Análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana

Resumen

Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) es una técnica de espectroscopia de fuerza dinámica in situ (DFS). BFP se puede utilizar para medir la constante de resorte de las interacciones moleculares en las células vivas. Este protocolo presenta análisis constantes de resorte para enlaces moleculares detectados por BFP.

Resumen

Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) ha surgido recientemente como una nanoherramienta de espectroscopia de fuerza dinámica (DFS) de superficie celular nativa o in situ que puede medir la cinética de unión molecular única, evaluar las propiedades mecánicas de las interacciones ligando-receptor, visualizar los cambios conformacionales dinámicos de proteínas y dilucidar de manera más emocionante los mecanismos de menosensión celular mediados por el receptor. Más recientemente, BFP se ha utilizado para medir la constante de resorte de los enlaces moleculares. Este protocolo describe el procedimiento paso a paso para realizar el análisis DFS constante de resorte molecular. Específicamente, se discuten dos modos de operación BFP, a saber, los modos Bead-Cell y Bead-Bead. Este protocolo se centra en derivar constantes de resorte del enlace molecular y la célula a partir de datos brutos de DFS.

Introducción

Como una técnica de DFS de células vivas, BFP diseña un glóbulo rojo humano (RBC; Figura 1) en un transductor de fuerza ultrasensible y sintonizable con un rango constante de resorte compatible a 0.1-3 pN/nm^1,2,3. Para sondear la interacción ligando-receptor, BFP permite mediciones de DFS a ~1 pN^{(10 -12} N), ~3 nm^{(10 -9} m) y ~0.5 ms (10^-3 s) en resolución de fuerza, espacial y temporal^4,5. Su configuración experimental consiste en dos micropipetas opuestas, a saber, la sonda y el objetivo. La micropipeta de la sonda aspira un glóbulo rojo y una cuenta se pega en su ápice a través de una interacción biotina-estreptavidina. La cuenta está recubierta con el ligando de interés(Figura 1A). La micropipeta objetivo aspira una célula o una cuenta que lleva el receptor de interés, correspondiente a los modos Bead-Cell (Figura 1B) y Bead-Bead (Figura 1C), respectivamente⁵.

La construcción de BFP, el montaje y los protocolos experimentales DFS se describieron en detalle anteriormente^1,6. Brevemente, un ciclo táctil BFP consta de 5 etapas: Aproximación, Incidente, Contacto, Retracción y Disociación(Figura 1D). La posición horizontal del ápice de RBC se denota como Δx_RBC. Al principio, la deformación de RBC no astresada (fuerza cero) Δx_RBC es 0 (Tabla 1). El objetivo es entonces impulsado por un piezotraduclador para inmisionar y retraerse de la cuenta de sonda (Figura 1D). La sonda RBC es comprimida primero por el Target con deformación negativa de RBC Δx_RBC < 0. En un evento de Bond, la etapa de retracción pasa de una fase compresiva a una fase de tracción con deformación positiva de_RBC ΔxRBC > 0 ( Figura2C y D). De acuerdo con la ley de Hooke, la fuerza de soporte BFP puede medirse como F = k_RBC × Δx_RBC, donde k_RBC (Tabla 1)es la constante de resorte RBC del BFP. Tras la ruptura del enlace y la finalización de un ciclo de toque, la cuenta de sonda vuelve a la posición de fuerza cero con Δx_RBC = 0 (Figura 1D).

Para determinar el k_RBC,medimos y registramos los radios del orificio interno de la micropipeta de la sonda (R_p), el RBC (R₀) y el área de contacto circular (R_c) entre el RBC y la cuenta de la sonda ( Figura1A). Luego se calcula k_RBC de acuerdo con el modelo de Evan (Eq. 1)^7,8 utilizando un programa LabVIEW que actúa como un instrumento virtual (VI) para operar el BFP(Figura S1A)^8,9.

(Eq. 1)

Con un BFP establecido y datos brutos DFS obtenidos, a continuación presentamos cómo analizar la constante de resorte del par ligando-receptor o células. Los datos brutos de DFS sobre la interacción de la proteína glicosilada Thy-1 y la integrina portadora de células K562 α₅β₁ (Thy-1-α₅β₁; Figuras 3A y 3B)¹⁰ y la de la integrina recubierta de fibrinógeno y cuentas α_IIbβ₃ (FGN-α_IIbβ₃; Figura 3C) ^11,12 se han utilizado para demostrar los modos de análisis Bead-Cell y Bead-Bead, respectivamente.

Preparación experimental BFP
Para obtener detalles sobre la preparación experimental y la instrumentación de BFP, consulte los protocolos publicados anteriormente³. En resumen, los glóbulos rojos humanos se han biotinilado utilizando la biotina-PEG3500-NHS en el tampón de carbono / bicarbonato. Las proteínas de interés se han acoplado covalentemente a las perlas de vidrio de borosilicato utilizando MAL-PEG3500-NHS en el tampón de fosfato. Para adherirse al RBC biotinilado, la perla de la sonda también está recubierta con estreptavidina (SA) utilizando el MAL-SA. Consulte la Tabla de materiales y la Tabla 2.

Para ensamblar el BFP(Figura 1, izquierda),se utilizará la tercera micropipeta denominada 'Ayudante' para entregar la cuenta de sonda y pegarla al vértice^1,3del RBC. La interacción covalente entre la cuenta de sonda recubierta de SA y los glóbulos rojos biotinilados es mucho más fuerte que el enlace ligando-receptor de interés. Por lo tanto, la etapa disociada puede interpretarse como la ruptura del enlace ligando-receptor en lugar del desprendimiento de la cuenta de sonda del RBC.

Protocolo

1. Obtener eventos DFS analizables

1. Inicie el experimento en el software (por ejemplo, LabVIEW VI) para el control BFP y la configuración de parámetros(Figura S1A).
2. Observe los toques repetitivos de perlas/celdas de la sonda en el software para BFP Monitor(Figura S1B).
3. Pruebe y logre la frecuencia de adhesión ≤ 20% dentro de los primeros 50 toques ajustando la fuerza de pinzamiento y el tiempo de contacto, por lo que se asegura que ≥ el 89% del evento de adhesión DFS esté mediado por enlaces simples^12,13,14.
   NOTA: Para cada par Bead-Cell/Bead, realizamos 200 ciclos táctiles repetitivos. Para obtener la calidad de los datos publicables, generalmente realizamos n ≥ 3 pares Bead-Bead o Bead-Cell.
   1. Guarde los datos, en forma de Fuerza vs. Tiempo, en la carpeta dirigida por el usuario al final de cada par, según lo solicite el software para el control BFP y la configuración de parámetros.
4. Recopile los datos brutos de Fuerza vs. Tiempo de los eventos de Bond, como se ejemplifica en la Figura 2A,utilizando la plataforma de adquisición BFP(Figura S1C).
   1. Abra el software de análisis de datos BFP. Haga clic en el icono de la carpeta amarilla y seleccione el archivo de datos sin procesar correspondiente haciendo doble clic en ellos.
5. Ejecute el programa y, a continuación, haga clic en el botón arriba y abajo para cambiar entre eventos. Utilice los criterios de exclusión de valores atípicos (Figura S2) para descartar eventos no válidos. Seleccione el tipo de datos de exportación como formato Fuerza vs. Tiempo y haga clic en el botón Exportar datos de gráficos.

2. Convierta la curva fuerza vs. tiempo a la curva Fuerza vs. Desplazamiento

1. Exporte el segmento de datos correspondiente a la etapa de retracción a una hoja de cálculo(Figura 2A, marquesina cuadrada),que es relevante para el análisis de constantes de resorte.
2. Traza la curva de fuerza vs. tiempo usando un software de hoja de cálculo. Para obtener la curva Fuerza vs. Desplazamiento, convierta los valores de tiempo(Figura 2A,eje x)a los valores de desplazamiento total (Δx_tot)multiplicando los valores de tiempo con la velocidad de movimiento piezoeléctrico (es decir, 4.000 nm/s por preset).
3. Cero el primer punto de datos restando el valor de desplazamiento más pequeño de cada valor de desplazamiento adquirido. Esta transformación horizontal no afecta a las pendientes ascendentes de la etapa de retracción ni al cálculo posterior de la constante de resorte.
4. En particular, el BFP se considera como un sistema de resorte en serie en el que Δx_tot (Tabla 1) suman las deformaciones del RBC, Δx_RBC (Tabla 1), el enlace molecular, Δx_mol (Tabla 1), y la célula objetivo, Δx_celda (Tabla 1), como el Eq. 2:
   (Eq. 2)
5. Grafíe la curva Fuerza (F) vs. Desplazamiento (Δx_tot) como se muestra en la Figura 2B.

3. Análisis de Cnstant de resorte del modo de celda de perla

1. En la curva Fuerza vs. Desplazamiento, se pueden identificar dos pendientes distintas, donde cada una puede representar la fase de compresión y la fase de tracción. Ajuste una línea de regresión a cada grupo de datos (Figura 2B), donde la pendiente de ajuste lineal más grande representa la constante total del resorte en fase de compresión (Figura 2B, rojo), denotada como k₁ (Tabla 1); y la pendiente de ajuste lineal más pequeña representa la constante total del resorte en fase tensilla(Figura 2B, azul),denotada como k₂ (Tabla 1).
2. Para los resortes conectados en serie por la descripción del paso 2.2, exprese el recíproco de la constante de resorte total, k_tot (Tabla 1), como la suma de los inversos constantes de resorte de RBC, k_RBC (Tabla 1), el enlace molecular, k_mol (Tabla 1), y la celda objetivo, k_celda (Tabla 1). Durante la fase de compresión del modo Bead-Cell, el enlace molecular no se estira, porlo tanto, k_mol no se tiene en cuenta. El recíproco del k_tot en este escenario (1/k₁) se expresa como
   (Eq. 3).
   En los datos de ejemplo, k_RBC está predeterminado (0,25 pN/nm de forma predeterminada). k_celda se puede derivar de la Eq. 3 con el k₁ adquirido y k_RBC ( Figura3B).
3. Durante la fase de tracción, se forma adhesión entre el par ligando-receptor. Expresar el recíproco del k_tot en este escenario (1/k₂) como
   (Eq. 4)
   donde k₂ (Tabla 1) representa la constante total de resorte durante la fase de tracción.
4. Derive k_mol de restar 1/k₁ de 1/k₂ (compare Eq. 3 vs. Eq. 4).

4. Análisis constante de resorte del modo de cuentas

1. Ajuste una línea de regresión a los datos de la fase de compresión para obtener k₁ (similar a la Figura 2B, rojo). Cabe destacar que, en el modo Perla-Perla, la célula diana es reemplazada por una cuenta de vidrio recubierta con el receptor de interés(Figura 1C). Dado que la deformación de la perla es insignificante, el término_{de celda} 1 /kse puede eliminar de los Eq. 3 y Eq. 4 en consecuencia. El k_tot recíproco de la fase compresiva (1/k₁) puede expresarse como:
   (Eq. 5)
2. Ajuste una línea de regresión a los datos de la fase de tracción para obtener k₂ (similar a la Figura 2B, azul). El k_tot recíproco de la fase de tracción (1/k₂) puede expresarse como:
   (Eq. 6)
3. Derive k_mol de restar 1/k₁ de 1/k₂ (compare Eq. 5 vs. Eq. 6).

Resultados

En este trabajo, hemos demostrado el protocolo del análisis de constantes de resorte BFP. Para el modo de análisis Bead-Cell, se analizó el k_mol del enlace molecular entre la proteína glicosilada Thy-1 recubierta en la cuenta probe y la integrina α₅β₁ expresada en la célula Target K562 (Thy-1-integrina α₅β₁; Figura 3A) ¹⁰. La_celda ktambién se deriva del modo Bead-Cell (K562 Cell;

Discusión

En resumen, hemos proporcionado un protocolo detallado de análisis de datos para preprocesar los datos brutos de DFS y derivar constantes de resorte molecular en los modos de análisis BFP Bead-Bead y Bead-Cell. Se presentan los modelos biomecánicos y las ecuaciones necesarias para determinar las constantes de resorte moleculares y celulares. Aunque se estudian diferentes integrinas, el k_mol medido por el modo Bead-Bead y el modo Bead-Cell posee diferencias de rango significativas(...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS)	Uct, Specialties, llc	4420-74-0	Funcionalización de perlas de vidrio
Anhy. Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparación de tampón de fosfato Adquisición
datos BFP VI	Control LabVIEW		BFP y configuración de parámetros
Análisis de datos BFP VI	datos brutos	LabVIEW
Biotinilación
Perlas de vidrio de borosilicato	Tecnología de partículas Distrilab, Países Bajos	9002	Funcionalización de perlas de vidrio
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A0336	Cámara de funcionalización de ligandos
VI	LabVIEW		BFP Monitorización
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G7021	Tyrode' s preparación de tampón
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' s Preparación de tampón
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funcionalización de perlas
de vidrio Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tyrode' s Preparación tampón
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparación tampón de carbonato/bicarbonato; Tirodo'
Carbonato de sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparación de tampón de carbonato/bicarbonato
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tyrode' s Preparación tampón
Fosfato de Sodio Monobásico Monohidrato (NaH2PO4• H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparación de tampón de fosfato
Estreptavidina-Maleimida	Sigma-Aldrich	S9415	Funcionalización de perlas de vidrio