Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

Resumen

Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Resumen

La pandemia de COVID-19 ha puesto de relieve la necesidad de métodos rápidos de alto rendimiento para la detección serológica sensible y específica de la infección por nuevos patógenos, como el SARS-CoV-2. Las pruebas serológicas multiplex pueden ser particularmente útiles porque pueden analizar simultáneamente anticuerpos contra múltiples antígenos que optimizan la cobertura de patógenos y controlan la variabilidad en el organismo y la respuesta individual del huésped. Aquí describimos un ensayo basado en microesferas fluorescentes IGG 3-plex del SARS-CoV-2 que puede detectar anticuerpos IgM e IgG contra tres antígenos principales del SARS-CoV-2: la proteína espiga (S), la enzima convertidora de angiotensina espiga-2 (ACE2) dominio de unión al receptor (RBD) y la nucleocápside (Nc). Se demostró que el ensayo tenía un rendimiento comparable a un ensayo de referencia del SARS-CoV-2 para IgG en suero obtenido a los ≥21 días desde el inicio de los síntomas, pero tuvo una mayor sensibilidad con muestras recolectadas a los ≤5 días desde el inicio de los síntomas. Además, utilizando ACE2 soluble en un formato de ensayo de neutralización, se demostró la inhibición de la unión a anticuerpos para S y RBD.

Introducción

La pandemia de COVID-19 ha enfatizado la importancia de poder desarrollar e implementar rápidamente pruebas serológicas rápidas, de alto rendimiento y alto rendimiento que puedan usarse para el diagnóstico y la vigilancia de nuevos patógenos como el SARS-CoV-2. Las pruebas serológicas multiplex pueden ser extremadamente útiles en una pandemia, ya que pueden analizar simultáneamente anticuerpos contra múltiples antígenos, lo que proporciona una amplia cobertura de patógenos y controla la variabilidad en el organismo y la respuesta del huésped a la infección. Recientemente se informó del desarrollo de un ensayo multiplex basado en perlas fluorescentes, el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), que puede detectar anticuerpos contra la proteína espiga (S), el dominio de unión al receptor (RBD) de la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) y la nucleocápside (Nc) del SARS-CoV-2¹. Se demostró que 3Flex tenía un rendimiento comparable al de un ensayo de referencia de SARS-CoV-2 IgG para suero obtenido a los ≥21 días desde el inicio de los síntomas, pero tuvo una mayor sensibilidad con muestras recolectadas a los ≤5 días desde el inicio de los síntomas. Además, se demostró la inhibición de la unión a anticuerpos para los antígenos S y RBD utilizando ACE2 soluble en un formato de ensayo de neutralización. La tecnología basada en cuentas multiplex ha sido ampliamente adoptada como una tecnología probada para las pruebas serológicas multiplex y tiene claras ventajas para la detección a gran escala, incluido el corto tiempo hasta los resultados, los requisitos de muestras pequeñas y la reducción de la mano de obra^2,3,4.

Recientemente, se ha puesto a disposición un nuevo instrumento de análisis de flujo que proporciona la misma capacidad de alto rendimiento y alto rendimiento del sistema demostrado en el trabajo anterior^1,pero con el beneficio adicional de dos canales de reporteros. La capacidad de medir dos señales de reportero fluorescente en una sola reacción permite la evaluación de dos resultados por analito para cada muestra y es ideal para aplicaciones de isotipado, que normalmente deben realizarse en pozos de reacción separados⁵. La capacidad de doble reportero proporciona el doble de datos para cada muestra en la mitad de pozos de reacción con la mitad de los requisitos de volumen de muestra, y por lo tanto tiene una clara ventaja sobre los sistemas de un solo reportero. Este estudio detalla el protocolo estándar de ensayo serológico y describe la adaptación a un ensayo de neutralización. Además, este informe describe la conversión del ensayo de reportero único en un ensayo serológico de reportero dual y, posteriormente, un ensayo de neutralización de reportero dual, para medir simultáneamente anticuerpos neutralizantes de isotipos IgG e IgM contra los antígenos SARS-CoV-2 S, RBD y Nc. En la Figura 1se proporciona una visión general visual del protocolo de ensayo.

Protocolo

En este estudio se utilizaron muestras residuales de suero humano previamente analizadas para los análisis de diagnóstico del SARS-CoV-2, que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Rochester.

1. Reactivos y equipos

1. Obtener antígenos de coronavirus e IgG e IgM humanos de fuentes comerciales.
2. Obtenga conjuntos de cuentas de control de ensayo (CA) (45 y 220) del proveedor del instrumento. El conjunto de perlas de CA 45 monitorea la colección de intensidad de fluorescencia media (IMF) en instrumentos de canal de un solo reportero (RP1). El conjunto de cuentas de CA 220 monitorea la colección de IMF en el segundo canal de reportero (RP2).
3. Obtener anticuerpos de detección y sueros de conejo específicos de antígeno y anticuerpos utilizados para la confirmación de acoplamiento.
4. Realizar la detección con anticuerpos marcadas con biotina con un conjugado de estreptavidina, R-ficoeritrina (SAPE) o un conjugado de estreptavidina del fluoróforo Super Bright 436 (SASB; excitación a 405 nanómetros (nm) y emisión a 436 nm).
5. Obtener la proteína ACE2 humana (es decir, el receptor del SARS). Antes de su uso, rehidrate la proteína ACE2 liofilizada disolviéndola a una concentración de 1 mg/ml en agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC, autoclave y filtrada estéril de 0,2 μm) y almacenar a 4 °C.
6. Realice todas las reacciones en placas de fondo plano negro de superficie no vinculante (NBS) de 96 pozos. Selle las placas con cinta de sellado de aluminio de microplaca de 96 pomos para los pasos de incubación del ensayo. Use un separador de placa magnética para los pasos de lavado del ensayo.

2. Preparación de perlas de control acopladas a antígenos y acopladas a anticuerpos

1. Acopla covalentemente conjuntos de microesferas magnéticas, poliestireno y codificadas por colores (6,5 μm de diámetro) con antígenos S, RBD y Nc como se describe en Cameron et al.¹. Los antígenos del coronavirus se acoplan a 10 pmol/10⁶ perlas (S) y 100 pmol/10⁶ cuentas (RBD y Nc). Las perlas de control junto con IgG o IgM humana se generan como se describió anteriormente¹. IgG e IgM se acoplan a 5 μg/10⁶ perlas.
2. Después del acoplamiento, determinar las concentraciones de perlas y diluir cada stock a 1 x^{10 6} perlas/ml utilizando los procedimientos descritos⁶.
3. Realizar la confirmación del acoplamiento de antígenos con anticuerpos específicos de antígenos de conejo o con sueros humanos positivos como se describe en Cameron et al.¹.
   1. Confirme el acoplamiento de IgG humana con los reactivos de detección de IgG/SAPE antihumanos biotinilados del ensayo, y el acoplamiento de IgM de IgM con una IgM antihumana de cabra marcada con ficoeritrina (PE).
      NOTA: La confirmación del acoplamiento se realiza mediante una titulación de suero o anticuerpo específico de proteína, ya que no se conoce la concentración óptima a utilizar para estos reactivos. Para el suero, se utilizan diluciones de pliegue en serie, mientras que para los anticuerpos suministrados como existencias de mg/ml, se utilizan series de dilución de μg/ml en serie.
4. Perlas de control de ensayo diluido (CA) que monitorean la recolección de IMF en los dos canales reporteros a una concentración de 1 x^{10 6} cuentas / ml antes de usarlas en mezclas de cuentas multiplex.

3. Preparación de la mezcla de cuentas multiplex frescas

1. Prepare mezclas de cuentas multiplex frescas cada día a partir de la cuenta acoplada individual y controle las existencias de cuentas a 1 x^{10 6} cuentas / ml.
   NOTA: Las mezclas de cuentas multiplex están preparadas para entregar 2.500 perlas para cada región de cuentas en un volumen de 50 μL. Los cálculos sobre cómo preparar mezclas de cuentas multiplex para cualquier número de reacciones se describen en el blog publicado por Angeloni (2020)⁶.

4. Dilución de la muestra

1. Prepare una dilución de muestra de suero 1:100 mezclando 10 μL de suero en 990 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0.05% tween 20, 0.02% de azida de sodio y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) (tampón PBS-TBN).
2. Diluya las muestras de nuevo 10 veces añadiendo 20 μL de la dilución 1:100 a 180 μL de PBS-TBN.
   NOTA: Las muestras de suero consisten en sueros negativos, de muestras recolectadas en 2019 antes de la pandemia de COVID-19, y sueros positivos de pacientes con PCR positivo para SARS-CoV-2, que representan títulos de anticuerpos bajos y altos. Se recogieron muestras positivas entre ≈3 y >60 días desde el inicio de los síntomas (DFSO). Todas las muestras de suero y los sueros de control negativos despojados de IgG se diluyen a 1:1000 como se describe a continuación. Para los ensayos de neutralización, los sueros se diluyen 1:500 como se describe en los protocolos de neutralización a continuación (secciones 6 y 8).

5. Protocolo de ensayo serológico de un solo reportero

1. Agregue 50 μL de mezcla de cuentas multiplex a cada pozo asignado de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pozos.
2. Pipetear 50 μL de suero 1:1000 o PBS-TBN en los pozos apropiados; la dilución final del suero en el pozo es de 1:2000.
3. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
4. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
5. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
6. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
7. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (primer lavado de incubación posterior a la muestra).
   1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
   2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
   3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el imán de la placa durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
   4. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
   5. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
8. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (segundo lavado de incubación posterior a la muestra).
   1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
   2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
   3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el imán de la placa durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
   4. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
   5. Retire la placa del imán.
9. Haga una mezcla fresca de biotina-anti-IgG humana con SAPE diluyendo el anticuerpo a 0.62 μg / ml y el SAPE a 1 μg / ml. Añadir 100 μL a cada pozo.
10. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
11. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
12. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
13. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
14. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (primer lavado de incubación de anticuerpos posterior a la detección).
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el imán de la placa durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
15. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (segundo lavado de incubación de anticuerpos posterior a la detección).
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Retire la placa del imán.
16. Agregue 100 μL de PBS-TBN a cada pozo.
17. Cubrir con sello de aluminio y agitar durante 2 min a 37 °C.
18. Retire la placa del agitador de placas. Luego retire el sello de la lámina y lea 50 μL de cada pozo en el analizador de flujo de acuerdo con el Manual del usuario. A continuación se proporciona una breve descripción.
    1. Seleccione el menú desplegable en la esquina superior izquierda de la pantalla y navegue hasta Configuración de placa.
    2. Seleccione Ejecutar placa.
    3. Seleccione el icono Expulsar para expulsar el portador de la placa.
    4. Cargue la placa en el soporte de la placa y seleccione el icono Retract para retraer el soporte de la placa.
    5. Seleccione el icono Ejecutar para ejecutar la placa.

6. Protocolo de ensayo de neutralización de un solo reportero

1. Prepare una mezcla de cuentas multiplex frescas como se describe en la sección 3 anterior.
2. Diluir los sueros del paciente y de control 1:500 de la siguiente manera.
   1. Diluir el suero 1:100 mezclando 10 μL de suero en 990 μL de PBS-TBN.
   2. Diluya el suero otras 5 veces agregando 40 μL de suero 1:100 en 160 μL de PBS-TBN.
3. Agregue 50 μL de mezcla de cuentas multiplex a cada pozo asignado de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pozos.
4. Añadir 25 μL de dilución ace2 de 2 μg/ml a cada pozo.
5. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 2 min con agitación a 600 rpm.
6. Retire la placa del agitador de placas y retire el sello de la lámina.
7. Agregue 25 μL de suero 1:500 o PBS-TBN a los pozos asignados.
8. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
9. Para el resto del procedimiento de ensayo, siga los pasos 5.4 a 5.18.5 como se describió anteriormente.

7. Conversión a un ensayo serológico dual de IgG e IgM

1. Prepare perlas acopladas a antígenos como se describe en la Sección 2 anterior.
   NOTA: Se incluye un conjunto de cuentas adicional, junto con IgM humana, para monitorear la adición de reactivos de detección anti-IgM, así como un conjunto de cuentas de CA adicional (220) para monitorear la recolección de MFI para RP2. Todas las existencias de cuentas están en 1 x 10⁶ cuentas / ml para su inclusión en mezclas de cuentas multiplex como se describe a continuación.
2. Prepare mezclas frescas de cuentas multiplex como se describe en la Sección 3 anterior.
3. Muestras de suero diluido y sueros de control negativos sin IgG 1:1000 como se describe en la sección 4 anterior.
4. Agregue 50 μL de mezcla de cuentas multiplex a cada pozo asignado de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pozos.
5. Pipetear 50 μL de suero 1:1000 o PBS-TBN a los pozos apropiados. La dilución final del suero en el pozo es 1:2000.
6. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
7. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
8. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
9. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
10. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (primer lavado de incubación posterior a la muestra).
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el imán de la placa durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
11. Lave los pomos de reacción nuevamente con PBS-TBN (segundo lavado de incubación posterior a la muestra), exactamente como se describió anteriormente en los pasos 7.10.1-7.10.5.
12. Retire la placa del imán.
13. Haga una nueva mezcla de reactivos de detección con la combinación requerida de reactivos y agregue 50 μL o 100 μL a cada pozo.
    NOTA: Se utilizaron mezclas de reactivos de detección que contenían la IgG antihumana conjugada con el colorante reportero Brilliant Violet 421 (BV; excitación a 405 nm y emisión a 421 nm) a 50 μL/pozo debido a las cantidades limitantes de los reactivos de stock disponibles. Todas las demás mezclas de reactivos de detección se utilizan a 100 μL/pozo.
14. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
15. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
16. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
17. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
18. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación con PBS-TBN (primer lavado después de la incubación de anticuerpos de detección).
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Mientras retiene la placa en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
19. Lave los pomos de reacción nuevamente con PBS-TBN (segundo lavado después de la incubación de anticuerpos de detección), exactamente como se describió anteriormente en los pasos 7.17.1-7.17.5.
20. Retire la placa del imán.
21. Agregue 100 μL de PBS-TBN a cada pozo.
22. Cubrir con sello de aluminio y agitar durante 2 min a 37 °C.
23. Retire la placa del agitador de placas. Luego retire el sello de la lámina y lea 50 μL de cada pozo en el analizador de flujo como se describió anteriormente en los pasos 5.18.1-5.18-5.

8. Conversión a ensayo de neutralización de doble reportero

1. Utilice las perlas acopladas como se describe en el paso 7.1 anterior.
2. Prepare una mezcla de cuentas multiplex fresca como se describe en el paso 7.2.
3. Las muestras de suero y los sueros de control negativos despojados de IgG se diluyen 1:500 de la siguiente manera.
   1. Prepare una dilución 1:100 mezclando 10 μL de suero en 990 μL de PBS-TBN.
   2. Diluya las muestras 1:100 5 veces más agregando 40 μL de las diluciones 1:100 a 160 μL de PBS-TBN.
4. Agregue 50 μL de mezcla de cuentas multiplex a cada pozo asignado de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pozos.
5. Añadir 25 μL de dilución ace2 de 2 μg/ml a cada pozo.
6. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 2 min con agitación a 600 rpm.
7. Retire la placa del agitador de placas y retire el sello de la lámina.
8. Agregue 25 μL de suero 1:500 o PBS-TBN a los pozos asignados.
9. Cubra la placa con un sello de lámina e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
10. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
11. Con la placa retenida en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
12. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
13. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (primer lavado de incubación posterior a la muestra).
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Con la placa retenida en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
14. Lave los pomos de reacción nuevamente con PBS-TBN (segundo lavado de incubación posterior a la muestra), exactamente como se describió anteriormente en los pasos 8.13.1-8.13.5.
15. Retire la placa del imán.
16. Haga una nueva mezcla de reactivos de detección con la combinación requerida de reactivos y agregue 50 μL o 100 μL a cada pozo.
    NOTA: Se utilizaron mezclas de reactivos de detección que contenían la IgG antihumana conjugada con el colorante reportero BV a 50 μL/pozo debido a las cantidades limitantes de los reactivos de stock disponibles (ver Tabla de Materiales). Todas las demás mezclas de reactivos de detección se utilizan a 100 μL/pozo.
17. Cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 °C durante 15 min con agitación a 600 rpm.
18. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
19. Con la placa retenida en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
20. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
21. Lave los pomos de reacción como se describe a continuación (primero fue después de la incubación de anticuerpos de detección).
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Con la placa retenida en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Seque la placa en papel absorbente mientras mantiene la placa en el imán.
22. Lave los pomos de reacción nuevamente con PBS-TBN (segundo lavado después de la incubación de anticuerpos de detección), exactamente como se detalla anteriormente en los pasos 8.21.1-8.21.5.
    1. Retire la placa del imán de la placa y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pozo.
    2. Cubra la placa con un sello de lámina fresca y agite a 37 °C durante 2 min a 600 rpm.
    3. Retire la placa del agitador de placas y colóquela sobre el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para separar las perlas de la mezcla de reacción.
    4. Con la placa retenida en el imán, retire el sello de la lámina, invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos.
    5. Retire la placa del imán.
23. Agregue 100 μL de PBS-TBN a cada pozo.
24. Cubrir con sello de aluminio y agitar durante 2 min a 37 °C.
25. Retire la placa del agitador de placas. Luego retire el sello de la lámina y lea 50 μL de cada pozo en el analizador de flujo como se describió anteriormente en los pasos 5.18.1-5.18-5.

Resultados

Optimización del Ensayo Serológico de Reportero Único.
La estrategia de acoplamiento para todos los antígenos del SARS-CoV-2 se describe en Cameron, et al., 2020¹ y en el paso 2.1 anterior. La estrategia para la confirmación de acoplamiento se describe en el paso 2.3 anterior. Para un acoplamiento eficiente, los valores medios de intensidad de fluorescencia (IMF) deben ser significativamente más altos que las reacciones de control negativas sin suero/sin anticuerpos y deben demostrar una respuesta a la dosis de disminución de la señal de IMF con cantidades decrecientes de reactivo de detección. Las IMF de aproximadamente 1.000 unidades de IMF o más sobre la IMF de fondo generalmente indican un acoplamiento eficiente de proteínas y dependen de la concentración y especificidad del reactivo de detección utilizado. Usando este método, la confirmación del acoplamiento de antígenos S, RBD y Nc se probó para dos lotes de perlas(Figura 2). Las señales de IMF para todos los antígenos fueron significativamente más altas que la IMF de fondo y mostraron una respuesta a la dosis con titulación de los reactivos de detección. Los datos también mostraron una buena reproducibilidad de los niveles de IMF entre los dos lotes diferentes de cuentas acopladas.

La optimización del ensayo de un solo reportero se realizó como se describe en Cameron, et al., 2020¹. Cada antígeno se probó a diferentes concentraciones de acoplamiento con diferentes diluciones de varias muestras de suero que representan muestras altas, medias, bajas y negativas. Además, debido a que el ensayo mide los títulos de IgG, se utilizó un suero despojado de IgG como muestra negativa adicional. Los resultados de una serie de dilución de muestra representativa con diferentes niveles de acoplamiento de antígenos se muestran en la Figura 3. Esta serie de dilución inicial se probó con una concentración fija de reactivos de detección para obtener un rango potencial de niveles representativos de MFI específicos del antígeno y de fondo. A partir de estos datos, se determinaron rangos de dilución de muestras adicionales y niveles de acoplamiento de antígenos y se probaron más a fondo con muestras adicionales (datos no mostrados).

A continuación, se optimizó la concentración del reactivo de detección para su uso con las diferentes diluciones séricas y niveles de acoplamiento de antígenos. Los datos representativos utilizando 6 muestras positivas y 2 negativas se muestran en la Figura 4. Tras realizar pruebas adicionales con varios cientos de muestras de suero pre-COVID-19 negativas, se seleccionaron los niveles óptimos finales de acoplamiento de antígenos y las concentraciones de detección regente para el protocolo de ensayo final, tal como se describe en la sección 5.

Conversión a un único ensayo de neutralización de reportero
La conversión del ensayo serológico de un solo reportero a un ensayo de neutralización se logró agregando un paso de incubación utilizando ACE2 (como reactivo competidor) con las perlas antes de agregar la muestra de suero. Al valorar la cantidad de ACE2 añadida, se observó inhibición de la unión de IgG a los antígenos S y RBD, como se muestra en la Figura 5. Mientras que los 11 sueros de pacientes tenían diferentes títulos de IgG, cada uno mostró una disminución significativa en la señal de IMF con el aumento de la concentración de ACE2. Como era de esperar, ACE2 solo afecta las señales MFI de S y RBD, pero no el antígeno Nc.

El porcentaje de señal MFI residual en relación con 0 μg/mL ACE2 para todas las muestras se muestra en la Figura 6. Para la mayoría de las muestras, se observó una pérdida de señal >30% para S y RBD con aumento de la concentración de ACE2. Como era de esperar, no hubo ningún efecto de ACE2 en la señal Nc.

Conversión a un ensayo serológico dual de IgG e IgM
Para el ensayo de igG e IgM de doble reportero, se utilizaron las condiciones estándar de ensayo de un solo reportero para probar diferentes combinaciones de anticuerpos y reporteros para los dos canales de reporteros. El canal RP1 es similar a los instrumentos de análisis de flujo anteriores con detección de fluorescencia "naranja" para colorantes reporteros como el PE. El segundo canal, RP2, emplea un láser de excitación violeta que se puede utilizar para detectar la fluorescencia "azul" de colorantes excitados a 402 nm con picos de espectros de emisión en el rango de 421-441 nm.

Se probaron varias combinaciones diferentes de anticuerpos igG e IgM antihumanos a varias concentraciones con las condiciones estándar de dilución e incubación de la muestra de 2.000 veces detalladas en la sección 6. Se realizó una prueba inicial de anti-IgM conjugado con el colorante reportero DyLight 405 (DL 405; excitación a 400 nm y emisión a 420 nm) para el canal RP2 utilizando un conjunto de 11 muestras POSITIVAS para PCR con DFSO que oscilaron entre 5 y >60 días, y una muestra de suero sin IgG. Este reactivo de detección no produjo una señal alta en el canal RP2 como se muestra en la Figura 7A,B, C. Para muestras con la alta IgM RP2 MFI, las señales más altas se observaron para RBD y Nc(Figura 7B,C). Si bien los títulos de IgM deben elevarse en este momento en algunas muestras, los niveles observados de IMF no superaron las 140 unidades de IMF con el reactivo de detección de IgM. Además, la cuenta de control para IgM carecía de un rango dinámico significativo para MFI cuando se usaba DL 405 conjugado a anti-IgM en comparación con un reportero anti-IgM RP1 etiquetado con PE utilizado en las mismas concentraciones (Figura 7D).

Debido a que no se disponía de un reactivo de detección adecuado para IgM etiquetado como reportero RP2, se probó el uso de la biotina original anti-IgG con SASB en el canal RP2. La señal para IgG en el canal RP2 con SASB no tenía el mismo rango dinámico que con SAPE, pero aún tenía un rango adecuado para medir títulos de IgG para S, RBD y Nc(Figura 8). Estos datos llevaron a probar diferentes combinaciones de reactivos de detección de IgM RP1 IgM y RP2 IgG, como se describe a continuación.

Conversión a ensayo de neutralización de doble reportero
El ensayo serológico de doble reportero se convirtió en un ensayo de neutralización agregando una etapa de incubación con ACE2 y perlas, antes de agregar la muestra de suero. Se utilizó una serie de dilución de 2 veces de ACE2 a partir de 16 μg / ml, y luego se probó con conjuntos de 11 muestras y sueros despojados como se describió anteriormente. Además, se probaron 3 combinaciones diferentes de mezclas de anticuerpos de detección de IgM RP1 y RP2 IgG en un conjunto de 11 muestras y controles de suero despojados. Las combinaciones finales y las concentraciones de reactivos determinadas como óptimas se detallan en la Tabla 1.

Para la detección de IgG, la biotina anti-humana IgG / SASB utilizada en el ensayo original de un solo reportero se probó junto con otra anti-IgG conjugada con el tinte reportero de BV. Mientras que el conjugado BV tenía altas señales MFI RP2, la intensidad de la señal MFI para el título de IgG varió a través de las valoraciones ACE2(Figura 9A,C, E). La combinación de IgG/SASB antihumana de biotina tuvo una disminución de la señal de IMF más consistente en toda la titulación de ACE2 en comparación con el conjugado de VB, lo que demuestra una respuesta a la dosis, aunque los niveles de IMF fueron más bajos. La fluctuación de la señal por el conjugado BV a través de las concentraciones de ACE2 también interfirió con la determinación del porcentaje de inhibición por ACE2 en todo el rango de títulos de IgG en comparación con la combinación de IgG / SASB antihumana de biotina(Figura 9B,D, F). Las muestras con señales MFI bajas, como la muestra DFSO 3, no tienen títulos lo suficientemente altos como para evaluar el rendimiento de estos reactivos o medir la capacidad de neutralización de IgG.

Para determinar los títulos de IgM en el canal RP1, se comparó un anti-IgM conjugado con PE con un IgM antihumano conjugado con el colorante reportero DyLight 549 (DL 549; excitación a 562 nm y emisión a 576 nm) a las concentraciones enumeradas en la Tabla 1. De estos dos reactivos, el PE anti-IgM mostró IMF más altas que las generadas por DL 549 igM anti-humana para las muestras analizadas (Figura 9A,C, E). La cuenta de control de IgM que mide la adición de estos reactivos tuvo diferentes IMF promedio de ≈17,000 para el PE anti-IgM y 2,723 para el conjugado DL 549. Incluso con estas diferencias, el impacto de las diversas concentraciones de ACE2 en la IMF fue medible con el conjugado DL 549. Para determinar la inhibición del porcentaje ACE2 de la unión a IgM, hubo una diferencia leve pero insignificante entre los dos reactivos de detección de IgM(Figura 9B,D, F).

Combinación	Reportero	Concentración final en pozo (μg/mL)
		RP1	RP2
1	PE anti-IgM	2	-
	Biotina-Ig	-	0.62
	SASB	-	4
2	DyLight 549 IgM antihumano	1	-
	Violeta brillante 421 IgG antihumana	-	1
3	DyLight 549 IgM antihumano	1	-
	Biotina-Ig	-	0.62
	SASB	-	4

Tabla 1: Lista de combinaciones de colorantes reportero RP1 y RP2 probadas. Se evaluaron varios colorantes reporteros RP1 y RP2 diferentes para medir los títulos de IgG e IgM. Las tres combinaciones mostradas anteriormente se probaron en diferentes modos de detección RP1 y para la optimización del ensayo de neutralización. Para las combinaciones de RP2 que utilizan SASB, se muestran las concentraciones para el anticuerpo de detección biotinilado y SASB. *La concentración final representa la concentración final en el pozo de reacción.

Figura 1:Diagrama de flujo que destaca los pasos principales del protocolo de ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Confirmación del acoplamiento de antígenos. Los antígenos se acoplaron a 100, 10 y 1 pmol/10⁶ perlas. Para los antígenos S y RBD, se utilizaron sueros anti-S de conejo y se detectaron con PE anti-conejo IgG. Para Nc, se utilizó un anti-Nc policlogonal de conejo purificado con Proteína G. Se muestran las curvas de valoración para cuentas acopladas con 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) y 100 pmol Nc (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Optimización de la dilución sérica con diferentes niveles de acoplamiento de antígenos. Las muestras de suero que representan muestras altas, medias, bajas y negativas se analizaron con los diferentes acoplamientos de antígeno pmol /^{10 6} perlas. Se probó una titulación sérica de 4 veces con una mezcla multiplex de perlas acopladas a antígenos utilizando el protocolo de ensayo descrito en la sección 5. Se muestran los valores MFI de las curvas de valoración para S (A), RBD (B) y Nc (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Determinación de la dilución sérica óptima y concentración de reactivos de detección. Ocho muestras de suero, incluidos pacientes negativos (2 muestras) y de bajo a alto positivo (6 muestras), se analizaron en diluciones séricas adicionales con tres concentraciones diferentes de reactivos de detección. Los resultados de MFI se muestran para S (A), RBD (B) y Nc (C). Sobre la base de estos y otros datos (no mostrados), se seleccionó una dilución de la muestra de 1:2.000 y una concentración de anticuerpos de detección de biotina de 0,62 μg/ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Optimización del ensayo de neutralización de un solo reportero. La modificación del ensayo serológico de un solo reportero a un ensayo de detección de anticuerpos neutralizantes se realizó agregando una etapa de incubación con ACE2 como competidor, como se describe en la Sección 6. Se analizaron un conjunto de 11 muestras, que van desde sueros de título de bajo a alto positivo, y una muestra de suero rayado con IgG con una serie de dilución doble de ACE2 a partir de 4 μg / ml, utilizando condiciones de ensayo estándar. A través de este rango de concentraciones de ACE2, se puede ver una disminución en MFI con un aumento de ACE2 para S (A) y RBD (B), pero no para Nc (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Porcentaje de inhibición de la señal con ACE2. Se muestra el porcentaje de señales residuales para el conjunto de 11 muestras (de la Figura 4). Para cada muestra, independientemente de su título de IgG, se logró una disminución máxima de la señal MFI del ≥30% para S (A) y RBD (B) a la concentración más alta de ACE2. Para el antígeno Nc(C)no hubo inhibición significativa de la señal con ninguna cantidad de ACE2 probada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Prueba de DyLight 405 anti-IgM como reactivo de detección de IgM RP2. Se utilizó un conjunto de 11 muestras y sueros despojados de IgG para probar DL 405-conjugado anti-IgM como un reactivo de detección RP2. Se muestran las señales RP2 IgM MFI para S (A), RBD (B) y Nc (C). La señal MFI más alta para cualquier antígeno con cualquier muestra fue de aproximadamente 140 unidades MFI para RBD con muestra H (B). Incluso la señal en el conjunto de perlas de control de IgM fue inferior a 1.000 MFI en el canal RP2 en todo el rango de título de anticuerpos y no mostró el aumento del rango dinámico observado con el anticuerpo de detección PE anti-IgM en el canal RP1 (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Optimización de SASB como reportero RP2 con Biotina anti-IgG. Se utilizó un conjunto de 11 muestras y sueros despojados de IgG para probar una serie de dilución de SASB con el anti-IgG de biotina estándar de 0,62 μg/mL. Se muestran las IMF IgG resultantes en el canal RP2 para S (A), RBD (B) y Nc (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Comparación de tres combinaciones diferentes de mezclas de detección de IgM RP1 y RP1 IgG. Se probaron tres mezclas diferentes de anticuerpos de detección en 11 muestras y sueros eliminados de IgG. Las combinaciones y concentraciones finales utilizadas se describen en la Tabla 1. Todas las muestras se analizaron con una dilución ace2 de 2 veces, a partir de 16 μg/ml. Se muestran los datos para muestras en DFSO de 3, 12 y 30 días. Las señales MFI para RP1 IgM (naranja) y RP2 IgG (azul) se muestran en A (DFSO 3), C (DFSO 12) y E (DFSO 30). Las IMF residuales del porcentaje de ACE2 se muestran en B (DFSO 3), D (DFSO 12) y F (DFSO 30). Las señales que representan una disminución del >30% en comparación con los controles No ACE2 se resaltan en verde claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este estudio amplió la funcionalidad de un ensayo de microesfera fluorescente multiplex, 3Flex, que evalúa cualitativamente la respuesta de IgG a la infección por SARS-CoV-2¹. Si bien muchos ensayos serológicos para COVID-19 detectan un solo antígeno, este ensayo evalúa simultáneamente los antígenos S, RBD y Nc, e incluye un control interno del isotipo de^{anticuerpos 7}. Además, ACE2 se utiliza como indicador para detectar títulos de anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2.

Los ensayos de múltiples antígenos pueden ser particularmente útiles en el futuro para discriminar las respuestas inmunes entre personas infectadas y vacunadas. Con el SARS-CoV-2, si solo se evalúan los anticuerpos S y RBD, sería imposible discernir si esto se debió a una infección pasada o a una respuesta de anticuerpos de vacunación. Ninguna de las vacunas que están actualmente en uso se dirige al antígeno Nc, por lo que al evaluar los antígenos S/RBD y Nc, es posible distinguir la infección viral pasada (Nc- y S/RBD-positiva) de una respuesta de vacunación (S/RBD-positiva solamente; Nc-negativo).

En el presente estudio, los ensayos serológicos y de neutralización 3Flex (secciones 5 y 6) se transfirieron a un nuevo instrumento de análisis de flujo de doble reportero (secciones 7 y 8). Los protocolos típicos de inmunoensayo para ensayos multiplex basados en perlas son similares a los protocolos ELISA estándar, siguiendo pasos comparables para la incubación de muestras, la incubación de anticuerpos de detección / reportero y el análisis de los resultados⁸. Estudios previos también han demostrado cómo los ensayos ELISA estándar se pueden transferir a una plataforma de multiplexación basada en cuentas⁹.

Los protocolos de ensayo podrían transferirse sin problemas del instrumento predecesor de un solo reportero al nuevo sistema de doble reportero, como lo demuestran los resultados obtenidos para las muestras de prueba y los controles(Figura 4 y Figura 5). En el ensayo serológico, todas las muestras de suero positivas demostraron una disminución característica de la señal sensible a la dosis correspondiente tanto a una mayor dilución de la muestra como a una menor concentración de anticuerpos de detección, mientras que las señales para las muestras negativas se mantuvieron en niveles de fondo. Del mismo modo, para el ensayo de neutralización, la disminución de las señales para S y RBD, pero no Nc, correspondió al aumento de las concentraciones del competidor ACE2, mientras que el suero eliminado de IgG se vio mucho menos afectado por la adición de ACE2. La preincubación de las perlas con ACE2 durante 2 min antes de la adición de la muestra sérica (como se describe en las secciones 6 y 8), también se comparó con la combinación de las perlas con ACE2 y suero al mismo tiempo y produjo poca diferencia en los resultados (datos no mostrados). Sin embargo, debido a que los resultados obtenidos con las perlas más la etapa de preincubación ACE2 fueron más consistentes, fue el procedimiento final adoptado para el protocolo de ensayo de neutralización (secciones 6 y 8).

Debido a que el sistema de reportero dual incorpora un segundo canal de reportero fluorescente, ambos ensayos se convirtieron en ensayos de isotipado para medir simultáneamente las respuestas IgG e IgM. La funcionalidad de doble reportero del analizador de flujo permite la recolección de señales fluorescentes de dos reactivos de detección de reportero para cada analito en el múltiplex para cada muestra, duplicando efectivamente los datos generados por muestra en un ensayo. Para el desarrollo y la optimización de los protocolos de ensayo de doble reportero, se evaluaron varios colorantes reporteros y anticuerpos de detección disponibles comercialmente para el nuevo canal RP2(Figura 7 y Figura 8)para determinar las mejores opciones disponibles. El anticuerpo anti-IgM conjugado con el colorante reportero DL 405 no tuvo un buen desempeño en el canal RP2 (Figura 7), por lo que la biotina anti-IgG con SASB fue posteriormente evaluada para su detección en el canal RP2 (Figura 8). Se compararon tres combinaciones de reactivos de detección RP1 y RP2 en el ensayo de neutralización de doble reportero(Tabla 1 y Figura 9)para determinar las combinaciones de mejor rendimiento para la detección simultánea de anticuerpos neutralizantes IgG e IgM. Si bien hubo diferencias significativas en la intensidad de la señal entre el canal RP1 usando PE-anti IgM y el canal RP2 usando DL 549 anti-IgM, no hubo diferencias significativas en la medición del porcentaje de inhibición de unión por ACE2.

Se reconocen varias limitaciones al método actual y a este estudio. En primer lugar, las muestras probadas y utilizadas en el desarrollo y optimización del método se limitaron a conjuntos de 8-11 muestras. Se analizarán más muestras en estudios ampliados para verificar que el método esté completamente optimizado. En segundo lugar, se probó un número limitado de fluoróforos reporteros y pares de reporteros. Las pruebas adicionales de todos los reporteros disponibles en todas las combinaciones posibles determinarán qué reactivos se pueden usar con éxito en este método. El anticuerpo anti-IgG conjugado a la biotina fue diferente del anticuerpo anti-IgG conjugado al reportero BV 421. Por lo tanto, aunque existía variabilidad en la intensidad de la señal para el BV 421 anti-IgG, podría deberse a la especificidad del anticuerpo y no estar relacionada con el tinte reportero. La prueba de otros anticuerpos conjugados con BV 421 disponibles puede identificar otro anticuerpo que funcionaría bien en el canal RP2. Los estudios futuros también evaluarán la combinación de PE anti-IgM con BV 421 anti-IgG humana para la detección en RP1 y RP2, respectivamente. Por último, incluso con la capacidad de doble reportero del instrumento, los ensayos se limitan a dos isotipos (dos parámetros) por reacción. Si se van a medir isotipos adicionales o se desea una isotipificación completa, entonces las reacciones adicionales utilizando los mismos dos canales de reportero tendrían que ejecutarse en pozos separados.

La tecnología de multiplexación basada en perlas permite un diseño de ensayo rápido y flexible con una fácil implementación en los flujos de trabajo rutinarios del laboratorio^3,4,10. Este estudio demostró la facilidad de transferir los ensayos serológicos y de neutralización 3Flex descritos anteriormente para el SARS-CoV-2 a un sistema de análisis de flujo para medir IgG con un solo reportero, o con una ligera modificación, midiendo simultáneamente las respuestas igG e IgM utilizando dos reporteros. La opción de doble reportero tiene claras ventajas sobre las plataformas de un solo reportero porque puede proporcionar el doble de datos por muestra, utilizando la mitad del volumen de la muestra y en la mitad el número de pozos de reacción. Con los colorantes reporteros y anticuerpos de detección apropiados, los ensayos de isotipado se pueden desarrollar y realizar fácilmente en el instrumento de análisis de flujo de doble reportero.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ACE2 (humano) (rec.)	AdipoGen Life Sciences	AG-40B-0192-3050
Biotina-SP (espaciador largo) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragmento específico	ImmunoResearch Laboratories	109-065-098
Albúmina sérica bovina	MilliporeSigma	A7888	Sigma-Aldrich
Branson 1800 Limpiador/sonicador de baño de agua	Varios
Violeta brillante 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	709-675-149
Corning 96 pocillos Poliestireno negro de fondo plano Microplaca NBS	Corning	3650
Corning Microplaca de 96 pocillos Cinta de sellado de aluminio, no estéril	Corning	6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ   fragmento específico	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Cabra Anti-Humana IgM Fc5μ específico	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-506-129	Descontinuado pero disponible de múltiples proveedores
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugado	ThermoFisher Scientific	62-4317-82
Agitador de microplacas de incubación	Fisherbrand ThermoFisher Scientific	02-217-757	Fisher Scientific
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) contra cabras	ThermoFisher Scientific	P-2771MP
Separador de placas magnéticas Luminex	Corporation	CN-0269-01
Perlas MagPlex	Luminex Corporation	MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Cabra Anti-Humano IgM Fc5μ	específico Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-116-129
Solución salina tamponada con fosfato	MilliporeSigma	P3813	Sigma-Aldrich
Anticuerpo proteico de nucleocápside del SARS	Novos Biologicals	NB100-56683	Sin conjugar, conejo, policlonal, proteína G Proteína G purificada
Proteína del SARS Nucleocápside Anticuerpo	Novos Biologicals	NB100-56049	Sin conjugar, conejo, policlonal, proteína A purificada
contra la proteína de la espícula del SARS	Novos Biologicals	NB100-56047	Sin conjugar, conejo, policlonal, proteína G purificada
Anticuerpo contra la proteína de la espícula del SARS	Novos Biologicals	NB100-56048	Sin conjugar, conejo, policlonal, purificada con proteína G
Anticuerpo de la espícula S1 del SARS-CoV-2 (2019-nCoV), conejo MAb	SinoBiological	40150-R007
Azida de sodio	MilliporeSigma	S2002	Sigma-Aldrich
Estreptavidina, R-ficoeritrina conjugada (SAPE)	ThermoFisher Scientific	S21388
revólver/rotador de tubo	ThermoFisher Scientific	88881001
TWEEN 20	MilliporeSigma	P9416	Sigma-Aldrich
xMAP Kit	de acoplamiento de anticuerposLuminex Corporation	40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE	Luminex Corporation	INTELLIFLEX-DRSE-RUO