Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing

Comprender la organización espacial, los patrones de conectividad y la morfología de estructuras biológicas tridimensionales complejas es esencial para delinear las funciones de células y tejidos específicos. Esto es especialmente cierto en neurociencia, en la que se ha dedicado un tremendo esfuerzo a construir mapas neuroanatómicos de alta resolución del sistema nervioso central^1,2. El examen detallado de las neuronas que componen estos mapas arroja morfologías variadas, con conexiones y ubicaciones que reflejan la función de estos diversos conjuntos de neuronas^3,4. Además, la investigación de las estructuras subcelulares, especialmente las espinas dendríticas, puede informar la madurez de las sinapsis, reflejando así los procesos de desarrollo y los estados de enfermedad neurológica^5,6,7. Por lo tanto, los enfoques que mejoran la resolución y el rendimiento de las imágenes son esenciales para comprender mejor la función cerebral en todas las escalas.

Los avances recientes han ampliado el conjunto de herramientas moleculares y genéticas para marcar y manipular poblaciones de neuronas. El desarrollo de nuevos marcadores fluorescentes, combinado con nuevos métodos de introducción de estos marcadores en las neuronas, permite el etiquetado diferencial de poblaciones de neuronas que interactúan dentro de la misma muestra animal o cerebral^8,9,10,11. Debido a que la luz es dispersada por lípidos opacos, y dado el alto contenido de lípidos del tejido cerebral, las poblaciones neuronales de imágenes se han limitado principalmente a secciones delgadas o se han basado en técnicas avanzadas de microescropia (por ejemplo, microscopía confocal, multiprofónica y de lámina de luz) para obtener imágenes de estructuras profundas. Sin embargo, estos esfuerzos se han visto reforzados en gran medida por los avances en las técnicas de limpieza de tejidos. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) es una de esas técnicas, en la que los tejidos de interés se infunden con monómeros de hidrogel (acrilamida y bis-acrilamida) y luego se lavan con detergentes¹². Los monómeros de hidrogel se hibridan para crear un andamio de hidrogel 3D estable que es ópticamente transparente y permeable a las etiquetas de macromoléculas. Los ácidos nucleicos y las proteínas se mantienen dentro de la matriz hibridada, mientras que los lípidos se eliminan mediante los lavados de detergente (Figura 1). Esto da como resultado un tejido estable que es lo suficientemente rígido como para mantener la forma y orientación originales de las células y las moléculas no lipídicas, mientras que ópticamente lo suficientemente transparente como para obtener fácilmente imágenes de estructuras profundas a alta resolución. Este mantenimiento de la estructura y orientación del tejido permite la obtención de imágenes de rodajas gruesas, preservando así las conexiones de célula a célula y las relaciones espaciales. Además, debido a que la ubicación y disponibilidad de proteínas y ácidos nucleicos se mantiene durante el proceso de limpieza, los tejidos despejados pueden contener marcadores basados en la expresión, así como etiquetas exógenas. Por lo tanto, CLARITY se presta como un método potente para obtener imágenes de grandes cantidades de estructuras cerebrales profundas y las conexiones entre estas estructuras a alta resolución.

El uso de CLARITY mejora en gran medida los enfoques para obtener imágenes de poblaciones neuronales. Esta técnica es especialmente experta en generar grandes cantidades de datos de imágenes. CLARITY funciona bien con múltiples formas de fluorescencia a base de proteínas. Este protocolo utiliza un enfoque basado en lentivirales para etiquetar escasamente las células con EGFP y tdTomato; sin embargo, los alelos reporteros transgénicos que expresan tdTomato o EGFP para etiquetar las células para la reconstrucción se han utilizado rutinariamente. Es importante elegir un fluoróforo que sea fotoestablo y brillante (por ejemplo, EGFP o tdTomato). Además, el uso de un promotor fuerte para expresar el fluoróforo produce un contraste y una calidad de imagen superiores. Los inconvenientes de esta técnica surgen ya que analizar adecuadamente esta gran cantidad de datos puede ser laborioso y requiere mucho tiempo. Los microscopios especializados pueden ayudar a mejorar el rendimiento y disminuir la carga de trabajo. Sin embargo, construir, poseer y / u operar microscopios avanzados a menudo son prohibitivos para muchos laboratorios. Este trabajo presenta un método de alto rendimiento, relativamente rápido y simple para visualizar grandes cantidades de tejido neural a alta resolución utilizando la limpieza de tejidos CLARITY de grandes secciones, combinada con microscopía confocal estándar. Este protocolo describe este enfoque a través de los siguientes pasos: 1) diseccionar y preparar el tejido neural, 2) limpiar el tejido, 3) montar el tejido, 4) obtener imágenes de las rebanadas preparadas y 5) procesar imágenes de cortes completos utilizando la reconstrucción y el análisis del software de visualización de microscopía(Figura 2). Estos esfuerzos dan como resultado imágenes de alta resolución que se pueden usar para analizar poblaciones de neuronas, patrones de conexión neuronal, morfología dendrítica 3D, abundancia y morfología de la columna vertebral dendrítica y patrones de expresión molecular dentro del tejido cerebral intacto.

El siguiente protocolo sigue todas las pautas de cuidado animal para Baylor College of Medicine.

1. Disección y preparación de tejidos

1. Eutanasiar al ratón con una sobredosis de isoflurano colocando el ratón en un recipiente cerrado con una toalla empapada en isoflurano (o por otros medios aprobados por la IUCAC).
2. Perfundir al animal transcardialmente utilizando una aguja de 25 G con 10 mL de PBS helado, seguido de 10 mL de PFA al 4%.
3. Diseccionar la región (o tejido) del cerebro de interés.
4. Coloque el tejido disección en PFA al 4% durante la noche a 4 °C. La fijación adecuada es clave para este protocolo. No omita ni acorte este paso.
5. Después de la fijación en PFA al 4% durante al menos 12 h, transfiera el tejido a una mezcla de hidrogel de acrilamida al 4% durante 24 h a 4 °C.
   NOTA: Al descongelar el hidrogel, asegúrese de que no se haya polimerizado, esto puede suceder si el hidrogel se calienta demasiado. Descongelar en hielo para evitar la polimerización prematura.

2. Limpieza de tejidos

1. Coloque el tejido cerebral (aún sumergido en hidrogel) en una incubadora de vacío durante 3 h a 37 °C con un vacío de -90 kPa. Deje la parte superior del tubo desenroscado para permitir que el vacío se forme correctamente.
2. Lave el pañuelo con PBS durante 10 min a temperatura ambiente (25 °C) con un suave agitación.
3. Coloque la muestra de tejido polimerizado en la cámara de electroforesis, anotando la orientación del tejido dentro de la cámara.
4. Llene la cámara y el depósito con el tampón SDS de electroforesis suministrado.
5. Ejecute la muestra a 70 V, 1 A y 35 C, con corriente constante durante aproximadamente 2 h/mm de tejido.
   1. Revise la muestra periódicamente; puede requerir más tiempo en la cámara para despejarse correctamente. Un buen punto de partida para la limpieza es 1-2 h por mm de tejido cerebral. Todo un cerebro de ratón requiere de 8 a 10 h para una limpieza suficiente. Recuerde la orientación de la muestra antes de retirarla de la cámara y asegúrese de volver a reemplazarla en la cámara en la misma orientación.
      NOTA: La Figura 3A muestra cómo se verá un cerebro completamente despejado. El cerebro se verá opaco y no claro en esta etapa debido a la presencia de SDS disuelto, pero debe haber poco o ningún tono de color de tejido amarillo después de la extracción de lípidos.

3. Preparación y montaje del tejido limpiado

1. Después de que la muestra haya terminado de limpiarse y se vea lo suficientemente clara, lávese en PBS durante la noche a temperatura ambiente. Reemplace el PBS con PBS fresco tan a menudo como sea posible. Este paso es fundamental para eliminar las SDS residuales que pueden formar precipitados en pasos posteriores.
2. Después del lavado final en PBS, lave el pañuelo durante 5 minutos en agua desionizada a temperatura ambiente tres veces. El tejido se volverá opaco en este paso y puede expandirse.
3. Incubar el tejido en la solución de coincidencia de índice de refracción (ver Tabla 1)durante al menos 4 h a temperatura ambiente. La Figura 3B muestra un trozo de tejido despejado después de la incubación en una solución de coincidencia de índice de refracción.
4. Durante la incubación del tejido en una solución de coincidencia de índice de refracción, construya una cámara de alojamiento adecuada para obtener imágenes de la muestra si es necesario.
5. Construcción de una cámara de imágenes para pequeñas muestras/rebanadas de tejido
   1. Usando un portaobjetos de vidrio como base para el montaje, coloca espaciadores de goma o plástico y asegura con súper pegamento. Si no hay espaciadores prefabricados disponibles, use anillos de plástico hechos de secciones transversales de tubos cónicos.
   2. Asegúrese de asegurar estas piezas al portaobjetos de vidrio sin orificios (Figura 3C).
   3. Coloque el tejido despejado en la cámara de montaje precargada con una solución de coincidencia de índice de refracción.
   4. Monte el pañuelo de forma segura colocando una cubierta de vidrio en la parte superior y sellándolo con esmalte de uñas.
   5. Imagine este tejido agregando una gota de solución de montaje de coincidencia de índice de refracción directamente sobre el vidrio.
6. Cámara de imágenes de tejido grande
   1. Construya esta cámara si el tejido tiene más de 5 mm de espesor (adecuado para cerebros o hemisferios completos).
   2. Usando un plato de vidrio de 10 cm con una pared alta, coloque un tubo cónico de 50 ml en el centro, asegurándose de que el diámetro de la cónica sea lo suficientemente grande como para aceptar el barril de la lente objetivo utilizada.
   3. Hacer 3% de agarosa en agua y verterla en el espacio entre el plato de vidrio y el tubo cónico, dejar enfriar durante 1 h (Figura 3D). Esto formará un anillo de agarosa sólida(Figura 3E).
   4. Adhiera de forma segura el tejido a la parte inferior de la cámara con súper pegamento y llene la cámara con una solución de coincidencia de índice de refracción. Aplique pegamento para adherir el tejido en una región que no se tomará una imagen para permitir la recuperación del tejido del plato sin dañar las regiones de interés.
      NOTA: Esta preparación es sensible al tiempo, ya que el medio de índice de refracción puede comenzar a polimerizarse a menos que se conserve del aire y se almacene a 4 ° C.

4. Imágenes de muestras de tejido limpiadas

1. Adquiera la imagen utilizando un microscopio confocal ajustado con un objetivo de 25x/0.95 NA con una distancia de trabajo de 4 mm.
2. Encienda todos los equipos de imágenes relevantes. Coloque la muestra en el escenario y coloque una gota de solución de coincidencia de índice de refracción en la parte superior de la cámara de montaje.
3. Aborde cuidadosamente los medios de inmersión con el objetivo y forme una columna continua de medios.
4. Usando epifluorescencia, encuentre un campo de imágenes apropiado.
5. Comience el procedimiento de adquisición de imágenes probando la configuración adecuada.
   1. Comience por establecer la resolución y la velocidad de escaneo utilizando la Figura 4A como guía. Si se obtienen imágenes con un microscopio confocal, cierre completamente el agujero de alfiler para obtener la sección óptica más pequeña y, por lo tanto, la mejor resolución z.
   2. Aumente gradualmente la potencia del láser / ganancia del sensor hasta que se obtenga una imagen adecuada con una alta relación señal-ruido.
   3. Si utiliza imágenes estándar de dos colores EGFP/tdTomato, establezca la configuración de la colección de luz utilizando la Figura 4B como guía.
   4. Establezca los parámetros de la pila z en función de los puntos inicial y final observados del tejido. Establezca el tamaño del paso en función de la resolución z deseada utilizando la Figura 4C como guía.
      NOTA: Los tamaños de paso más pequeños producirán una mayor resolución z, pero también introducirán más tiempo de permanencia del láser, lo que podría conducir al blanqueo de la muestra.
   5. Cuando esté satisfecho con la configuración de adquisición de imágenes, adquiera la imagen.
   6. Asegúrese de que la imagen tenga una alta relación señal-ruido y muestre límites distintos de las estructuras(Figura 4D).

5. Procesamiento de imágenes y cuantificación 3D utilizando software de análisis de microscopía

NOTA: Los paquetes de software de análisis de imágenes microscópicas son herramientas poderosas para la visualización y el procesamiento de imágenes tridimensionales. Muchos de estos programas son perfectamente adecuados para el manejo de grandes conjuntos de datos que se generan a partir de muestras de tejido limpias de imágenes. Los siguientes pasos y cifras asociadas corresponden al flujo de trabajo del software Imaris.

1. Abra la pila de imágenes e impórtela en el software de análisis seleccionado.
2. Vea la imagen en un espacio tridimensional y realice los cambios que desee en las tablas de búsqueda utilizando el ajustador de visualización para visualizar mejor la imagen.
   NOTA: La Figura 5A muestra la posible profundidad extrema de imagen accesible a través de la microscopía de 2 fotones emparejada con la limpieza de tejidos CLARITY. La Figura 5B muestra distintos procesos de dendritas, así como morfologías de la columna vertebral claramente visibles de la pila z presentada en la Figura 5A.
3. Para filtrar cualquier fondo consistente, haga clic en el botón Procesamiento de imágenes y seleccione el filtro de resta de fondo.
   NOTA: La Figura 5C muestra la imagen con una señal de fondo nebulosa consistente antes del procesamiento. La figura 5D muestra la imagen después de aplicar el filtro de resta de fondo.
4. Observa la imagen 3D y familiarízate con ella mirándola desde múltiples ángulos y niveles de zoom.
5. Inicie el seguimiento de dendritas seleccionando primero la herramienta Trazador de filamentos.
6. Haga clic en Editar el filamento manualmente, Omitir la creación automática.
7. Establezca el modo en ruta automática y verifique las correcciones de centro automático y diámetro automático.
8. Mayús + clic derecho en el cuerpo celular para establecer un punto de partida.
9. Trazar la neurona a lo largo de toda la longitud de la dendrita; Haga clic con el botón izquierdo en el extremo de la dendrita para establecer el punto de terminación para permitir que el software calcule automáticamente la ruta entre los puntos de inicio y final.
10. Repita este paso para todas las dendritas y trace completamente la estructura celular.
11. Visualice la celda trazada y confirme su precisión. Realice ajustes manuales según sea necesario.
12. Seleccione la pestaña Creación.
13. Seleccione la opción Recalcular diámetro de dendrita.
14. Siga el asistente hasta completar para obtener una dendrita rastreada con mayor precisión.
15. Seleccione la pestaña Dibujar.
16. Haga clic en el botón de opción Columna vertebral para comenzar a dibujar espinas.
17. Establezca el diámetro aproximado de la columna vertebral según sea necesario y use la herramienta de medición para obtener una representación precisa de los diámetros de la columna vertebral.
18. Haga clic en el centro de las cabezas de la columna vertebral para agregar una nueva columna vertebral.
19. Repita esto para todas las espinas de la dendrita.
    NOTA: Es importante observar la dendrita desde todos los ángulos posibles al agregar espinas manualmente.
20. Verifique la precisión de las espinas recién agregadas y realice los cambios necesarios.
21. Seleccione la pestaña Creación.
22. Seleccione la opción Recalar diámetro de columna vertebral para permitir que el software determine los diámetros adecuados de cabeza y cuello, que son cruciales para el análisis de datos aguas abajo.
23. Siga el asistente de creación del diámetro de la columna vertebral hasta su finalización.
24. Observe el resultado del cálculo y realice los ajustes manuales que sean necesarios. La Figura 5E muestra una neurona completamente trazada completa con espinas.
25. Para crear una lista clasificada de espinas, seleccione la pestaña Herramientas.
    NOTA: La extensión de MATLAB debe estar instalada para que esto funcione.
    1. Para instalar la extensión de MATLAB, abra la ventana de preferencias.
    2. Seleccione la opción Herramientas personalizadas.
    3. Agregue el MCR de tiempo de ejecución de MATLAB adecuado.
26. Haga clic en Clasificar espinas.
27. Edite los parámetros deseados para la clasificación de la columna vertebral.
28. Haga clic en Clasificar espinas en la extensión de MATLAB. La Figura 5F muestra la dendrita superpuesta con espinas clasificadas codificadas por colores.
29. Seleccione la pestaña Estadísticas.
30. Configure las estadísticas deseadas para cuantificar los datos haciendo clic en el botón Configurar en la esquina inferior izquierda de esta pestaña.
31. Una vez elegido el método de representación estadística, exporte los datos utilizando el botón Exportar estadísticas en el botón Mostrar pestaña a archivo ubicado en la parte inferior derecha de esta ventana.
32. Grafique las estadísticas utilizando un método de gráfico preferido.

Después de la adquisición de la imagen, la morfología celular representativa se analizó utilizando estadísticas integradas y clasificando scripts dentro del software de análisis. Los datos recopilados(Figura 6A)reflejan que la neurona 2 tiene una estructura dendrítica más grande con una mayor densidad de espinas. En general, los datos sugieren que la neurona 2 tiene una estructura dendrítica más compleja en comparación con la neurona 1. Para corroborar este resultado, se realizó un análisis estándar de Sholl, que afirma que la neurona 2 es más compleja dendríricamente que la neurona 1 como se denota por el mayor número de intersecciones de Sholl a 50-100 μm del soma(Figura 6B). Finalmente, las espinas dendríticas de las dos neuronas fotografiadas se clasificaron en cuatro categorías principales en función de sus formas y tamaños generales. Las espinas que exhiben formas más parecidas a filopodias son probablemente subtipos de columna vertebral más inmaduros. Las espinas con cabezas definidas, llamadas espinas de hongo, probablemente contienen sinapsis más desarrolladas y maduras7. El análisis presentado aquí muestra que la neurona 1 contiene una mayor proporción de espinas similares a filopodias en comparación con la neurona 2(Figura 6C). Por lo tanto, según la morfología, la neurona 2 es más madura desde el punto de vista del desarrollo, ya que es más grande, más altamente ramificada y contiene una mayor densidad de espinas maduras.

Figura 1: El protocolo CLARITY hace que los tejidos sean transparentes mientras mantiene la estructura inherente y las relaciones espaciales molécula-molécula. (A) Orientación original del tejido neuronal y los componentes intercelulares antes de la limpieza. (B) Los monómeros de hidrogel (líneas púrpuras) se infunden en el tejido y se polimerizan en una malla de hidrogel. El tejido y la malla de hidrogel se reticulan a través de la fijación de formaldehído. (C) El tejido se lava con soluciones de detergente iónico mientras se expone a campos eléctricos. Durante este proceso, las micelas detergentes eliminan las moléculas lipídicas del tejido, dejando atrás una red reticulada de hidrogel transparente y biomoléculas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama de flujo del protocolo, diagramando la preparación del tejido, la limpieza, el montaje, la obtención de imágenes y el procesamiento de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Construcción de cámaras de montaje para muestras de tejido despejado. (A) Limpió todo el cerebro en PBS antes de la inmersión en una solución de coincidencia de índice de refracción. (B) Corte de cerebro en solución de coincidencia de índice de refracción. (C) Cámara de imágenes para muestras de tejido aclarado grandes y pequeñas. Las cámaras se pueden hacer utilizando una variedad de materiales que incluyen, entre otros, plásticos impresos en 3D y tubos cónicos cortados. (D) Cámara de imágenes para imágenes de todo el cerebro o el hemisferio, utilizando un tubo cónico de 50 ml como alivio antes de verter agarosa. (E) Cámara de imágenes de todo el cerebro o del hemisferio con agarosa completamente establecida; esta configuración es óptima para objetivos de inmersión de barril grande. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:Adquirir grandes conjuntos de datos de alta calidad a partir de muestras de tejido limpias. (A) Configuración de adquisición de imágenes utilizada para imágenes de alta resolución de células enteras. El agujero de alfiler estaba completamente cerrado para permitir secciones ópticas finas. La velocidad de escaneo se determinó empíricamente en función de los tiempos óptimos de permanencia de píxeles. (B) Ajustes de la trayectoria de la luz: dependerán del fluoróforo y del equipo utilizado. (C) Configuración de la pila Z; se utilizó un fino paso z para capturar tanta información en la dirección z como fuera posible. (D) Proyección máxima representativa; la barra de escala representa 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis 3D de dendritas en el software de análisis. (A) Vista lateral de una pila z de 600 μm adquirida de dos fotones adquirida a partir de un tejido de 1 mm de espesor que expresa tdTomato; barra de escala representa 100μm. (B) Vista superior de la misma pila z adquirida en el panel A; barra de escala representa 100μm. (C) Imagen adquirida confocal de tejido que expresa EGFP. Los archivos de imagen se pueden importar directamente al software de análisis y prepres procesarse para una mayor calidad de imagen; la barra de escala representa 25 μm. (D) La sustracción de umbral se utiliza para eliminar la señal de fondo consistente presente en C. (E) Rastreo de filamentos e identificación de la columna vertebral: este proceso es mejor cuando se realiza de forma semiautomática con la función de profundidad automática verificada. Las espinas se etiquetaron a mano después de la reconstrucción completa de la dendrita; la barra de escala representa 25 μm. (F) Clasificación de la columna vertebral mediante una extensión matlab integrada. Las espinas han sido codificadas por colores en función de su morfología; las espinas rechonchas son rojas; las espinas de hongos son verdes; las espinas largas y delgadas son azules; los filopodias son de color púrpura; la barra de escala representa 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Resultados representativos. (A) Tabla de mediciones morfológicas comunes generadas automáticamente por el programa de análisis seleccionado. (B) Número de intersecciones de Sholl generadas por las estadísticas del programa. (C) Gráfico circular que representa la distribución de las morfologías de la columna dendrítica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recetas para la solución de coincidencia de imágenes refractivas y la solución de hidrogel. Se enumera la composición de la solución de coincidencia de índice de refracción y el hidrogel.

Los autores no tienen nada que revelar en este momento.