Este protocolo destaca un método para evaluar rápidamente la biocompatibilidad de una tinta de biomaterial de hidrogel compuesto de nanocelulosa cristalina (CNC)/agarosa con mastocitos derivados de la médula ósea de ratón en términos de viabilidad celular y expresión fenotípica de los receptores de la superficie celular, Kit (CD117) y receptor IgE de alta afinidad (FcεRI).
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Artículo de método
Fabricación de una tinta de biomaterial de agarosa incrustada en nanocelulosa cristalina para el cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea
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Resumen
Resumen
La bioimpresión tridimensional (3D) utiliza compuestos a base de hidrogel (o tintas de biomateriales) que se depositan en un patrón, formando un sustrato sobre el que se depositan las células. Debido a que muchas tintas de biomateriales pueden ser potencialmente citotóxicas para las células primarias, es necesario determinar la biocompatibilidad de estos compuestos de hidrogel antes de su utilización en costosos procesos de ingeniería de tejidos 3D. Algunos métodos de cultivo 3D, incluida la bioimpresión, requieren que las células se incrusten en una matriz 3D, lo que dificulta la extracción y el análisis de las células en busca de cambios en la viabilidad y la expresión de biomarcadores sin provocar daños mecánicos. Este protocolo describe como prueba de concepto, un método para evaluar la biocompatibilidad de un compuesto de agarosa incrustado de nanocelulosa cristalina (CNC), fabricado en un sistema de cultivo de 24 pocillos, con mastocitos derivados de médula ósea de ratón (BMMC) utilizando ensayos citométricos de flujo para la viabilidad celular y la expresión de biomarcadores.
Después de 18 h de exposición a la matriz CNC/agarosa/D-manitol, la viabilidad de BMMC no se alteró según lo medido por la permeabilidad del yoduro de propidio (PI). Sin embargo, los BMMC cultivados en el sustrato CNC/agarosa/D-manitol parecieron aumentar ligeramente su expresión del receptor IgE de alta afinidad (FcεRI) y el receptor del factor de células madre (Kit; CD117), aunque esto no parece depender de la cantidad de CNC en el compuesto de biotinta. La viabilidad de los BMMC también se evaluó después de una exposición prolongada a andamios de hidrogel que se fabricaron a partir de una tinta de biomaterial comercial compuesta de nanocelulosa fibrilar (FNC) y alginato de sodio utilizando una bioimpresora de extrusión 3D. Durante un período de 6-48 h, los sustratos FNC/alginato no afectaron negativamente a la viabilidad de los BMMCs según lo determinado por la citometría de flujo y los ensayos de microtituladores (XTT y lactato deshidrogenasa). Este protocolo describe un método eficiente para evaluar rápidamente la compatibilidad bioquímica de las tintas de biomateriales candidatas para su utilidad como andamios 3D para la siembra posterior a la impresión con mastocitos.
Introducción
El reciente interés en los sistemas de cultivo 3D y la bioimpresión 3D ha centrado la atención en los hidrogeles y los compuestos de hidrogel. Estos compuestos sirven como biomiméticos viscosos pero porosos y pueden estar compuestos de hasta un 99% de contenido de agua en peso, lo que es comparable a los tejidos biológicos1,2,3. Estas características de los compuestos de hidrogel permiten el crecimiento de las células sin afectar su viabilidad y función. Uno de estos compuestos es la nanocelulosa cristalina (CNC), que se ha utilizado como material de refuerzo en compuestos de....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo se compone de cinco secciones: (1) aislamiento de la médula ósea de ratón y diferenciación de mastocitos derivados de la médula ósea de ratón (BMMCs), (2) fabricación de sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol en un sistema de 24 pocillos y cultivo de BMMCs en los sustratos, (3) eliminación de BMMCs de los sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol y análisis de viabilidad y expresión de biomarcadores mediante citometría de flujo, (4) Bioimpresión 3D de andamios de hidrogel a partir de una tinta de biomaterial compuesto de nanocelulosa fibrilar (FNC)/alginato de sodio disponible comercialmente, y (5) cultivo de BMMC en andamios de hidrogel d....
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Resultados
Una de las características más cruciales de una tinta de biomaterial o sustrato de cultivo exitoso es la de la biocompatibilidad. Principalmente, el sustrato no debe inducir la muerte celular. Existen varios métodos citométricos de flujo y basados en microtituladores para cuantificar la viabilidad celular y la necrosis; sin embargo, estos métodos no son susceptibles de analizar células incrustadas dentro de una matriz de hidrogel. En este protocolo, la limitación mencionada anteriormente se elude sembrando los MMMC en el.......
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Discusión
La fabricación de tejidos biomiméticos 3D requiere la amalgama exitosa de la biotinta, que imita los componentes de la matriz extracelular, con los componentes celulares para crear análogos fisiológicos de los tejidos in vivo . Esto requiere el uso de células primarias, y no células transformadas, al fabricar tejidos biomiméticos fisiológicos. Sin embargo, las células inmunológicas primarias, como los mastocitos, son particularmente susceptibles a los efectos citotóxicos y a los cambios fenotípicos que pueden se.......
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Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación de Canadá y Alberta Innovates.
Agradecimientos
Agradecemos a Alberta Innovates por proporcionar el CNC y a Ken Harris y Jae-Young Cho por su asesoramiento técnico al preparar la matriz CNC/agarosa/D-manitol. También agradecemos a Ben Hoffman, Heather Winchell y Nicole Diamantides por su asesoramiento técnico y apoyo con la configuración y calibración de la bioimpresora 3D INKREDIBLE+.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| A | |||
| Ácido acético (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarosa (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Hámster Armenio IgG Control, APC (Clon: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoetanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamida adenina dinucleótido sodio sal (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Jeringa (punta Luer-Lok) | BD | 309646 | |
| BD Aguja PrecisionGlide 26G x 1/2 en | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Pocillos | Multiplato Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Pocillos | Multiplato Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Matraz ventilado | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Gabinete de bioseguridad Clase II | Microzone Corp., Canadá | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fracción V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 | Laboratorio Jackson 000664 | ||
| CD117 (c-Kit) Anticuerpo monoclonal, PE (clon: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (cartucho de 3 x 3 ml) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Agente de reticulación - Botella estéril 1 x 60 mL | CELLINK LLC | ||
| CELLINK Cartuchos vacíos de 3 cc con tapas de extremo y punta | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare para PC | CELLINK LLC | Versión 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Boquillas de bioimpresión cónicas estándar estériles 22G | CELLINK LLC | ||
| CELLINK Boquillas de bioimpresión cónicas estándar estériles 25G | CELLINK LLC | ||
| CELLINK Boquillas de bioimpresión cónicas estándar estériles 27G | CELLINK LLC | ||
| Kit de Proliferación Celular II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | ||
| (de sobremesa) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 pocillos, transparente, de fondo plano y sin tratar, microplaca PS | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| Incubadora de CO2 | Binder GmbH, Alemania | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Citómetro de flujo | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-manitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Tubos cónicos de poliestireno, estériles | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Tubos cónicos de poliestireno, estériles | Corning | 352070 | |
| FceR1 alfa Anticuerpo monoclonal, APC (Clon: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Suero fetal bovino (FBS), calificado, calor | Thermo Fisher Scientific | inactivado 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. EE. UU. | Versión 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | Prism GraphPad Software, LLC | versión 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Mejorado Neubauer 0,1 mmm de gravamen profundo) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sal de sodio | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| ICloruro de | |||
| yodonitrotetrazolio (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamina 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| L-lactato de litio | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Aminoácidos no esenciales 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-metoxi-5-metilfenazinio metilsulfato (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubos (1,7 mL transparente) | Microtubos Axygen | MCT-175-C | |
| (2,0 mL transparente) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (para la producción de agua ultrapura MilliQ) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Unidad de filtro de flujo rápido de 90 mm (tamaño de poro de 0,2 mm, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Filtro de jeringa Nalgene (0,2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicilina Estreptomicina 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7,4, Sin Calcio/Magnesio, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Yoduro de propidio, 1,0 mg/ml (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clon: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medio 1X + 2.05 mM L-Glutamina (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 pocillo base redonda PS placa de prueba transparente (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Azida de sodio, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Piruvato de sodio (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hidroximetil)-1,3-propanodiol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| solución de azul de tripano (0,4%, para microscopía) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| Espectrofotómetro de microplacas VARIOSKAN LUX (tipo: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
Referencias
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.
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Reimpresiones y permisos
