Este protocolo presenta una comparación entre dos protocolos de inducción diferentes para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) hacia los linajes pancreáticos in vitro:el protocolo integrador y el protocolo no integrativo. El protocolo integrador genera más células productoras de insulina (IMIC).
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Artículo de método
In vitro Inducción de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
A partir de 2000, el éxito del trasplante de islotes pancreáticos utilizando el protocolo de Edmonton para tratar la diabetes mellitus tipo I todavía enfrentaba algunos obstáculos. Estos incluyen el número limitado de donantes de páncreas cadavérico y el uso a largo plazo de inmunosupresores. Las células madre mesenquimales (CME) se han considerado un candidato potencial como una fuente alternativa de generación de células similares a los islotes. Nuestros informes anteriores han ilustrado con éxito el establecimiento de protocolos de inducción para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) a las células productoras de insulina (IMC). Sin embargo, la eficiencia de inducción varió mucho. En este artículo, demostramos la comparación de la eficiencia de inducción pancreática de hDPSC a través de protocolos de inducción integrativos (manipulación microambiental y genética) y no integrativos (manipulación microambiental) para administrar IVC derivados de hDPSC (hDPSC-IVC). Los resultados sugieren una eficiencia de inducción distinta para ambos enfoques de inducción en términos de estructura de colonias en 3 dimensiones, rendimiento, marcadores de ARNm pancreático y propiedad funcional en el desafío de glucosa de dosis múltiples. Estos hallazgos apoyarán el establecimiento futuro de una plataforma de producción de IMIC y linaje pancreático clínicamente aplicable.
Introducción
La diabetes mellitus es una preocupación mundial constante. Un informe de la Federación Internacional de Diabetes (FID) estimó que la prevalencia mundial de la diabetes aumentaría de 151 millones en 2000 a 415 millones en 20151,2. El último estudio basado en la epidemiología ha predicho que la prevalencia mundial estimada de diabetes aumentará de 451 millones en 2017 a 693 millones en 20451. El éxito del trasplante de islotes pancreáticos utilizando el protocolo de Edmonton se demostró por primera vez en el año 2000, cuando se demostró que mantenía la producción endógena de insulina y estabilizaba la condición normoglucémica en pacientes diabéticos tipo I3. Sin embargo, la aplicación del protocolo de Edmonton todavía se enfrenta a un problema de cuello de botella. El número limitado de donantes de páncreas cadavérico es el problema principal, ya que cada paciente con diabetes tipo I requiere al menos 2-4 donantes de islotes. Además, el uso a largo plazo de agentes inmunosupresores puede causar efectos secundarios potencialmente mortales4,5. Para abordar esto, el desarrollo de una terapia potencial para la diabetes en la última década se ha centrado principalmente en la generación de células productoras de insulina (IMC) efectivas a partir de diversas fuentes de células madre6.
Las células madre se convirtieron en un tratamiento alternativo en muchas enfermedades, incluida la diabetes tipo I, que es causada por la pérdida de células beta. El trasplante de IPC es el nuevo método prometedor para controlar la glucosa en sangre en estos pacientes7. En este artículo se presentan dos enfoques para generar ICCI, protocolos de inducción integrativos y no integrativos. El protocolo de inducción imitó el proceso natural de desarrollo pancreático para obtener los IMIC maduros y funcionales8,9.
Para este estudio, las hDPSC se caracterizaron por citometría de flujo para la detección de marcadores de superficie MSC, potencial de diferenciación multilinaje y RT-qPCR para determinar la expresión de la propiedad de tallo y marcadores genéticos proliferativos (datos no mostrados)8,9,10. Las hDPSC fueron inducidas hacia el endodermo definitivo, el endodermo pancreático, el endocrino pancreático y las células beta o ICCI pancreáticas(Figura 1),respectivamente7. Para inducir las células, se utilizó un enfoque de inducción de tres pasos como protocolo de columna vertebral. Este protocolo se desllamó protocolo no integrador. En el caso del protocolo integrativo, el factor de transcripción pancreático esencial, PDX1,se sobreexpresó en hDPSC seguido de la inducción de PDX1 sobreexpresado en hDPSC utilizando un protocolo de diferenciación de tres pasos. La diferencia entre protocolo no integrativo e integrativo es la sobreexpresión de PDX1 en el protocolo integrativo y no en el protocolo no integrativo. La diferenciación pancreática se comparó entre los protocolos integrativos y no integrativos en este estudio.
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Protocolo
Este trabajo se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de investigación humana, Facultad de Odontología, Universidad de Chulalongkorn. Las DPSC humanas (hDPSC) se aislaron de tejidos de pulpa dental humana extraídos de premolares y molares debido a problemas de muelas del juicio. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes bajo un protocolo aprobado (HREC-DCU 2018/054).
1. Protocolo de inducción integrativa
- Preparación del vector lentiviral portador de PDX1
- Utilice células de riñón embrionario humano (HEK) 293FT para el envasado viral. Culta y mantenga estas células en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de antibiótico-antimicótico.
- Generar vectores PDX1-lentivirus mediante coinfección de 10 μg cada uno de los plásmidos de empaquetamiento y envoltura y 20 μg del plásmido gen objetivo en células HEK293FT utilizando el sistema de transfección de fosfato de calcio, por ejemplo, psPAX2, pMD2. G, y pWPT-PDX1humano11. Asegúrese de que las células sean 80% -90% confluentes durante el tiempo de la infección.
- Recoger el medio que contiene partículas lentivirales a las 48 y 72 h después de la transfección.
- Filtrar el medio recogido a través de un filtro de 0,45 μm; concentrar los virus con un filtro centrífugo a un límite de peso molecular nominal de 100 kDa (NMWCO).
- Sobreexpresión de PDX1
- Use pasaje 3-5 hDPSC que sean 70-80% confluentes. Tripsinizar y contar las celdas usando un contador de celdas. Sembrar 1 x 106 hDPSCs en un plato tratado con cultivo de tejidos de 60 mm e incubar durante la noche.
- 24 h más tarde, agregue partículas de virus frescas obtenidas de la etapa 1.1.4 para transducir células pretratadas con polibreno (4 μg/ml de polibreno, 30 min por debajo de 37 °C y 5% de CO2)a la multiplicidad de infección (MOI) deseada. Por ejemplo, en este caso, MOI utilizado es 20. Mantener las células en el incubador de cultivo celular durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2.
- Después del período de infección de 24 h, deseche el medio que contiene partículas virales. Agregue medios de cultivo frescos y continúe cultivando las células durante 48 h. Todos los cultivos se mantienen a 37 °C y 5% de CO2.
- Compruebe la morfología agregada de las células transfectadas antes de proceder a la etapa de inducción. La transducción de PDX1 se confirma mediante análisis de expresión génica (Figura suplementaria 1).
NOTA: Compruebe la morfología celular bajo un microscopio antes de proceder a los siguientes pasos. - Cosechar y proceder a un protocolo de inducción de tres pasos (paso 1.3) como un enfoque de inducción microambiental.
- Protocolo de inducción de tres pasos
NOTA: El protocolo de inducción de tres pasos dio lugar a la serie de diferenciación pancreática de hDPSC a endodermo definitivo, endodermo pancreático/ endocrino y células beta /IMC pancreáticas utilizando medio libre de suero (SFM)-A, SFM-B y SFM-C, respectivamente.- Deseche el medio de cultivo y luego lave las hDPSC transducidas con 1 solución tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir solución de tripsina-EDTA al 0,25% a las células e incubar durante 1 min a 37 °C, 5% CO2.
- Agregue el medio de cultivo para detener la actividad de la tripsina y enjuague suavemente las células para obtener la suspensión de una sola célula. Cuente las células y alícuota 1 x 106 células en cada tubo colecta.
- Centrifugar la suspensión celular a 468 x g (Fuerza Centrífuga Relativa: RCF), 4 °C, durante 5 min. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet celular.
- Resuspend el pellet en 3 ml del primer medio de inducción pancreática, es decir, medio libre de suero (SFM)-A. Sepete las células en una placa de cultivo de baja unión (60 mm). Mantenga las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 3 días.
NOTA: Observe la morfología de las células bajo un microscopio invertido antes de pasar al siguiente paso. - Elimine SFM-A y agregue 3 ml del segundo medio de inducción, es decir, SFM-B. Mantenga las células durante los próximos 2 días a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Observe la morfología de las células bajo un microscopio invertido antes de pasar al siguiente paso. - Elimine SFM-B y agregue 3 ml del tercer medio de inducción, es decir, SFM-C. Mantener las células durante los próximos 5 días en una incubadora de cultivo celular mantenida a 37 °C con 5% de CO2. Cambia el medio cada 48 h. Observa su morfología después de 5 días.
NOTA: Cada medio de inducción se complementa con diferentes reactivos como se describe; SFM-A: 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 4 nM de activina A, 1 nM de butirato de sodio y 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS y 0.3 mM taurina; y SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de péptido similar al glucagón (GLP)-1, 1 mM nicotinamida y 1x aminoácidos no esenciales (NEAA). - Asegúrese de verificar la morfología celular bajo un microscopio invertido después de cada paso. Las células se volverán más agregadas y flotarán como colonias.
- Recolectar colonias celulares para su posterior análisis. Verifique la morfología y el tamaño de la colonia. Realizar análisis de expresión de marcadores genéticos pancreáticos y análisis funcionales (ensayo de secreción de péptido C estimulado por glucosa).
2. Protocolo de inducción no integrador
NOTA: El protocolo no integrador es el protocolo troncal para entregar los IVC con el proceso de inducción de tres pasos como un enfoque de inducción microambiental8,9.
- Utilice pasaje 3-5 hDPSCs con una confluencia del 70%-80%.
- Deseche el medio de cultivo y lave las hDPSC con 1x PBS.
- Añadir una solución de tripsina-EDTA al 0,25% sobre las células e incubar durante 1 min a 37 °C, 5% CO2.
- Agregue el medio de cultivo para detener la actividad de la tripsina y pipetee suavemente las células para obtener la suspensión de una sola célula. Cuente las células y alícuota 1 x 106 células en cada tubo de recolección.
- Centrifugar la suspensión celular a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a colocar el pellet en SFM-A y colópelo en una placa de cultivo de baja fijación (60 mm). Culta las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 3 días. Compruebe la morfología celular bajo un microscopio invertido.
- Retire SFM-A, agregue SFM-B (Día 3) y luego mantenga las células durante los próximos 2 días por debajo de 37 ° C, 5% CO2.
- Retire SFM-B, agregue SFM-C (Día 5) y luego mantenga las células durante los próximos 5 días por debajo de 37 ° C, 5% CO2. SFM-C se cambia cada 48 h.
NOTA: Cada medio de inducción se complementa con diferentes reactivos como se describe; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM de activina A, 1 nM de butirato de sodio y 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS y 0.3 mM taurina; y SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamida y 1x NEAAs. - Asegúrese de verificar la morfología celular bajo el microscopio invertido después de cada paso y en el día 10.
NOTA: Las celdas se volverán más agregadas y flotarán como colonias. - Recolectar colonias celulares para su posterior análisis. Verifique la morfología y el tamaño de la colonia. Realizar análisis de expresión de marcadores genéticos pancreáticos y análisis funcionales (ensayo de secreción de péptido C estimulado por glucosa).
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Resultados
En este artículo, se compararon los resultados de ambos protocolos de inducción. Los diagramas de ambos protocolos de inducción se ilustran en la Figura 2A,C. En ambos protocolos, la evaluación se realizó bajo un microscopio de luz, y las imágenes se analizaron con ImageJ. Las hDPSC fueron capaces de formar estructuras similares a colonias desde el primer día de inducción en ambos protocolos de inducción. La morfología de la colonia era redonda y densa, y todas las colonias ...
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Discusión
Lograr una mayor producción de IMIC a partir de las CSPY juega un papel esencial en la terapia de la diabetes. Los pasos críticos del protocolo integrador se basan en la calidad de las células que se utilizarán para la transducción y la calidad de las células transducidas. Algunos requisitos celulares que deben verificarse para una transducción exitosa son garantizar la salubridad celular, el manejo del banco celular y las células estén en un estado mitóticamente activo. Además, el monitoreo de la viabilidad de las célul...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
SK, WR y QDL fueron apoyados por la Unidad de Investigación de Células Madre Veterinarias y Bioingeniería, Fondo de Dotación Ratchadaphiseksomphot, Universidad de Chulalongkorn. TO y PP fueron apoyados por Chulalongkorn Academic Advancement into Its2nd Century Project. CS fue apoyado por una subvención de apoyo a la investigación de la Facultad de Ciencias Veterinarias, chulalongkorn Academic Advancement into Its2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University y Government Research Fund.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| células fuertes< / fuerte> | |||
| Antibiótico-Antimicótico | Thermo Fisher Scientific Corporation, EE. UU. | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated TC-Culture Dish | Corning® | ||
| Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX&comercio; | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Polvo de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Se utiliza un paquete para preparar 1 litro de solución de PBS con |
| tripsina-EDTA DDI estéril (0,25 %) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector portador de PDX1 Preparación | |||
| Amicon® Filtro centrífugo Ultra-15 Merck | Millipore, EE. UU. | UFC910024 | |
| pWPT-PDX1 plásmido | Addgene | 12256 | Regalo de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: |
| Addgene_12256 unidad de filtro de jeringa Millex-HV, 0,45 y micro; m | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plásmido | Addgene | 12259 | Regalo de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Infección por polibreno / Reactivo de transfección | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plásmido | Addgene | 12260 | Regalo de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: |
| Addgene_12260Protocolo de inducción de tres pasos | |||
| Activina Una proteína humana recombinante | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA, fracción V de Cohn, sin ácidos grasos) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Péptido similar al glucagón (GLP)- | 1 Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Aminoácidos no esenciales (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Placa de cultivo celular no tratada, 60 mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Butirato de sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referencias
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