Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Resumen

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Resumen

Proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) metilato arginina residuos en una amplia variedad de proteínas que desempeñan papeles en numerosos procesos celulares. PrmTs puede mono- o dimethylate arginina guanidino grupos simétricamente o asimétricamente. La enzimología de estas proteínas es un área compleja e intensamente investigada que requiere cantidades de miligramos de proteína recombinante de alta calidad. El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) que emplea autographa californica nucleopolyhedrovirus múltiple (AcMNPV) y células de insectos Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) se ha utilizado para la detección de expresión y la producción de muchos PRMTs, incluyendo PRMT 1, 2, y 4 a través de 9. Para detectar simultáneamente la expresión de múltiples construcciones de estas proteínas, incluidos dominios y fragmentos truncados, así como las proteínas de longitud completa, hemos aplicado métodos escalables utilizando pipetas multicanal ajustables y programables, combinadas con placas y bloques de 24 y 96 pozos. En general, estos ajustes del método permitieron una generación a gran escala de ADN bacmid, virus recombinantes y cribado de expresión de proteínas. El uso de recipientes de cultivo con un alto volumen de llenado de suspensión de células Sf9 ayudó a superar las limitaciones de espacio en la tubería de producción para la producción de proteínas a gran escala de un solo lote. Aquí, se describen protocolos detallados para la expresión eficiente y rentable de PRMTs funcionales para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales.

Introducción

Proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) metilato arginina residuos en monometil o dimethyl simétrico / asimétrico. Las secuencias repetitivas RG/RGG/GRG son altamente preferidas por la mayoría de los PRMTs y se encuentran en una amplia variedad de proteínas^1,2. Las proteínas metiladas con arginina como las histonas o los factores de transcripción y los factores de empalme regulan la transcripción, el empalme y la estructura de la cromatina^3,4. El conocimiento cada vez mayor de la regulación diversa de la utilización del substrato y del cofactor, del volumen de ventas, y de la cinética de PRMTs, así como de la generación de inhibidores selectivos, ha vertido la luz mecanicista en estas enzimas y sus complejos^5,6. Sin embargo, no todos los miembros de la familia PRMT son estudiados en la misma medida; por ejemplo, prmt9 fue descubierto recientemente para ser un miembro de la familia PRMT¹. Los estudios de la estructura y de la función enzimática para estas proteínas requieren suficientes, a menudo miligramos, cantidades de proteína recombinante para estar disponibles.

El sistema de expresión procariota de Escherichia coli (E. coli)suele ser la primera opción para el cribado de expresión utilizando múltiples construcciones para una proteína dada^7,8,9. Sin embargo, la expresión basada en E. colino siempre da lugar a cantidades suficientes de proteínas PRMT en sus formas activas, como hemos observado en particular para PRMT5 y PRMT7 (ver más abajo). Así, los PRMTs que no pudieron expresarse en E. coli o que necesitaban ser producidos por la maquinaria de expresión eucariota se subclonaron en vectores apropiados para el cribado de expresión en el sistema alternativo de vectores de expresión de baculovirus (BEVS). Mientras que las muestras expresadas de E. coli de PRMT1, PRMT3 y PRMT8 se han utilizado extensivamente para los análisis y la cristalografía ines vitro, otros PRMTs tales como PRMT5, que requiere el socio obligatorio MEP50 de su dominio dual de la metiltransferasa, y PRMTs tales como PRMT7 y 9, requieren la expresión de la célula del insecto para obtener cantidades suficientes de proteína activa. En general, los ensayos estandarizados de metiltransferasa de rendimiento medio para PRMT4, 5, 6, 7 y 9 han utilizado el BEVS en células de insectos^6. El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma versátil para producir proteínas recombinantes que requieren la maquinaria de expresión eucariota que permite modificaciones postraduccionales esenciales para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales^10,11,12. Varios BEVSs han llegado a estar disponibles comercialmente desde el primer uso reportado de baculovirus en 1983 para la expresión de proteínas¹³. La mayoría de estos protocolos emplean diferentes estrategias para la transferencia del plásmido de expresión a las células de los insectos. Estos incluyen Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Nuestro protocolo se basa en el sistema más comúnmente utilizado en BEVS, el sistema Bac-to-Bac^14,que está diseñado para transferir el gen/ADNc que codifica la proteína de interés (POI, aquí los PRMTs) al genoma del baculovirus mantenido en una cepa especializada de E. coli a través de la transposición site-specific^15.

Brevemente, el vector de transferencia de plásmidos que contiene el gen de interés se transformó en células competentes de DH10Bac E. coli para generar ADN bacmid viral recombinante. Las células adherentes Sf9 entonces fueron transfectadas con la DNA del bacmid. Cuatro a cinco días después de la transfección, los baculoviruses recombinantes iniciales secretados en el medio de cultivo celular fueron recuperados y etiquetados como el virus P1. Las existencias del baculovirus P1 entonces fueron utilizadas para la amplificación del virus (es decir, generación de acciones del baculovirus P2) y la investigación de la expresión de la proteína. De acuerdo con los resultados de la investigación de la expresión, los virus P2 para la mejor construcción de la expresión de la proteína fueron identificados y utilizados para generar culturas de la suspensión de las células baculovirus-infectadas del insecto (SCBIIS) para la producción a gran escala de la proteína. Aquí, describimos nuestros protocolos detallados y describimos el razonamiento detrás de nuestras opciones de reactivos y recipientes de cultivo para apoyar nuestra estrategia de desarrollar una metodología más eficiente en el tiempo, rentable y escalable para obtener cantidades suficientes de proteínas recombinantes deseadas.

Protocolo

Nota : la descripción general de los pasos del protocolo BEVS se describe en la figura 1.

1. Generación de un ADN bacmid recombinante

1. Preparación de placas selectivas de agar LB para la transformación DH10Bac
   1. Prepare placas de agar LB que contengan: 50 μg/mL de kanamicina, 7 μg/mL de gentamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 200 μg/mL de Bluo-gal y 40 μg/mL de IPTG para seleccionar los transformantes DH10Bac.
   2. Pesar 25 g de caldo LB premezclado y 13 g de agar Bacto y poner en matraz de 2 L. Lleve el volumen a 1 L con agua destilada y autoclave durante 15-30 min a 121 °C.
   3. Establezca un baño de agua a 50 °C y enfríe la solución de agar autoclave en el baño de agua durante 40-60 minutos hasta que se enfríe a 50-55 °C.
   4. A la solución enfriada, añadir gentamicina a una concentración final de 7 μg/mL, kanamicina a una concentración final de 50 μg/mL, tetraciclina a una concentración final de 10 μg/mL, Bluo-gal a una concentración final de 200 μg/mL e IPTG a una concentración final de 40 μg/mL.
   5. Mezcle la solución de agar y alícuota 7-10 mL del medio a cada placa de 60 mm utilizando una pipeta de 50 mL. Deje que las placas se sientan a temperatura ambiente (2 h) para endurecerse. Invertir, envolver y almacenar a 4 °C. Las placas que contienen antibióticos son estables hasta por 4 semanas.
2. Transformación del plásmido en células competentes de DH10Bac E. coli
   1. Calcular el volumen requerido de celdas competentes.
   2. Descongele las células competentes en el hielo, gire suavemente hacia abajo y resuspend hacia atrás mediante un suave golpeteo.
   3. Utilice una pipeta de 12 canales para dispensar 4 μL de las células en cada pozo de la placa de PCR de 96 pozos.
   4. Añadir ~ 0.3-0.5 μg de ADN plásmido recombinante a las células competentes y mezclar suavemente tocando. Incubar la mezcla sobre hielo durante 10-15 min.
   5. Choque térmico de la mezcla en una máquina de PCR a 42 °C durante 45 s. Enfríe sobre hielo durante 2 min.
   6. Dispense 0.5 mL de medio SOC a cada pozo de los bloques de 96 pozos (pozo de 96 profundidades 2.4 mL).
   7. Utilice una pipeta de 12 canales para transferir la suspensión bacteriana transformada al pozo correspondiente del bloque y cubrirlo con una lámina de airpore.
   8. Colocar el bloque en una incubadora de agitación a 37 °C con agitación media (205 rpm) durante 4-5 h.
   9. Extienda uniformemente 30-50 μL del cultivo sobre la superficie de la placa de agar LB utilizando perlas de vidrio estériles. Almacene el resto del cultivo a 4 °C.
   10. Incubar las placas a 37 °C hasta que el color de las colonias azul/blancas sea discernible (40-48 h). Deseche el cultivo cuando se obtengan suficientes colonias grandes y blancas en el plato.
   11. Para asegurarse de que las colonias blancas contienen solamente la DNA recombinante del bacmid, re-rayar una colonia blanca aislada sobre las placas frescas del agar de la libra que contienen los antibióticos, el bluo-gal, y iptg para verificar el fenotipo.
   12. Incubar durante 48 h a 37 °C.
   13. Elija una colonia blanca verificada de una placa re-rayada para la extracción de ADN bacmid recombinante.
3. Aislar el ADN bacmid recombinante
   1. Inocular una sola colonia blanca aislada en 3 mL de medio LB suplementado con kanamicina de 50 μg/mL, 7 μg/mL de gentamicina y 10 μg/mL de tetraciclina en bloques de 24 pozos (bloques de 24 pozos de fondo redondo) y cubrir con una lámina de airporo.
   2. Crecer a 37 °C durante la noche con temblores a 250 rpm.
   3. Centrifugar los bloques de 24 pozos a 2.100 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante, invertir el bloque y tocar suavemente un papel de seda absorbente. Añadir 250 μL de solución 1 (solución de resuspensión celular) a cada pozo.
   4. Selle los bloques con almohadillas de cinta o cualquier otra película de sellado y colótelos en una plataforma de agitación a 75 rpm durante 5-10 min. Revise cada pozo para asegurar la lisis celular adecuada, y resuspend si es necesario, utilizando una punta de 1 mL.
   5. Añadir 250 μL de solución 2 (solución de lisis celular) a cada pozo, sellar los bloques y colocarlos en una plataforma de agitación a 75 rpm durante 30 s (para evitar la contaminación cruzada de las muestras, no invertir bloques de 24 pozos) incubando a temperatura ambiente durante 4 min.
   6. Añadir 250 μL de solución 3 (solución de neutralización), sellar los bloques y colocarlos sobre la plataforma de agitación a 75 rpm durante 30 s. Se formará un precipitado blanco espeso de proteína y ADN genómico de E. coli. Coloque la muestra sobre hielo durante 10-15 min.
   7. Centrífuga durante 60 min a 2.100 x g a 4 °C para peletizar firmemente el material de precipitado blanco. Durante la centrifugación, etiquete un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 0,8 mL de isopropanol absoluto.
   8. Transfiera suavemente el sobrenadante al tubo que contiene isopropanol, evitando cualquier material de precipitado blanco. Mezclar invirtiendo suavemente el tubo unas cuantas veces y luego colocar sobre hielo durante 5 a 10 min. En esta etapa, la muestra se puede almacenar a -20 °C durante la noche.
   9. Centrifugar la muestra durante 15 min a 14.000 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 0.5 mL de etanol al 70% a cada tubo. Invierta el tubo varias veces para lavar el pellet. Centrífuga durante 5 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. (Opcional: repetir lavado)
   10. Traiga muestras dentro de la campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad de la preparación del plásmido y elimine la mayor cantidad posible del sobrenadante.
       NOTA: El pellet puede desalojarse de la parte inferior del tubo, así que observe cuidadosamente el pellet al descartar el sobrenadante.
   11. Seque al aire el pellet dentro de la campana de flujo laminar durante 15 - 20 min y disuelva el ADN en 50 μL de tampón de elución filtrada, 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 (asegúrese de que los pellets no estén sobresecados).
   12. Dado que el ADN de bacmid recombinante es mayor de 135 kb de tamaño, para evitar la cizalladura del ADN, disuelva el pellet mediante un suave golpeteo.
   13. Para verificar la presencia del gen de interés en el ADN bacmid, configure la mezcla de reacción de PCR en una placa de PCR de 96 pozos.
   14. Prepare la mezcla de PCR de la siguiente manera: 1 μL de tampón, 0,2 μL (10 mM cada uno) de dNTPs, 0,1 μL de ADN polimerasa Taq, 0,1 μL (25 μM) de cebadores delanteros e inversos (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL de ADN bacmid y 8 μL de agua.
   15. Realizar la amplificación de los genes diana con desnaturalización inicial durante 2 min a 95 °C, seguido de 25 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min/kb.
   16. Terminar la reacción después de una extensión final durante 7 min a 72 °C.
   17. Analizar 10 μL del producto de amplificación en gel de agarosa al 1% (p/v) que contiene solución de tinción de ácido nucleico por electroforesis.
   18. Almacene los DNAs de bacmid verificados a 4 °C.

2. Generación de reservas de baculovirus recombinantes

NOTA: Utilice células Sf9 de crecimiento exponencial con una viabilidad del 95% o mayor para cualquier paso del protocolo de expresión de baculovirus, incluida la transfección celular para la generación de baculovirus, la amplificación del volumen de baculovirus, la detección de expresión de proteínas y la producción de proteínas.

1. Transfección de células Sf9 con ADN Bacmid y reactivos de transfección (T.R.) como JetPrime o X-tremeGENE 9.
   NOTA: La tinción de Trypan Blue y un hemocitómetro se pueden utilizar para determinar recuentos celulares viables y % de viabilidad celular. Las células no viables toman la mancha y aparecen azules bajo el microscopio, mientras que las células viables permanecen sin manchar. Para calcular el % de viabilidad celular, se obtiene un recuento total de células (no manchado y teñido) y el recuento de células viable se divide por el recuento total de células y se multiplica por 100.
   1. Diluya las células Sf9 de crecimiento exponencial a una densidad celular final de 4 x 10⁵ células/mL en medios de insectos sin suero y vierta en el reservorio de reactivos estériles.
   2. Utilice una pipeta multicanal programable para sembrar 0,5 mL de las células Sf9 diluidas en cada pozo de una placa de 24 pozos.
   3. Etiquete un pozo de la placa como un control (no transfectado) y utilícelo como control para comparar las células transfectadas y no transfectadas para evaluar posibles signos de infecciones.
   4. Después de sembrar las células en las placas, mezcle suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurar una monocapa uniforme de células. No gire las placas porque las células se agruparán en el centro del pozo.
   5. Incubar las placas a 27 °C durante al menos 1 h para permitir la fijación celular a las placas de cultivo.
   6. Mezcle bien el vial del reactivo de transfección. Para cada transfección, añadir 2 μL del reactivo de transfección a 100 μL del tampón de transfección. También se puede utilizar cualquier otro medio de insectos no suplementado. Deposite el reactivo de transfección diluido en un depósito de reactivo estéril y mezcle suavemente durante 10 s.
   7. Usando una pipeta de 12 canales, transfiera 102 μL del reactivo de transfección diluido a una placa estéril de 96 micropcillos.
   8. Transfiera 10 μL de una solución de 0,2 μg/μL de ADN de bacmid recombinante en el pozo correspondiente de una placa de micropcillos de 96 pozos y mezcle agitando suavemente (tocando) la placa desde los lados.
   9. Incubar la mezcla de transfección durante 15-20 min para permitir la formación compleja.
   10. Utilizando una pipeta ajustable de 6 canales diseñada para la transferencia entre placas de 96 y 24 pozos, agregue la mezcla de transfección a las células gota a gota en los pozos correspondientes de las placas de transfección e incube durante 4-5 h a 27 °C.
   11. Mezcle suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces durante el tiempo de incubación para asegurar la distribución uniforme de la mezcla de transfección sobre la monocapa celular.
   12. 4-5 h después de la transfección, añadir 1,5 mL de medio libre de suero de insectos suplementado con un 10% (v/v) final de suero bovino fetal inactivado por calor y antibiótico-antimicótico al 1% (v/v) de volumen final (100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 0,25 μg/mL de anfotericina B).
   13. Incubar las células en una incubadora de 27 °C durante 72-96 h. Mezcle suavemente las placas de transfección una vez al día cuando sea posible.
   14. Busque signos de infección (SOI), evidentes en las células transfectadas a las 72-96 h después de la transfección(Figura 2). Tenga en cuenta que las células transfectadas comenzarán a producir el virus e infectarán aún más el cultivo; por lo tanto, busque los signos de infección.
       NOTA: Los signos de infección son cambios estructurales en las células de los insectos, como un aumento del 25-50% en el diámetro celular, núcleos celulares agrandados, forma uniformemente redondeada, pérdida de proliferación y adherencia a la superficie del plato de cultivo, así como una disminución en la viabilidad celular(Figura 2. Baculovirus Células Sf9 infectadas y no infectadas).

3. Cribado de expresión de proteínas a pequeña escala y amplificación de virus

1. Infección de las células Sf9 con las acciones del baculovirus P1.
   NOTA: 4-5 días después de la transfección, los signos de infección deben ser evidentes en las células transfectadas en comparación con las células de control (no transfectadas) bajo un microscopio invertido. Los baculovirus recombinantes iniciales secretados en el medio de cultivo celular deben estar listos para recolectarse.
   1. Semilla 2 x 10⁵ células Sf9 de crecimiento exponencial en medios de insectos sin suero en cada pozo de las placas de 24 pozos en un volumen total de 2 mL para la infección con virus P1 para amplificar el volumen del virus (lo que resulta en la generación de los virus P2).
   2. Después de pipetear las células en las placas, mezcle suavemente las placas, usando movimiento de ida y vuelta para asegurar una monocapa uniforme. No gire las placas porque las células se agruparán en el centro del pozo.
   3. Incubar las placas a 27 °C durante al menos 1 h para permitir la adherencia celular a la placa.
   4. Dispense 4 mL de células Sf9 a una densidad de 3.5-4 x 10⁶ en medio libre de suero de insectos en cada pozo de bloques de 24 pozos para infectar con virus P1 para el cribado de expresión de proteínas.
      NOTA: Etiquete un pozo de las placas de 24 y los bloques de 24 pozos como control y utilícese como un control no infectado para la comparación de células infectadas y no infectadas cuando busque SOI.
   5. Utilizar una multicanal electrónica programable para permitir la recogida simultánea de virus P1 (paso 2.1.13), la infección de células Sf9 recién sembradas (paso 3.1.1) y la infección de las células suspensiones en los bloques de 24 pozos (paso 3.1.4) con 150 μL de virus P1.
   6. Gire hacia abajo el resto de las existencias virales P1 recogidas durante 15 minutos a 17.970 x g,transfiéndolas a tubos de microcentrífuga y guárdelas en la oscuridad a 4 °C.
   7. Mezcle suavemente las placas de 24 pozos (paso 3.1.1) en una coctelera recíproca para asegurar una distribución uniforme de los virus P1 añadidos sobre la monocapa celular; repita esto unas cuantas veces durante el tiempo de incubación.
   8. Cubra los bloques de 24 pozos con el cultivo en suspensión de células Sf9 infectadas (paso 3.1.4) con una lámina de aire.
   9. Incubar los bloques de 24 pozos a 27 °C, temblando a 245 rpm durante 72-96 h.
   10. Busque SOI dentro de 72-96 h después del tiempo de infección en las placas de 24 pozos con virus P2 (paso 3.1.1) y en los bloques de 24 pozos (paso 3.1.4) con células infectadas para el cribado de expresión.
       NOTA: 4-5 días después de la infección de las células Sf9 con los virus P1, SOI debe ser evidente en las células infectadas cuando está comparado a las células no infectadas del control bajo un microscopio invertido.
   11. Recoger los virus P2 de placas de 24 pozos, centrífuga durante 15 min a 17.970 x g,transferirlos a tubos de microcentrífuga y almacenar en la oscuridad a 4 °C.
   12. A las 72-96 h después de la infección, rocíe sobre los bloques de 24 pozos con etanol al 70%, lleve a la campana de flujo laminar y verifique la densidad celular y la viabilidad en algunos pozos mediante la tinción trypan blue.
   13. Proceder a la purificación de proteínas si las células tienen signos de infección y la viabilidad es cercana al 70-75% según lo evaluado por trypan azul tinción.
   14. Peletizar las células centrifugando los bloques de 24 pozos a 525 x g a 4 °C durante 15 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender completamente los pellets en 1 mL de tampón de lisis que comprende 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% de glicerol (v/v) y 1x cóctel inhibidor de la proteasa (100x cóctel inhibidor de proteasa comprende aprotinina 0,25 mg/mL, leupeptina 0,25 mg/mL, pepstatina A 0,25 mg/mL; E-64 0,25 mg/mL).
   15. Conservar la suspensión celular a -80 °C para la purificación de ensayo posterior (véase 3.2.2).
2. Purificación de proteínas de la suspensión de células congeladas en bloques de expresión de prueba de 24 pozos.
   1. Montaje del bloque de enlace (Figura 3).
      1. Coloque 3 capas superpuestas de parafilm en la parte superior del bloque de pozos de 96 profundidades (pozo de 96 profundidades de 2,4 mL).
      2. Coloque una placa de filtro de 96 pocillos (microplaca de filtro, 96 pocillos, polipropileno con membrana de polietileno de ultra alto peso molecular de 25 μm) en la parte superior del bloque de pozos de 96 pulgadas.
      3. Empuje hacia abajo la placa de filtro para asegurar las puntas en el parafilm para sellar la placa de filtro del bloque de 96 pozos de profundidad.
      4. Transfiera 50 μL de purines de resina de Ni-NTA preequilibrados al 50% en cada pozo de la placa de filtro.
   2. Procedimiento de expresión de prueba
      1. Colocar la suspensión de celda congelada (paso 3.1.15) presente en bloques de 24 pozos en un baño de agua en RT durante 5-10 min, luego agitar a 450 rpm durante 20 min.
      2. Centrifugar los bloques de 24 pozos a 3.275 x g durante 15 min.
      3. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera los lisatos despejados a una placa de filtro que contenga 50 μL de lodo de resina de Ni-NTA al 50% preequilibrado (paso 3.2.1.4) y selle la placa de filtro con una estera de tapa de 96 pozos (estera de tapa de 96 pozos, para uso con pozo cuadrado, 2 mL).
         NOTA: Utilice algunas bandas elásticas para mantener el bloque de unión juntos durante los pasos de incubación y centrifugación.
      4. Coloque el bloque de unión asegurado durante 45-60 minutos en un rotador en una cámara frigorífica para incubar los lisatos despejados con resina de Ni-NTA.
      5. Después de la incubación, levante cuidadosamente la placa filtrante y retire la capa de parafilm de la superficie del bloque de pozos de 96 profundidades (paso 3.2.1.1).
      6. Coloque de nuevo la placa de filtro en la parte superior del bloque de pozo de 96 profundidades y gire hacia abajo el bloque de unión asegurado durante 2 minutos a 235 x g.
      7. Lave la resina de Enlace Ni-NTA 2x con 2 mL de tampón de lavado que comprende 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol y 15 mM de imidazol.
      8. Gire hacia abajo el bloque con tampón de lavado cada vez durante 5 minutos a 235 x g para asegurar la eliminación completa del líquido residual.
      9. Transfiera la placa de filtro en la parte superior de la placa de PCR de 96 pozos que contiene 10 μL de tinte de carga 4x.
      10. Añadir 40 μL de tampón de elución (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glicerol, 500 mM imidazol) a cada pozo de la placa filtrante e incubar durante 5 min.
      11. Gire hacia abajo el bloque para eluir las proteínas en la placa de PCR de 96 pozos a 235 x g durante 10 min.
      12. Selle la placa de PCR de 96 pozos con almohadilla de grifo resistente a altas temperaturas y caliente a 98 °C durante 3 min.
      13. Cargue 15 μL de muestras de proteínas elutidas en un tampón Laemmli estándar en gel SDS-PAGE al 4-20% junto a la escalera de proteínas y ejecute el gel con un tampón estándar que contenga SDS.
      14. Manche el gel con azul Coomassie y des-mancha con agua. Analice los resultados de la expresión de prueba para identificar las mejores construcciones de expresión para la producción a gran escala.

4. Preparaciones de las células de insectos infectados por baculovirus (SCBIIC) para la producción de proteínas

1. 4 días antes del tiempo de producción programado, dividir exponencialmente el crecimiento exponencial de las células Sf9 a una densidad celular final de 2 x^{10 6} células / mL en 125 mL / 250 mL / 500 ml de frascos de agitación de vidrio Erlenmeyer con deflectores en 50 mL / 100 mL / 200 mL de insectos sin suero que contiene 1% (v / v) antibiótico-antimicótico final.
2. Añadir 0,150 mL/0,300 mL/0,6 mL de virus P2 apropiados, incubar células infectadas a 165 rpm en un agitador orbital con una carrera de una pulgada y a una temperatura más baja de 25 °C para ralentizar la división celular.
3. A los 4 días después de la infección, compruebe las células bajo un microscopio para SOI y proceder a la producción si la viabilidad de la célula como se verificó con la tinción de Trypan Blue es cercana al 70-75%.

5. Preparaciones celulares sf9 para la producción de proteínas a gran escala

1. 4 días antes del tiempo de producción programado, calcule el volumen requerido de células Sf9 para la producción de proteínas a gran escala.
2. Semilla 2 L de células Sf9 de crecimiento exponencial en medio libre de suero de insectos a una densidad celular de 1 x 10⁶ células /mL en frascos de agitación Fernbach de 2,8 L.
3. Incubar los matraces a 27 °C con agitación fijada a 150 rpm.
   NOTA: Para prevenir la contaminación bacteriana en el cultivo celular Sf9, use gentamicina a una concentración final de 10 μg/mL o penicilina/estreptomicina a 50 U/mL y 50 μg/mL, respectivamente.

6. Infección de las células Sf9 con SCBIIS para la producción a gran escala de la proteína

1. Divida 2 L o 4 L de células Sf9 de crecimiento exponencial en medio libre de suero de insectos a una densidad celular final de 4 x 10⁶ células / mL en frascos de agitación Tunair de 2,5 L o botellas de reactivos de 5 L.
2. Añadir 10-12 mL/L del cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus (SCBIIC).
3. Incubar el cultivo infectado de células Sf9 en una coctelera con 145 rpm a la temperatura más baja de 25 °C (para ralentizar la división celular) durante 72-96 h.
4. A las 72 h después de la infección, compruebe las células bajo un microscopio para SOI y evaluar la viabilidad celular.
5. Por lo general, después de aproximadamente 72 h después de la infección, la viabilidad de las células Sf9 cae a 70%-75% (medido con la tinción trypan azul). Cosechar células Sf9 infectadas en una botella de polipropileno de 1 L por centrifugación a 900 x g durante 15 min a 4 °C.
6. Resuspend el pellet celular recogido de 1 L del cultivo celular de producción con 20-25 mL de 1x PBS por arremolinado suavemente y transferencia en tubos cónicos de 50 mL.
7. Gire hacia abajo la suspensión de la célula a 900 x g durante 15 min y deseche la solución de PBS.
8. Resuspend el pellet de células lavadas con 20-25 mL del tampón de suspensión (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 1x cóctel inhibidor de proteasa) y congelación repentina en nitrógeno líquido; almacenar a −80 °C hasta la purificación.
   NOTA: Los procedimientos de purificación para los PRMTs se han descrito en detalle en el documento publicado por SGC⁶.

Resultados

Una descripción general del protocolo BEVS se describe en la Figura 1. Múltiples construcciones de expresión de PRMTs, incluyendo de longitud completa, dominios y fragmentos truncados, se generaron en el Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) de acuerdo con estrategias internas con un intento de aumentar la tasa de éxito para la identificación de proteínas solubles y estables con un nivel de expresión relativamente alto^7,9. Se anima a los lectores interesados a revisar las definiciones y la metodología del SGC de diseñar un "fragmento" como el segmento de la secuencia génica incorporada en un clon de expresión, "dominio" como un dominio estructural anotado por PFAM, y "constructo" como el fragmento clonado en un vector de expresión, todos los cuales han sido descritos en detalle en una publicación anterior⁷. Las construcciones de expresión de PRMTs presentadas en este protocolo son para la producción de las proteínas marcadas con polihistidina clonadas en el vector pFBOH-MHL, que es un derivado del vector pFastBac1. En la Figura 4,presentamos el análisis SDS-PAGE de las construcciones solubles his-tagged de PRMT1, 2, 4-9 purificados a partir de pellets recogidos después de 4 mL de producción en células Sf9 (paso 3.1.4). Prmt1 y PRMT9 de longitud completa (FL) no se presentan en este gel, ya que FL PRMT1 se ha producido a partir de E. coli,y FL PRMT9 producido a partir de BEVS ha sido purificado por Flag-tag^6. Las construcciones truncadas de PRMT1, FL PRMT4 y todas las construcciones de PRMT8 muestran un rendimiento relativamente alto, pero los eluatos de proteínas contienen fracciones de contaminantes co-purificados. Estas construcciones requieren una mayor optimización de los protocolos de purificación. Por lo tanto, se requieren enfoques adicionales para mejorar la pureza de estas proteínas a partir de producciones a escala, como una reducción en la cantidad de perlas de níquel en la etapa de incubación con un lisato clarificado; un aumento de las concentraciones de imidazol en los tampones de lavado; escisión de la His-tag con la proteasa tev, seguido de la aplicación en una resina de afinidad ni; y, pasos de purificación adicionales como la cromatografía de exclusión de tamaño e intercambio iónico. Las construcciones de PRMT2 muestran un rendimiento significativamente menor en comparación con otras proteínas y la proteína PRMT2 de longitud completa acompañada de una fuerte banda de contaminantes. La producción a escala y dos pasos de purificaciones como IMAC y exclusión de tamaño confirmaron un bajo nivel de expresión para este constructo junto con la presencia persistente del contaminante co-purificante para la proteína FL. Se han obtenido proteínas puras para el complejo PRMT5 producidas y purificadas con su socio de unión obligado, MEP50. La construcción truncada de PRMT9 tiene un nivel de expresión casi dos o tres veces menor, cercano a 1,5 mg/L, en comparación con otros PRMTs. Sin embargo, las existencias virales recombinantes de este constructo se han utilizado para la producción a escala, se obtuvieron cristales difraccionantes, y se resolvió la estructura para esta proteína junto con PRMT4, 6 y 7(Figura 5).

Para las producciones de escalado vertical, se utilizaron los virus P2 correspondientes para infectar el cultivo en suspensión de las células de insectos Sf9. Este paso genera 50/100/200 mL de células infectadas por baculovirus que contienen células infectadas y virus P3 en el sobrenadante. Para la producción de proteínas a gran escala, se cultivaron 2 L de células Sf9 en cada uno de los matraces de agitación Fernbach de 2,8 L a 150 rpm, 27 °C(Figura 6). En el día de la producción, 2 L de células Sf9 (viabilidad celular > 97%) en 2,5 L los frascos de agitación Tunair o 4 L en 5 L botellas de reactivos se diluyeron a una densidad celular de 4 x 10⁶/mL. Estas células fueron infectadas directamente con 10-12 mL/L de cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus e incubadas a una temperatura bajada de 25 °C, a 145 rpm. La infección del lote de producción directamente con un cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus redujo significativamente los pasos laboriosos y lentos en la amplificación del volumen del virus, excluyendo el manejo adicional de las células infectadas, y evitó la reducción del título y la degradación del virus. El mantenimiento del cultivo celular SF9 y la producción a escala se han realizado en los recipientes de cultivo con un volumen de alto llenado para adoptar una producción de proteínas a gran escala en un lote (Figura 6).

Las proteínas de longitud completa PRMT 4, 5 (en complejo con MEP50), 6, 7 y 9 producidas a partir de la plataforma de producción mediada por Baculovirus se han utilizado para la caracterización cinética y el cribado de compuestos inhibidores en el SGC^6. Las estructuras cristalinas fueron resueltas y depositadas en el banco de datos de la proteína (PDB) para las formas completas o truncadas de las proteínas PRMT 4, 6, 7, y 9 con las varias puntas de prueba e inhibidores químicos. Los plásmidos de expresión para estos PRMTs se depositaron en el repositorio de plásmidos Addgene (Addgene es un socio distribuidor del SGC, https://www.addgene.org/) y están disponibles para la comunidad de investigación(Figura 5).

Figura 1:Descripción general esquemática de los pasos del proceso de expresión de baculovirus Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Baculovirus Células Sf9 infectadas y no infectadas. Los signos de infección son cambios estructurales en las células de los insectos, como un aumento del 25-50% en el diámetro celular, núcleos celulares agrandados, forma uniformemente redondeada, pérdida de proliferación y adherencia a la superficie del plato de cultivo, así como una disminución en la viabilidad celular. Barra de escala blanca 200 μm. Los signos de infección presentados aquí son los mismos para las células transfectadas que utilizan ambos reactivos de transfección, JetPrime y X-tremeGene 9. El ejemplo particular que se muestra es para el reactivo de transfección JetPrime. (A)Células Sf9 no infectadas como control. (B)Células Sf9 infectadas por baculovirus. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3:Montaje de placas de unión para la purificación rápida de las proteínas de expresión de prueba. Consulte el texto para obtener más información, pasos 3.2.1-2 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:Resultados del cribado de expresión proteica. Los resultados del cribado de expresión proteica del baculovirus mediaron la producción de proteínas en 4 mL de cultivo en suspensión sf9 infectados con los correspondientes virus recombinantes P1 para diferentes PRMTs y el complejo PRMT5-MEP50. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5:Resumen de constructos de expresión para PRMT4, 6, 7 y 9 utilizados para estudios de estructura cristalina en el Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Las estructuras cristalinas fueron resueltas y depositadas en el banco de datos de la proteína (PDB) para la longitud completa o las formas truncadas de proteínas PRMT 4, 6, 7, y 9 con las varias puntas de prueba y de los inhibidores químicos. Los plásmidos de expresión para estos PRMTs se depositaron en el repositorio de plásmidos Addgene y están disponibles para la comunidad de investigación (Addgene es un socio distribuidor del SGC, https://www.addgene.org/). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6:Mantenimiento de células de insectos Sf9 y producción de proteínas en los diferentes recipientes de cultivo: (A)Matraz Fernbach de 2,8 L para mantenimiento celular y producción de proteínas. El uso del volumen de llenado del 72% aumenta la tasa de rendimiento en 2,5 veces en una plataforma de agitación. (B) Los frascos de agitación de Tunair (solo 9 frascos de cada 10 se presentan en esta imagen) y las botellas de reactivos con un volumen de llenado del 80% aumentan drásticamente la capacidad de producción de la plataforma de agitación. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Discusión

Una de las ventajas de BEVS en células de insectos se centra en la capacidad de la maquinaria de modificación post-traduccional para permitir modificaciones más complejas como la fosforilación, la miristoilación y la glicosilación. Junto con el plegamiento altamente eficiente de las proteínas de mamíferos, estas modificaciones facilitan altas cantidades de proteínas modificadas y plegadas adecuadas para experimentos aguas abajo fisiológicamente relevantes¹⁶.

Aquí, se describen los protocolos detallados de la BEVS haciendo hincapié en los elementos críticos para la detección de expresión exitosa de múltiples construcciones de proteínas PRMT y la producción de proteínas PRMT a gran escala en la plataforma de expresión de Baculovirus: 1) El uso de pipetas multicanal regulares, ajustables y programables para transferir los materiales biológicos entre 24 - y 96 - placas de cultivo celular pozo y bloques en las etapas de la generación de ADN bacmid y virus; una colección de los virus recombinantes, la amplificación de los volúmenes virales de los virus recombinantes y la preparación de los bloques de cribado de expresión de proteínas. 2) Reactivos de transfección de alto rendimiento y rentables para la generación de virus recombinantes. 3) Cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus (SCBIIC) para la producción de proteínas a gran escala. 4) Utilización de frascos de batido Fernbach de alto volumen de llenado de 2,8 L para mantener el cultivo de suspensión Sf9 y frascos de batido Tunair de 2,5 L y botellas de reactivos de 5 L para la producción de proteínas a gran escala.

Consideraciones especiales y justificación de los pasos de transformación y transfección.
Aunque un protocolo comercial recomienda el uso de 100 μL de células competentes para una transformación^14,la eficiencia de transformación de las células comerciales competentes DH10Bac E. coli es tan alta como 1 x 10⁸ ufc / μg de ADN, por lo que utilizamos sólo 4 μL. Esto es suficiente para que cada transformante obtenga colonias recombinantes blancas aisladas para el aislamiento del ADN bacmid. Las células adherentes de Sf9 en la placa de transfección de 24 pozos se sembraron a una densidad celular de 2 x 10⁵ /mL en 0,5 mL de medios de insectos sin suero. Este volumen es suficiente para garantizar una cobertura uniforme de la superficie de trabajo del pozo. Al mismo tiempo, no diluye demasiado la mezcla de transfección, lo que mejora la eficiencia de la transfección. Los reactivos de transfección no son tóxicos para las células Sf9, y el intercambio de medios no es necesario. En lugar de un cambio de medios, se agregan 1,5 mL adicionales de medios que contienen 10% (v/v) de FBS en la placa de transfección a las 4-5 horas de tiempo posterior a la transfección para facilitar el crecimiento celular. La eficiencia de transfección de ambos reactivos de transfección es alta. Aún así, con X-tremeGene 9, los signos de infección en las células transfectadas(Figura 2) aparecen10-12 h antes que con el reactivo JetPrime, por lo que elegimos entre estos reactivos en función del horario de trabajo de los siguientes pasos en los protocolos, lo que proporciona cierta flexibilidad en el proceso general.

La detección de expresión de pruebas de proteínas se puede configurar con virus P2 si la cantidad de los virus recombinantes iniciales, recolectados de la placa de transfección y etiquetados como P1, es un factor limitante a utilizar para el cribado de expresión de proteínas.

Consideraciones al pasar de volúmenes de referencia cultural pequeños a grandes.
Históricamente, se creía que el crecimiento óptimo de las células requiere un alto espacio aéreo en el cultivo de suspensión de las producciones de mantenimiento y escalado de células Sf9. Sin embargo, en 2014, se informó que el alto espacio aéreo en los buques de cultivo es menos crítico de lo que se pensaba¹⁷. Un recipiente de cultivo configurado utilizando la velocidad de agitación ajustada adecuadamente al tiro orbital de la plataforma de agitación proporcionará suficiente transferencia de oxígeno incluso en el cultivo de suspensión de alto volumen de llenado mediante la creación y el mantenimiento de pequeñas burbujas de aire durante más tiempo. Con este enfoque, las células de insectos disponibles en el mercado se pueden cultivar a una velocidad de agitación más alta dentro de un rango normal del tiempo de duplicación de las células sin sacrificar la alta viabilidad celular.

Así, hace 6 años, comenzamos a aumentar el volumen de cultivo en suspensión en un matraz de agitación durante el mantenimiento celular e introdujimos un tipo diferente de recipiente de cultivo para la producción de proteínas mientras ajustamos y monitoreamos las condiciones de agitación(Figura 6). Para establecer condiciones óptimas en estos recipientes de cultivo, se supervisaron los parámetros de cultivo celular Sf9, tales como el tiempo de duplicación celular junto con la viabilidad celular, tamaño y forma, estado de agregación, y la infectabilidad de las células.

Por ejemplo, para el mantenimiento de células Sf9, en los frascos de agitación Fernbach de 2,8 L, cultivamos 2 L en lugar de 0,8 L de las células de suspensión Sf9 que tiemblan a 150 rpm a 27 °C y la viabilidad celular la mayor parte del tiempo es cercana al 99%, con células en división sanas de forma uniforme. Para la producción a escala, infectamos 4 L de células en botellas de reactivos de 5 L que tiemblan a alta velocidad a 145 rpm a una temperatura bajada de 25 °C. Las incubadoras más utilizadas con una plataforma de agitación incorporada pueden contener frascos de agitación de 6 x 2.8 L o botellas de reactivos de 6 x 5 L, o frascos de agitación Tunair de 10 x 2.5 L. Por lo tanto, la capacidad de la plataforma de agitación única, si llenamos los frascos de agitación Fernbach y las botellas de reactivos a 1/3 frente al volumen de alto llenado de los recipientes es de 4,8 L frente a 12 L utilizando frascos de agitación Fernbach de 2,8 L y 10 L frente a 24 L utilizando botellas de reactivos de 5 L(Figura 6). El mantenimiento del cultivo celular en suspensión y la producción a escala en los recipientes de cultivo con un volumen de llenado alto nos han ayudado a superar las limitaciones de los volúmenes de producción y adoptar una plataforma a gran escala. Por lo tanto, esto es muy útil para laboratorios sin acceso a biorreactores y / o espacio limitado en las tuberías de producción.

Este protocolo podría adaptarse fácilmente para la producción y purificación de construcciones de proteínas con diferentes etiquetas de afinidad mediante la utilización de resinas apropiadas y la modificación de tampones de purificación como se ha descrito en el documento publicado SGC⁶ para las proteínas de longitud completa marcadas con bandera de PRMT4, 7, 9, y el complejo PRMT5-MEP50 con etiqueta His y PRMT6. Aunque describimos un protocolo BEVS para la familia prmt de proteínas, el mismo enfoque se puede aplicar a cualquier otra familia de proteínas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2.8L Nalgene  Matraz de cultivo Fernbach, policarbonato,Nalgene		29171-854	Para el mantenimiento a gran escala del cultivo en suspensión de células Sf9
Bloques de 24 pocillos RB	Qiagen	19583	Para la incubación de  4ml de suspensión  Células Sf9  para proteínas  cribado
de expresión 4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	Para el análisis SDS-PAGe de las proteínas purificadas
50ml Reservorio de reactivos	Celltreat Scientific Products	229290	Depósito utilizado para el reactivo de transfección diluido  y células Sf9 suspensión
de 96 pocillos Tapete de tapa de 96 pocillos, para usar con pocillo cuadrado, 2 mL	Greiner Bio-One	381080	Se utiliza para cubrir bloques de 96 pocillos
Placa de PCR de 96 pocillos	Eppendorf	30129300
Bacto agar	BD	214010	Para paletas de selección de agar LB
Hojas de cinta Airpore	Qiagen	19571	Para cubrir bloques de 24 pocillos para el cribado
de la expresión de proteínasCentrífuga Allega X-15R	Beckman Coulter	392932
Antibiótico Antimicótico (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA		artículo interno fuera del catálogo	ADN Bacmid para la producción de baculovirus
Bluo-Gal, 1g	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
Placas de cultivo celular, 24 pocillos, con tapa, fondo plano, estéril	Eppendorf	30722116	Tissue  placa tratada con cultivo
Cell Resuspension Solution 0.5  L	Millipore Sigma	LSKCRS500	para la célula de extracción de ADN Bacmid
Solución de lisis 0.5  L	Millipore Sigma LSKCLS500		para la extracción de ADN Bacmid
CELLSTAR  Placas de cultivo de tejidos, 96 pocillos	Greiner Bio-One	655180	Para mezcla de transfección
ClipTip 1250, recarga de filtro, estéril	ThermoFisher Scientific	94420818	Consejos para  pipeta multicanal programable y ajustable
dNTP Mix (25 mM cada una)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip  Pipeta ecualizadora multicanal con espaciado de punta ajustable electrónicamente, de 15 a 1250 μ L	ThermoFisher Scientific	4672090BT	Pipeta multicanal programable y ajustable
E4  Espaciador ajustable XLS pipeta de 6 canales, 20-300 μ L	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin pipeta multicanal ajustable
Microplaca de filtro, 96 pocillos, polipropileno, con 25 µ membrana de polietileno de ultra alto peso molecular	Agilent	201005-100	Para la purificación de proteínas en el cribado de expresión
Kit de matraz con deflector completo Tunair, 2.5L	IBI Scientific	SS-6003C	Para la producción de proteínas a gran escala en cultivo en suspensión de células SF9
Gentamicina 10x10ml	BioShop	15750078
Heat Inactivado Fetal Bovino Suero Wisent	Biocenter	080-450
I-Max Medios para insectos con L-glutamina, 1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	Medio de crecimiento de células de insectos sin suero
InstantBlue, tinción de proteínas ultrarrápida Expedeon	Protein Solutions	ISB1L-1L	Para tinción de gel de proteínas (SDS-PAGE)
Iptg, ultra puro, sin dioxano, min 99.5%	BioShop	IPT001.100
Reactivo de transfección JetPRIME  Provisto de  tampón jetPRIME	POLYPLUS TRANSFECTION INC	114-01	Para la transfección de células Sf9 para generar baculovirus
Kanamicina Monosulfato	BioShop	KAN201.100
Lb Caldo (Lennox), Polvo Microbiano Gro&	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 pozo profundo 2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	Utilizado en los procedimientos de cribado de transformación y expresión
Células competentes DH10Bac de máxima eficiencia, 0,5 ml	Thermo Fisher	10361012	Células competentes para la generación de ADN bacmid
Pipeta mLINE de 12 canales, ajustable 30 - 300 uL	Sartorius Sartorius	725240	12 canales
pipeta Solución de neutralización, 0,5  L	Millipore Sigma	LSKNS0500	para la extracción de ADN bacmid
New Brunswick  Innova 44R, 120V, órbita 2,5 cm (1 pulg)	Eppendorf	M1282-0004	Incubadora agitadora para incubación de células Sf9
Ni-NTA Agarosa	Qiagen	30250	Para la purificación de proteínas
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	LS15140122
PYREX  Matraz Shaker Delong Erlenmeyer con deflectores, Corning  500ml	Pyrex	4444-500	For  cultivo en suspensión de células Sf9
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Matraz con Deflectores, Corning  125ml	Pyrex	4444-125	Para el cultivo en suspensión de células Sf9
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Matraz con Deflectores, Corning  250ml	Pyrex	4444-250	Para el cultivo en suspensión de células
Sf9RedSafe  Nucleico  Ácido  Tinción  Solución	Froggabio	21141
RNasa A, 0.9  mL	Millipore Sigma LSKPMRN30		Para tampón de suspensión para la extracción de ADN de bacmid
Roll & Cultive perlas esféricas de recubrimiento de vidrio	MP Biomedicals 115000550		para la propagación de células bacterianas a través de la superficie de una placa de agar.
RT-LTS-A-300μ L-768/8 (puntas)	Ranin	30389253	Puntas para pipeta multicanal de ranin
S.O.C. Medio	Thermo Fisher Scientific	15544034
Suero, Cultivo Celular, Suero Fetal Bovino (Fbs), Hyclone, Caracterizado	Cytivalifesciences	SH3039602	Además del suero libre de medim para  las células transfectadas
Células Sf9	Thermo Fisher	12659017	Insecto Células
Sfx-Medios de cultivo de células de insectos	Cytiva (anteriormente GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	Medio de crecimiento de células de insectos sin suero
Almohadilla de cinta	Qiagen	19570	Almohadilla de cinta
Taq ADN polimerasa con tampón ThermoPol - 2.000 unidades	New England Biolabs	M0267L
Tetraciclina Hcl	BioShop	TET701.10
Azul Tripán 0.4% Solución	Gibco	15250061	For  evaluación de la viabilidad celular
VITLAB  Frascos de reactivos, PP con tapón de rosca, PP, BrandTech, 5L	VITLAB	V100889	Para la producción de proteínas a gran escala en el cultivo en suspensión de células Sf9
VWR  Mini incubadora digital	VWR	10055-006	Incubadora para células Sf9 adherentes
VWR  Incubadora de microplacas	VWR	97043-606	Incubadora para el cultivo en suspensión de células Sf9 en bloques de 24 pocillos
Placas de Petri VWR		VWR CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Reactivo de transfección  1.0 M	Roche	6365787001	para la transfección de células Sf9 para generar baculovirus recombinante