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Artículo de método

Tinción del Ca2+ citoplasmático con Fluo-4/AM en pulpa de manzana

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DOI:

10.3791/62526

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6 de noviembre de 2021

 ,  ,  , 
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

En este artículo

Resumen

Los protoplastos aislados de células de pulpa de manzana se cargaron con un reactivo fluorescente de calcio para detectar la concentración citoplasmática de Ca2+.

Resumen

El Ca2+ citosólico juega un papel clave en el desarrollo de las plantas. La imagen de calcio es el método más versátil para detectar cambios dinámicos en Ca2+ en el citoplasma. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de células pulpares por hidrólisis enzimática. Los protoplastos aislados se incubaron con el reactivo fluorescente de molécula pequeña (Fluo-4/AM) durante 30 min a 37 °C. Las sondas fluorescentes tiñeron con éxito el Ca2+ citosólico pero no se acumularon en las vacuolas. La3+,un bloqueador de los canales de Ca2+, disminuyó la intensidad de la fluorescencia citoplasmática. Estos resultados sugieren que Fluo-4 / AM se puede utilizar para detectar cambios en ca2 + citosólico en la pulpa de la fruta. En resumen, presentamos un método para aislar eficazmente los protoplastos de las células de la carne de la fruta y detectar Ca2+ cargando un reactivo fluorescente de calcio de molécula pequeña en el citoplasma de las células pulpares.

Introducción

Ca2+ juega un papel importante en la transducción de señales y el metabolismode las plantas 1,2. Además, regula los rasgos de calidad de la fruta3,4, incluida la dureza, el contenido de azúcar y la susceptibilidad a los trastornos fisiológicos durante el almacenamiento5,6. El Ca2+ citoplasmático juega un papel importante en la transducción de señales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas7. La alteración de la homeostasis del calcio celular puede inducir hueso amargo en manzanas8,enfermedad de manchas marrones en peras9y pudrición umbilical en tomates10,afectando la calidad de la fruta y causando graves pérdidas económicas3,11. Las imágenes de calcio tienen suficiente resolución espacial y temporal y es un método importante para observar la dinámica de Ca2+ en células vivas12,13.

En la actualidad, hay dos métodos principales para la obtención de imágenes de calcio intracelular en células vivas: uno emplea sondas fluorescentes químicas de pequeño molecular14, y el otro es el sensor de codificación de genes (GECI)15,16. Dada la dificultad de establecer un sistema transgénico estable en los árboles frutales y un desarrollo más largo de la fruta, GECIS no es adecuado para la obtención de imágenes de fluorescencia Ca2+ de la fruta.

Las sondas fluorescentes de moléculas pequeñas como Fluo-4/AM tienen una ventaja particular: su forma de éster AM (derivado del acetoximetilo éster permeable a las células) puede cargarse fácilmente a granel en las células vivas sin necesidad de transfección, lo que la hace flexible, rápida y no citotóxica17. Fluo-4 / AM podría cargarse con éxito en el tubo de polen de Pyrus pyrifolia18 y Petunia,19, así como en las células de guardia20 y el vello de la raíz de Arabidopsis21.

En la actualidad, hay pocos informes sobre la tinción de fluorescencia de calcio de las células pulpares22. Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y control de calidad de los frutos de los árboles como las manzanas. Los manzanos son reconocidos mundialmente como una especie económica importante, y las manzanas se consideran un alimento saludable23. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de pulpa de fruta de manzana a través de hidrólisis enzimática y luego cargamos reactivos fluorescentes de moléculas pequeñas en el citoplasma para detectar Ca2 +.

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Protocolo

1. Extracción de protoplastos

  1. Preparar la solución básica: 20 mM De CaCl2, 5 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico y 0,4 M de D-sorbitol.
    NOTA: El pH de la solución básica se ajustó a 5,8 con tampón Tris de 0,1 M, se filtró a través de filtros solubles en agua de 0,22 μm y se almacenó a 4 °C.
  2. Preparar la solución enzimática: Mezclar 0,3% (p/v) Macerozyme R-10 y 0,5% (p/v) celulasa R-10 con la solución básica.
  3. Añadir 0,5 ml de solución enzimática en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Elige una manzana sana y madura. Luego corte la pulpa en 10 x 5 x 1 mm3 tamaño (Figura 1A-1C).
  4. Coloque las piezas de pulpa de fruta de manzana en un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenga solución enzimática y luego cierre el tubo (Figura 1D).
  5. Incubar el tubo a 28 °C durante 1 h, agitando a 70 rpm/min en un agitador en la oscuridad.
  6. Lavar los trozos de pulpa. Aspire toda la solución enzimática y luego agregue 0.5 ml de la solución básica.
  7. Centrifugadora a 300 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
  8. Para obtener una suspensión de protoplasto, aspire la solución desde la parte inferior del tubo de la centrífuga (Figura 1E).

2. Tinción de fluorescencia de iones de calcio de molécula pequeña

  1. Prepare la solución de carga Fluo-4/AM con 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 y solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS:80 mM Na2HPO4, 1.36 M NaCI, 20 mM KH2PO4y 26 mM KCI) en una proporción de 1:1:2.
  2. Añadir 1 μL de solución de carga fluo-4/AM a 99 μL de la suspensión de protoplasto presente en los tubos centrífugos de 1,5 ml. Asegúrese de que la concentración final del colorante fluorescente sea de 5 μM. Mezcle la solución y luego cierre el tubo.
  3. Tratamiento La3+: Preparar 100 μM La3+ solución con 98 μL de la suspensión protoplasta, 1 μL de 10 mM La3+y 1 μL de solución de carga Fluo-4/AM. Mezcle la solución y cierre el tubo.
  4. Incubar durante 30 min a 37 °C en la oscuridad.
  5. Lavar los protoplastos por centrifugación a 300 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspire 70 μL de la solución y agregue 70 μL de la solución básica.
  6. Incubar la suspensión de protoplastos a 37 °C durante 30 min para desesterrificar completamente.
  7. Aspirar 15 μL de la suspensión del protoplasto y gotear sobre un portaobjetos.
  8. Observar bajo un microscopio de fluorescencia (Figura suplementaria S1).
    NOTA: Utilice una cámara a color con alta sensibilidad, es decir, un sensor CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) con una resolución de píxeles de 3,45 μm.
  9. Seleccione el canal GFP para la obtención de imágenes (20x). Establezca el brillo en 0.5.
    NOTA: La iluminación son cubos de luz LED de intensidad ajustable con un conjunto de filtros recubiertos de dureza integrados. La longitud de onda de excitación de Fluo-4/AM es de 490 nm.

3. Ensayo de viabilidad de Protoplast

  1. Prepare la solución de diacetato de fluoresceína (FDA): Disuelva la FDA en acetona hasta que la concentración final sea de 1 mg / ml.
  2. Prepare la solución de trabajo de la FDA con 1 μL de la solución de almacenamiento y 99 μL de acetona.
  3. Añadir 1 μL de solución de trabajo fda a 99 μL de suspensión de protoplastos. Mezcle la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y luego cierre el tubo.
    NOTA: La concentración final de la FDA es de 100 μg/L.
  4. Mancha a temperatura ambiente durante 5 min en la oscuridad.
  5. Prepare las diapositivas y observe bajo un microscopio de fluorescencia.
  6. Seleccione el canal GFP para la obtención de imágenes(Figura 1F).

4. Análisis de imágenes

  1. Analice las imágenes adquiridas utilizando software de análisis de imágenes y hojas de cálculo (por ejemplo, Image-Pro Plus y Excel 2010).
  2. Seleccione dos diámetros verticales de los protoplastos para calcular la intensidad de fluorescencia (Figura suplementaria S2). Se midió la intensidad de fluorescencia de todos los protoplastos bajo diferentes tratamientos. Para el procesamiento final, utilice el software de edición de fotos.

5. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando software estadístico(Figura suplementaria S3). Los datos se presentan en Media ± SD. Se utilizó la prueba tdel estudiante para analizar las diferencias entre los grupos experimentales.

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Resultados

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos viables de la pulpa (Figura 1). Algunos protoplastos tenían vacuolas, mientras que otros no. Mientras que los protoplastos no exhibieron fluorescencia cuando el indicador fluorescente Ca2 + no se cargó en ellos. Cuando Fluo-4/AM se cargó en los protoplastos, el citoplasma, pero no la vacuola, se volvió fluorescente (Figura 2). Este resultado indicó...

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Discusión

En este estudio, se obtuvieron protoplastos viables por hidrólisis enzimática. Tenga en cuenta que este método requiere manzanas frescas. El presente protocolo permite el aislamiento rápido de un gran número de protoplastos de pulpa de fruta para su uso en estudios de investigación. La aplicabilidad de este método no se limita a 'Fuji'; los protoplastos de la pulpa de manzana de 'Dounan' y 'Honey Crisp' también se pueden extraer a través del mismo protocolo(Figura suplementaria S4). La solución de protop...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Mejora de Variedades Agrícolas de la Provincia de Shandong (2019LZGC007) y el equipo de innovación de árboles frutales del sistema de tecnología de la industria agrícola moderna de Shandong (SDAIT-06-05).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 veces; solución salina tamponada con fosfatoSolarbioP1022PBS (solución tamponada con fosfato) es una solución tampón de fosfato, que puede proporcionar un entorno iónico relativamente estable y capacidad de amortiguación de pH. Es una solución salina tampón que se utiliza a menudo en biología para la clonación molecular y el cultivo celular. El pH es de 7.4.
Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónicoSolarbioM8010Tampón biológico
CaCl2· 2H2OSolarbioC8370El cloruro de calcio dihidratado es un producto químico blanco o gris, principalmente en forma granular.
Celulasa R-10Yakult HonshaMX7352Degradar las paredes celulares de las plantas.
D-sorbitolSolarbioS8090Tiene buenas propiedades hidratantes, evita la sequedad y evita que el azúcar, la sal, etc. se cristalicen.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 es un poliol surfactante no iónico (peso molecular de aproximadamente 12500 Daltons), que se ha descubierto que es beneficioso para promover la disolución de tintes insolubles en agua y otros materiales en medios fisiológicos.
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA es un sustrato de esterasa permeable en células que puede servir como una sonda de viabilidad que mide tanto la actividad enzimática, que se requiere para activar su fluorescencia, como la integridad de la membrana celular, que se requiere para la retención intracelular de su producto fluorescente.
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201El indicador de calcio fluorescente verde Fluo-4/AM es una versión mejorada del indicador de calcio Fluo-3/AM. El Fluo-4/AM se carga más rápido y es más brillante a la misma concentración. Se puede excitar bien con un láser de iones de argón de 488 nm.
Microscopio de fluorescenciaThermo FisherEVOS Auto 2Observe la imagen de fluorescencia.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351Degrade el tejido vegetal para separar células individuales.
TrisSolarbioT8060Es ampliamente utilizado en la preparación de tampones en experimentos de bioquímica y biología molecular.

Referencias

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