Artículo de método
Este protocolo describe en detalle todos los pasos implicados en la obtención de progenitores hematopoyéticos CD34+ derivados de leucofiltros y su diferenciación y maduración in vitro en megacariocitos portadores de proplatlet que son capaces de liberar plaquetas en el medio de cultivo. Este procedimiento es útil para el análisis en profundidad de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la megacaripoyesis.
La expansión y diferenciación in vitro de progenitores hematopoyéticos humanos en megacariocitos capaces de alargar proplatelets y liberar plaquetas permite un estudio en profundidad de los mecanismos subyacentes a la biogénesis plaquetaria. Los protocolos de cultivo disponibles se basan principalmente en progenitores hematopoyéticos derivados de la médula ósea o la sangre del cordón umbilical que plantean una serie de preocupaciones éticas, técnicas y económicas. Si ya existen protocolos disponibles para obtener células CD34 de sangre periférica, este manuscrito propone un protocolo sencillo y optimizado para obtener células CD34+ a partir de filtros de leucodepleción fácilmente disponibles en los centros sanguíneos. Estas células se aíslan de los filtros de leucodepleción utilizados en la preparación de productos de transfusión de sangre, correspondientes a ocho donaciones de sangre. Estos filtros están destinados a ser descartados. Se describe un procedimiento detallado para recolectar progenitores hematopoyéticos identificados como células CD34 + de estos filtros. También se detalla el método para obtener megacariocitos maduros que extienden los proplatlets mientras se discute su evolución fenotípica. Finalmente, el protocolo presenta un método de pipeteo calibrado, para liberar eficientemente plaquetas que son morfológica y funcionalmente similares a las nativas. Este protocolo puede servir como base para evaluar compuestos farmacológicos que actúan en varios pasos del proceso para diseccionar los mecanismos subyacentes y abordar los rendimientos plaquetarios in vivo.
Las plaquetas sanguíneas provienen de células poliploides grandes especializadas, los megacariocitos (MK), que se originan en un proceso de producción constante y ajustado conocido como megacaropoyesis (MKP). En el ápice de este proceso se encuentran las células madre hematopoyéticas que, en contacto con el entorno de la médula ósea (citoquinas, factores de transcripción, nicho hematopoyético), serán capaces de proliferar y diferenciarse en progenitores hematopoyéticos (HP) capaces de comprometerse hacia la vía megacariocítica, dando lugar a MKs inmaduros1. Bajo la influencia de varias citoquinas, y en particular la trombopoyetina (TPO), que es....
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Se obtuvieron muestras humanas de control de donantes de sangre voluntarios que dieron su consentimiento informado por escrito reclutados por el centro de transfusión de sangre donde se realizó la investigación (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Todos los procedimientos fueron registrados y aprobados por el Ministerio de Educación Superior e Investigación de Francia y registrados con el número AC_2015_2371.Los donantes dieron su aprobación en el formulario de consentimiento CODHECO número AC- 2008 - 562, para que las muestras se utilicen con fines de investigación. Los estudios en humanos se realizaron de acuerdo con la declaración de Helsinki.
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Extracción y selección de células CD34+ de LRFs
Aquí, el método, derivado de Peytour et al.9,describe la extracción y selección de células CD34+ de LRF descartados disponibles en bancos de sangre después de la eliminación de leucocitos. Después del procedimiento de retrolavado, generalmente se recuperan 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 células/LRF (Media±EM; n = 155) con una viabilidad de 94,88 ± 0,10% (Figura 2A i
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Este protocolo describe un método para producir MK capaz de emitir proplatelets a partir de HP derivados de la sangre y liberar plaquetas del medio de cultivo. Los HP se obtienen de LRF, un subproducto de los bancos de sangre, utilizado para eliminar los leucocitos contaminantes de los productos sanguíneos celulares y evitar reacciones adversas. Aunque este método es relativamente simple, algunos puntos merecen una atención especial.
La deposición de la suspensión celular en el medio de gradie.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo ha sido apoyado por la ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsacia | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubos | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, humano | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrífuga | Heraeus | Megafuge 1.OR | O material equivalente |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | O material equivalente |
| Criotubos | Dutscher | 55002 | O material equivalente |
| Dextrano de leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | O material equivalente |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | o material equivalente |
| Unidad de filtración Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Citómetro de flujo | BD Bioscience | Fortessa | |
| Tecnologías de células madre | LDL humanas | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Insertos de MA038EX | ||
| Fenwal | R4R1401 | O material equivalente | |
| Campana de flujo laminar | Holten | NA | Producto archivado |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pluma Estreptococo Glutamina (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | O material equivalente |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | VSE4001XA | Macopharma | |
| (30µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Tecnologías de células madre# | 72344 | |
| Suplemento de expansión de StemSpan (100x) | Tecnologías de células madre# | 02696 | |
| StemSpan-SFEM | Tecnologías de células madre# | 09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µ m PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Termo científico | SH3007103 | |
| jeringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | O material equivalente |
| Filtros de jeringa Millex 0,22µ M PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Tecnologías de células madre | #02822 | |
| Tubos 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | O material equivalente |
| Tubos 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | O material equivalente |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | O material equivalente |
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