पर पहले की टिप्पणियों पर आधारित है। छोटे सेल आकार को देखते हुए, हमने यह डगमगाया कि उन्हें फिल्टर का उपयोग करके दंत पट्टिका से अलग किया जा सकता है और अपकेंद्री के साथ केंद्रित किया जा सकता है। दूसरा, चूंकि ये जीव परजीवी के रूप में रहते हैं, इन कोशिकाओं को मेजबानों की शुद्ध संस्कृतियों को प्रदान करने से उन्हें सिम्बायोसिस में प्रवेश करने और बाइनरी संस्कृतियों के रूप में बढ़ने की अनुमति मिलेगी।

इस विधि का एक लाभ यह है कि इसके लिए संवर्धन संस्कृति या चयनात्मक दबाव की आवश्यकता नहीं है। 'नैनोसिनबैक्टर लिटिकस ' तनाव TM7x एक चयनात्मक एजेंट के रूप में स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग कर एक संवर्धन संस्कृति से सुसंस्कृत किया गया था, जो अनुक्रमण का सुझाव दिया था Saccharibacteria के लिए समृद्ध करने में प्रभावी होगा । आकस्मिक रूप से,'नैनोसिनबैक्टर लॉटिकस' स्कालिया ओडोन्टोलिटिकाके लिए मेजबान, स्ट्रेप्टोमाइसिन16के लिए प्रतिरोधी होने के लिए जाना जाता है। एक चयनात्मक एजेंट के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग भी मेजबान जीव को बढ़ने से रोक सकता है, जो बदले में सैकरिबाक्टेरिया के विकास को बाधित करेगा।

संवर्धन संस्कृतियों का उपयोग करने का एक बड़ा मुद्दा यह है कि तेजी से बढ़ते जीव जल्दी से ब्याज के जीवों को विस्थापित कर देंगे । मौखिक गुहा में, उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस प्रजातियां तेजी से बढ़ सकती हैं और, यदि चीनी विकास माध्यम में मौजूद है, तो मध्यम को अम्लीय करने के लिए पर्याप्त एसिड का उत्पादन करें, और ब्याज के जीवों के खिलाफ चयन करें। एक संवर्धन संस्कृति और चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं से बचने के द्वारा, हमारी विधि एक सामान्य दृष्टिकोण प्रदान करती है जिसे इन अन्य तरीकों की जटिलताओं के बिना सैकरिबाक्टेरिया और संभावित मेजबानों की एक व्यापक श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत विधि में कुछ बाधाएं हैं। सबसे पहले, यह विधि मानती है कि सैकरबैक्टीरिया बाइनरी संस्कृति में रहते हैं। हमने उनकी प्रभावशीलता को मापने के लिए ट्रिनारी या टर्नरी संस्कृतियों के संयोजनों का परीक्षण नहीं किया है, लेकिन संभावना है कि विकास कारकों की आवश्यकता होती है कि एक मेजबान जीव आपूर्ति नहीं कर सकता है। मौखिक बैक्टीरिया के विशाल संयोजनों का परीक्षण करना जो सैकरिबाक्टेरिया के विकास का समर्थन कर सकता है, एक चुनौतीपूर्ण काम होगा। दूसरा, विधि मानता है कि सभी सैकरिबाक्टेरिया 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरने के लिए काफी छोटे हैं। यह हो सकता है कि अन्य Saccharibacteria विश्वास से बड़े हैं और फिल्टर इन जीवों के खिलाफ चयन कर रहा है। एक बड़ा ताकना आकार के साथ एक फिल्टर का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह संक्रमित सह संस्कृति में अधिक अवांछित मौखिक बैक्टीरिया की अनुमति का खतरा चलाता है । अंत में, यह बहुत मुश्किल है कि पहले से ही प्रकाशित किया गया है के बाहर मेजबान प्रजातियों को खोजने के लिए । इस प्रकार अब तक, एकमात्र सफल मेजबान जेनेरा ऐक्टिनोमाइस, स्कालिया, अराचनिया और सेल्यूलोसिमिक्रोबियम,फिलम एक्टिनोबैक्टीरिया15, 17,18के सभी सदस्यों की प्रजातियां हैं। हालांकि, ये मेजबान केवल विशिष्ट सैकरबैक्टीरिया के विकास का समर्थन करते हैं। सैकरबैक्टीरिया की अधिक प्रजातियों को संस्कृति देने के लिए, कई और मेजबानों का पता लगाया जाना चाहिए।

हमें उम्मीद है कि यहां प्रस्तुत विधि सैचरिब्टीरिया और अन्य सीपीआर जीवों के भविष्य के अनुसंधान में सहायता करेगी । मेटाजन्नोमिक अनुक्रमण से पता चलता है कि इन जीवों में छोटे जीनोम भी होते हैं और इन जीवों को सहजीवी होने की आशंका होती है या स्थानीय माइक्रोबियल समुदाय पर भरोसा करते हैं ताकि मेटाबोलाइट्स और उनकेअस्तित्वके लिए महत्वपूर्ण अन्य कारकों की आपूर्ति की जा सके । इन जीवों को अलग करने के लिए एक समान फ़िल्टरिंग रणनीति का उपयोग किया जा सकता है, बशर्ते कि वे काफी छोटे हों और उनके मेजबान जीवों (एस) को सुसंस्कृत किया जा सके। यहां वर्णित तरीकों बैक्टीरिया के इस बड़े और विविध समूह के लिए प्रयोगशाला संस्कृति के शक्तिशाली उपकरण लाने के लिए एक पहला कदम हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को सहायक चर्चा के लिए और जीवाणु उपभेदों प्रदान करने के लिए ऐनी टानर, ब्रूस पास्टर, Heike Boisvert, Xuesong वह और Batbileg बोर शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम माइक्रोबियल तकनीकी सहायता के लिए सुसान योस्ट और जेसिका वुड्स को धन्यवाद देते हैं। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च द्वारा पुरस्कार संख्या R37 DE016937 (फेड), R01 DE024468 (FED) और T32 DE007327 (एजेसी) के तहत समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100
Alphaimager Cell Biosciences FluorChem HD2 Or equivalent UV gel imaging system
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-101
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) Becton-Dickinson 211059 Or other growth media suitable for target organisms
Centrifuge Rotor 70-Ti Beckman Coulter 337922
Cryovials Fisher Scientific 12-567-500
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Electrophoresis Power Supply Bio-Rad 1645052
Electrophoresis Rig Bio-Rad 1704467
Filter Forceps Millipore Sigma XX6200006P Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling
Glycerol Fisher Scientific G33-500
GoTaq Green Mastermix Promega M7122
Mastercycler Pro Thermocycler Eppendorf 950040025 Or equivalent thermocycler for PCR
MgCl2 solution 25mM Promega A3513
Molecular Biology grade water Fisher Scientific BP2819100
O2 Control InVitro Glove Box Coy Laoratories 031615 If needed for microaerobic organisms
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge Beckman Coulter 8043-30-1124
P-10 micro pipette Gilson F144802
P-1000 micro pipette Gilson F123601G
P-2 micro pipette Gilson F144801
P-20 micro pipette Gilson F123600
P-200 micro pipette Gilson F123602G
PBS Fisher Scientific BP399500
PCR tubes 0.2 mL Fisher Scientific 14-230-205
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Pipette tips - 10 μL Fisher Scientific 02-717-157
Pipette tips - 1000 μL Fisher Scientific 02-717-166
Pipette tips - 20 μL Fisher Scientific 02-717-161
Pipette tips - 200 μL Fisher Scientific 02-717-165
Polycarbonate filters - 47mm, 0.2 μm pore size Millipore GTTP04700
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL Falcon 352096 Or other tube suitable for bacterial culture
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-1
Swin-Lok Filter  - 47mm Whatman 4200400
SYBR Safe DNA Gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Syringes - 20 mL Fisher Scientific 14-955-460
TAE Buffer (50x) concentrate Fisher Scientific P1332500
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps Beckman Coulter 355618
Tryptic Soy Blood Agar Plates Northeast Laboratory Services P1100 Or other agar plate sufficient for growth of host organisms
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) Becton-Dickinson 211825 Or other growth media suitable for target organisms
Vinyl Anaerobic Chamber Coy Laboratories 032714 If needed for anaerobic organisms
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500

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References

  1. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  2. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), 00012 (2011).
  3. Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, Pt 5 1469-1476 (2004).
  4. Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, Pt 3 990-995 (2015).
  5. Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis. PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).
  6. Martin, B., et al. New growth media for oral bacteria. Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).
  7. Vartoukian, S. R., et al. In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores. Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).
  8. Strandwitz, P., et al. GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota. Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).
  9. Hug, L. A., et al. A new view of the tree of life. Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).
  10. Castelle, C. J., Banfield, J. F. Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life. Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).
  11. He, X., et al. Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).
  12. Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives. Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).
  13. Brinig, M., Lepp, P. Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease. Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).
  14. Bor, B., et al. Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts. Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).
  15. Bor, B., et al. Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces. Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).
  16. Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. Dental plaque development on defined streptococcal surfaces. Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).
  17. Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts. Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).
  18. Cross, K. L., et al. Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).
  19. Kantor, R., et al. Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla. MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).

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मौखिक गुहा से सिम्बायोटिक सैकरबैक्टीरिया की स्थिर बाइनरी संस्कृतियों की स्थापना
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Collins, A. J., Murugkar, P. P., Dewhirst, F. E. Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity. J. Vis. Exp. (170), e62484, doi:10.3791/62484 (2021).

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