Tinción del Ca2+ citoplasmático con Fluo-4/AM en pulpa de manzana

Resumen

Los protoplastos aislados de células de pulpa de manzana se cargaron con un reactivo fluorescente de calcio para detectar la concentración citoplasmática de Ca^2+.

Resumen

El Ca²⁺ citosólico juega un papel clave en el desarrollo de las plantas. La imagen de calcio es el método más versátil para detectar cambios dinámicos en Ca²⁺ en el citoplasma. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de células pulpares por hidrólisis enzimática. Los protoplastos aislados se incubaron con el reactivo fluorescente de molécula pequeña (Fluo-4/AM) durante 30 min a 37 °C. Las sondas fluorescentes tiñeron con éxito el Ca²⁺ citosólico pero no se acumularon en las vacuolas. La^3+,un bloqueador de los canales de Ca^2+, disminuyó la intensidad de la fluorescencia citoplasmática. Estos resultados sugieren que Fluo-4 / AM se puede utilizar para detectar cambios en ca^{2 +} citosólico en la pulpa de la fruta. En resumen, presentamos un método para aislar eficazmente los protoplastos de las células de la carne de la fruta y detectar Ca^{2+ cargando} un reactivo fluorescente de calcio de molécula pequeña en el citoplasma de las células pulpares.

Introducción

Ca²⁺ juega un papel importante en la transducción de señales y el metabolismo^{de las plantas 1,2}. Además, regula los rasgos de calidad de la fruta^3,4, incluida la dureza, el contenido de azúcar y la susceptibilidad a los trastornos fisiológicos durante el almacenamiento^5,6. El Ca²⁺ citoplasmático juega un papel importante en la transducción de señales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas⁷. La alteración de la homeostasis del calcio cel....

Protocolo

1. Extracción de protoplastos

1. Preparar la solución básica: 20 mM De CaCl₂, 5 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico y 0,4 M de D-sorbitol.
   NOTA: El pH de la solución básica se ajustó a 5,8 con tampón Tris de 0,1 M, se filtró a través de filtros solubles en agua de 0,22 μm y se almacenó a 4 °C.
2. Preparar la solución enzimática: Mezclar 0,3% (p/v) Macerozyme R-10 y 0,5% (p/v) celulasa R-10 con la solución básica.
3. Añadir 0,5 ml de solución enzimática en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Elige una manzana sana y madura. Luego corte la pulpa en 10 x 5 x 1 mm³ tamaño (Figura 1A

Resultados

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos viables de la pulpa (Figura 1). Algunos protoplastos tenían vacuolas, mientras que otros no. Mientras que los protoplastos no exhibieron fluorescencia cuando el indicador fluorescente Ca^{2 +} no se cargó en ellos. Cuando Fluo-4/AM se cargó en los protoplastos, el citoplasma, pero no la vacuola, se volvió fluorescente (Figura 2). Este resultado indicó.......

Discusión

En este estudio, se obtuvieron protoplastos viables por hidrólisis enzimática. Tenga en cuenta que este método requiere manzanas frescas. El presente protocolo permite el aislamiento rápido de un gran número de protoplastos de pulpa de fruta para su uso en estudios de investigación. La aplicabilidad de este método no se limita a 'Fuji'; los protoplastos de la pulpa de manzana de 'Dounan' y 'Honey Crisp' también se pueden extraer a través del mismo protocolo(Figura suplementaria S4). La solución de protop.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 veces; solución salina tamponada con fosfato	Solarbio	P1022	PBS (solución tamponada con fosfato) es una solución tampón de fosfato, que puede proporcionar un entorno iónico relativamente estable y capacidad de amortiguación de pH. Es una solución salina tampón que se utiliza a menudo en biología para la clonación molecular y el cultivo celular. El pH es de 7.4.
Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico	Solarbio	M8010	Tampón biológico
CaCl2· 2H2O	Solarbio	C8370	El cloruro de calcio dihidratado es un producto químico blanco o gris, principalmente en forma granular.
Celulasa R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degradar las paredes celulares de las plantas.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	Tiene buenas propiedades hidratantes, evita la sequedad y evita que el azúcar, la sal, etc. se cristalicen.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 es un poliol surfactante no iónico (peso molecular de aproximadamente 12500 Daltons), que se ha descubierto que es beneficioso para promover la disolución de tintes insolubles en agua y otros materiales en medios fisiológicos.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA es un sustrato de esterasa permeable en células que puede servir como una sonda de viabilidad que mide tanto la actividad enzimática, que se requiere para activar su fluorescencia, como la integridad de la membrana celular, que se requiere para la retención intracelular de su producto fluorescente.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	El indicador de calcio fluorescente verde Fluo-4/AM es una versión mejorada del indicador de calcio Fluo-3/AM. El Fluo-4/AM se carga más rápido y es más brillante a la misma concentración. Se puede excitar bien con un láser de iones de argón de 488 nm.
Microscopio de fluorescencia	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe la imagen de fluorescencia.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade el tejido vegetal para separar células individuales.
Tris	Solarbio	T8060	Es ampliamente utilizado en la preparación de tampones en experimentos de bioquímica y biología molecular.