Artículo de método

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 de mayo de 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

Resumen

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Los avances recientes en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y tecnologías de edición de genes permiten el desarrollo de nuevos modelos de enfermedades basadas en células humanas para programas de descubrimiento fenotípico de fármacos (PDD). Aunque estos nuevos dispositivos podrían predecir la seguridad y eficacia de los medicamentos en investigación en humanos con mayor precisión, su desarrollo a la clínica todavía depende en gran medida de los datos de mamíferos, especialmente el uso de modelos de enfermedades de ratón. Paralelamente a los modelos de enfermedades organoides u órganos en chip humanos, el desarrollo de modelos relevantes de ratón in vitro es, por lo tanto, una necesidad insatisfecha para evaluar la eficacia directa de los medicamentos y las comparaciones de seguridad entre especies y las condiciones in vivo e in vitro . Aquí, se describe un ensayo de germinación vascular que utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides (EB). Los EB vascularizados cultivados en gel de colágeno 3D desarrollan nuevos vasos sanguíneos que se expanden, un proceso llamado angiogénesis germinada. Este modelo recapitula las características clave de la angiogénesis germinada in vivo , la formación de vasos sanguíneos a partir de una red vascular preexistente, incluida la selección de células de la punta endotelial, la migración y proliferación de células endoteliales, la guía celular, la formación de tubos y el reclutamiento de células murales. Es susceptible de detección de fármacos y genes que modulan la angiogénesis y muestra similitudes con los ensayos vasculares tridimensionales (3D) recientemente descritos basados en tecnologías iPSC humanas.

Introducción

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En las últimas tres décadas, el descubrimiento de fármacos basado en objetivos (TDD) ha sido ampliamente empleado en el descubrimiento de fármacos por la industria farmacéutica. TDD incorpora un objetivo molecular definido que desempeña un papel importante en una enfermedad y se basa en el desarrollo de sistemas de cultivo celular relativamente simples y lecturas para el cribado de fármacos1. Los modelos de enfermedad más típicos utilizados en los programas TDD incluyen métodos tradicionales de cultivo celular, como células cancerosas o líneas celulares inmortalizadas cultivadas en entornos artificiales y sustratos no fisiológicos. Aunque muchos de estos modelos han proporcionado herramientas viables para identificar candidatos a fármacos exitosos, el uso de tales sistemas puede ser cuestionable debido a su escasa relevancia de la enfermedad2.

Para la mayoría de las enfermedades, los mecanismos subyacentes son de hecho complejos y a menudo se encuentran varios tipos de células, vías de señalización independientes y múltiples conjuntos de genes que contribuyen a un fenotipo específico de la enfermedad. Esto también es cierto para las enfermedades hereditarias donde la causa principal es una mutación en un solo gen. Con el reciente advenimiento de las tecnologías de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y las herramientas de edición de genes, ahora es posible generar organoides 3D y modelos de enfermedades de órgano en chip que podrían recapitular mejor la complejidad humana in vivo 3,4. El desarrollo de tales tecnologías está asociado con un resurgimiento del interés en los programas de descubrimiento fenotípico de fármacos (PDD)1. El PDD se puede comparar con el cribado empírico, ya que no se basan en el conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico o en una hipótesis sobre su papel en la enfermedad. El enfoque PDD es ahora cada vez más reconocido por contribuir fuertemente al descubrimiento de fármacos de primera clase5. Debido a que el desarrollo de las tecnologías de organoides humanos y de órganos en chip aún está en su infancia, se espera que los modelos iPSC (complementados con herramientas innovadoras de imagen y aprendizaje automático6,7) proporcionen, en un futuro próximo, múltiples modelos novedosos de enfermedades complejas basadas en células para la detección de fármacos y programas de PDD asociados para superar la baja productividad del enfoque TDD8, 9.

Si bien los modelos de organoides humanos y órganos en chip pueden proporcionar información importante sobre la complejidad de la enfermedad y la identificación de nuevos fármacos, la incorporación de fármacos a la nueva práctica clínica también depende en gran medida de los datos de modelos animales para evaluar su eficacia y seguridad. Entre ellos, los ratones modificados genéticamente son sin duda los modelos de mamíferos más preferidos. Tienen muchas ventajas, ya que tienen un tiempo de generación relativamente corto para los mamíferos, tienen muchos fenotipos similares a las enfermedades humanas y pueden manipularse genéticamente fácilmente. Por lo tanto, son ampliamente utilizados en programas de descubrimiento de fármacos10. Sin embargo, cerrar la brecha entre ratones y humanos sigue siendo un desafío importante11. El desarrollo de modelos de ratón in vitro equivalentes a los modelos de organoides humanos y de órgano en chip podría llenar al menos parcialmente este vacío, ya que permitirá comparaciones directas de eficacia y seguridad de los medicamentos entre los datos in vivo de ratones y humanos in vitro .

Aquí, se describe un ensayo de germinación vascular en cuerpos embrioides (EB) de ratón. Los vasos sanguíneos están compuestos por células endoteliales (revestimiento interno de las paredes de los vasos), células murales (células del músculo liso vascular y pericitos)12. Este protocolo se basa en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) en EBs vascularizadas utilizando gotitas colgantes que recapitulan la diferenciación de novo de células endoteliales y células murales13,14. Las ESCs de ratón pueden establecerse fácilmente en cultivo a partir de blastocistos de ratón aislados del día 3,5 con diferentes antecedentes genéticos15. También ofrecen posibilidades para el análisis clonal, el rastreo del linaje y pueden ser fácilmente manipulados genéticamente para generar modelos de enfermedades13,16.

Como los vasos sanguíneos nutren todos los órganos, no es sorprendente que muchas enfermedades, si no todas, estén asociadas con cambios en la microvasculatura. En condiciones patológicas, las células endoteliales pueden adoptar un estado activado o pueden volverse disfuncionales, lo que resulta en la muerte de las células murales o la migración lejos de los vasos sanguíneos. Estos pueden resultar en angiogénesis excesiva o en rarefacción de los vasos, pueden inducir un flujo sanguíneo anormal y una barrera de vasos sanguíneos defectuosa que conduce a la extravasación de células inmunes e inflamación12,17,18,19. La investigación para el desarrollo de fármacos moduladores de los vasos sanguíneos es, por lo tanto, alta, y ya se han identificado múltiples actores y conceptos moleculares para la orientación terapéutica. En este contexto, el protocolo descrito es particularmente adecuado para construir modelos de enfermedades y para pruebas de drogas, ya que recapitula las características clave de la angiogénesis germinada in vivo, incluida la selección de células de la punta endotelial y el tallo, la migración y proliferación de células endoteliales, la guía de células endoteliales, la formación de tubos y el reclutamiento de células murales. También muestra similitudes con ensayos vasculares 3D recientemente descritos basados en tecnologías iPSC humanas20.

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Protocolo

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1. Preparación de los medios de comunicación y cultura de mESC

  1. Prepare el medio acondicionado +/- (CM+/-) usando el suplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medio con 10% (vol/vol) de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS), 0.05 mM β-mercaptoetanol, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA 1x), 2 mM L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio.
  2. Preparar medio acondicionado +/+ (CM+/+) usando el suplemento CM+/- medio con factor inhibidor de leucemia (LIF) (1,500 U/mL) y 0.1 mM β-mercaptoetanol.
  3. Preparar medio acondicionado +/+ en presencia de dos inhibidores (CM+/+ 2i) utilizando el suplemento CM+/+ medio con 1 μM PD0325901 y 3 μM CHIR99021.
  4. Prepare una solución de gelatina al 0,1% mezclando 25 ml de solución de gelatina al 2% precalentada en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (DPBS).
  5. Prepare 10x tampón de tripsina versene fosfato (TVP 10x) mezclando tripsina (2,5%) con TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% de suero de pollo, 0,01% de tripsina (2,5%) enH2O) (relación 1:10, vol/vol).
    NOTA: Filtre todas las soluciones a través de un filtro de poros de 0,22 μm. Conservar el medio de cultivo a -20 °C durante un largo plazo y mantener otros reactivos a 4 °C durante un máximo de 3 semanas (ver Tabla de materiales).
  6. Cubrir dos placas de cultivo celular de 12 pocillos con solución de gelatina al 0,1% (500 μL por pocillo) e incubarlas durante 30 min en una incubadora de CO2 (37 °C, 5%CO2, atmósfera húmeda).
  7. Lave las placas recubiertas de gelatina con PBS y agregue 500 μL de CM + / - medio.
  8. Descongele dos viales de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados criopreservados a 1 x 106 a 37 °C y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico con 5 ml de medio CM+/-.
  9. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar el medio y resuspender suavemente el pellet celular en 12 mL de CM+/- medio a una concentración de 1.67 x 105 células por mL.
  10. Sembrar 500 μL de suspensión de MEF en una placa de cultivo celular de 12 pocillos (2,4 x 105 células por cm2) e incubar la placa durante la noche (o/n) en una incubadora deCO2 .
  11. Descongele un vial de mESCs criopreservadas (1 x 106) en medio CM+/+ 2i.
  12. Sembrar la suspensión mESC en una placa prelavada de 12 pocillos con MEFs en 1 mL de medio CM+/+ 2i y transferir la placa a una incubadora deCO2 . Refresque el medio diariamente.
  13. Al 70% de confluencia, lavar las colonias mESC con DPBS. Añadir 150 μL de tampón TVP caliente 10x e incubar a RT durante 30 s para iniciar la disociación enzimática.
  14. Retire con cuidado el tampón TVP, resuspenda las células en 1 ml de medio CM+/+ 2i y disocie las colonias en células individuales mediante un pipeteo suave.
  15. Pasar las células transfiriéndolas a una nueva placa de cultivo celular de 12 pocillos con MEFs (relación de división: 1:3-1:5). Mezclar suavemente para distribuir las células e incubar en una incubadora deCO2 .
  16. Refresque el medio de cultivo (2-3 mL) y observe diariamente el crecimiento/morfología celular. Repita el paso en serie al 70% de confluencia cada 2 días. Cambie al medio CM+/+ durante dos pasajes antes de iniciar la diferenciación celular.

2. Formación de EB en gota colgante

  1. Preparar el medio fresco de diferenciación de mesodermo complementando el medio CM+/- con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (50 ng·mL-1) y con proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) y mantenerlo a 4 °C hasta su uso.
  2. Cubra un pocillo de la placa de cultivo celular de 6 pocillos con 500 μL de solución de gelatina al 0,1% y colóquelo en una incubadora deCO2 durante 30 minutos.
  3. Lave las placas recubiertas de gelatina con PBS y agregue 500 μL de CM + / - medio.
  4. Para obtener una población pura de mESCs, tripsinizar la placa de cultivo celular con tampón TVP 10x durante 30 s en RT, resuspender las células en medio de diferenciación de mesodermo de 1 ml y luego transferirlas a la placa de 6 pocillos recubierta de gelatina durante 30 minutos permitiendo que los MEFs se adhieran mientras los mESCs permanecen en suspensión.
  5. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y cuente las células con un hemocitómetro Neubauer y un colorante azul de Trypan para una exclusión de células vivas / muertas.
  6. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a RT. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en medio de diferenciación del mesodermo para alcanzar 4,55 x 104 células por ml.
  7. Llene el fondo de los platos de poliestireno de baja fijación de 94 mm con 15 ml de agua estéril.
    NOTA: Se necesitarán cuatro platos que contengan gotas colgantes (1.6 x 105 células en 3.52 ml de medio) para probar una condición particular utilizando el ensayo de angiogénesis de brotes 3D.
  8. Transfiera la suspensión celular a un depósito de plástico estéril y cargue cuatro posiciones de una pipeta multicanal con 22 μL de suspensión celular por canal (1 x 103 células por gota de 22 μL).
  9. Levante e invierta la tapa del plato de 94 mm y colóquelo en la superficie limpia del armario de flujo con el lado interior hacia arriba.
  10. Deposite 40 gotas de la suspensión celular en la superficie interna de cada tapa. Invierta cuidadosamente la tapa sin molestias y colóquela de nuevo en el plato, de modo que las gotas miren hacia el agua.
  11. Incubar los platos en una incubadora deCO2 . Considere esto como diferenciación día 0. Mantenga las placas durante 4 días para formar EB.

3. Ensayo de competición para la posición de la celda de la punta

  1. Cultivar una línea mESC fluorescente y una no fluorescente como se describió anteriormente13. Como ejemplo, se utilizan mESCs 7ACS/EYFP etiquetados en amarillo y mESCs R1.
  2. Prepare EB mosaico mezclando cantidades iguales de las dos líneas mESC (relación 1:1) e incube los platos colgantes en una incubadora deCO2 como se describe en el paso 2.

4. Cultivo de EBs flotantes para diferenciación vascular

  1. Antes de recoger los EB de las gotas colgantes, prepare lo siguiente.
    1. Preparar la solución de agar al 5% enH2Oy esterilizarla en autoclave (20 min a 120 °C).
    2. Use la solución tibia de agar al 5% para preparar el medio G-MEM BHK-21 que contiene agar al 1% y vierta rápidamente 3 ml en uno de los platos de poliestireno de 60 mm. Dejar que el agar se solidifique durante 1 h en RT. Conservar los platos a 4 °C hasta su uso.
  2. Preparar medio fresco de diferenciación vascular 2x complementando el medio CM+/- con bFGF (100 ng·mL-1) y VEGF-A (50 ng·mL-1). Conservar el medio a 4 °C hasta su uso.
  3. Recoja las gotas colgantes en un tubo cónico de 15 ml con una pipeta P1000 y retire el sobrenadante después de unos minutos de sedimentación EB.
  4. Resuspender las EB en 3 mL de medio de diferenciación vascular 2x, transferir la suspensión EB a un plato recubierto de agar y distribuir las EB homogéneamente para evitar la agregación.
  5. Incubar los platos en incubadora deCO2 y refrescar el medio cada 2 días hasta el día 9 utilizando 1x medio de diferenciación vascular en presencia de bFGF (50 ng·mL-1) y VEGF-A (25 ng·mL-1).
  6. Alternativamente, agregue el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 el día 4 y 5 ng·mL-1 el día 6 y el día 8) al medio de diferenciación vascular para promover la diferenciación celular mural.

5. Análisis de citometría de flujo

  1. Recoja los EB de 9 días de edad en un tubo cónico de 15 ml con una pipeta P1000 y lávelos una vez con PBS caliente.
  2. Añadir 1 ml de G-MEM BHK-21 medio que contenga 0,2 mg·mL-1 de colagenasa A e incubar las células en una incubadora deCO2 durante 5 min.
  3. Disocie los EB pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000.
  4. Detenga la actividad de la colagenasa agregando 1 ml de medio frío G-MEM BHK-21 con 10% de FBS.
  5. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min en RT.
  6. Resuspender las células en 500 μL de PBS con 2% de FBS.
  7. Contar las células con un hemocitómetro Neubauer.
  8. Resuspender 400.000 células en 100 μL de PBS con 2% de FBS por condición de tinción.
  9. Incubar las células durante 45 min a 4 °C con los siguientes anticuerpos: anticuerpo PECAM-1 anti-ratón de rata conjugado APC (clon MEC13.3) y anticuerpos de control anti-ratón de rata conjugados FITC (clon 30-F11) o anticuerpos de control de isotipo.
  10. Lave las células dos veces con 1 ml de PBS que contenga 2% de FBS.
  11. Resuspender las células para alcanzar una concentración final de 5 x 106 células por ml.
  12. Filtre las células con un tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con una tapa de presión del filtro celular.
  13. Analizar 20.000 eventos PECAM-1 (+) mediante citometría de flujo.

6.3D ensayo de angiogénesis de brotes y tinción de inmunofluorescencia

  1. En el día 9, preparar un medio de germinación añadiendo 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoyetina humana recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleucina-6 humana (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoetanol, NEAA (1x), L-glutamina (1x), piruvato de sodio (1x), colágeno de cola de rata tipo I (1,25 mg·mL-1), y NaOH (3,1 mM) a medio GMEM BHK-1.
  2. Para evitar la gelificación del colágeno, mantenga el medio de germinación en hielo hasta su uso.
  3. Para evaluar el efecto de las moléculas pro/antiangiogénicas, agregue el fármaco o vehículo seleccionado al medio de germinación a la concentración seleccionada.
  4. Recoja EB de 9 días de edad de una placa de agar de 60 mm en un tubo cónico de 15 ml (equivalente a una condición) y retire el sobrenadante después de unos minutos de sedimentación.
  5. Cubrir el fondo de una placa de cultivo de 35 mm con 1 ml del medio de germinación e incubar a 37 °C durante 5 min para inducir la gelificación.
  6. Resuspender los EB en 2 ml de medio de germinación en frío.
  7. Transfiera la suspensión a la placa de cultivo de 35 mm recubierta con la primera capa de medio de brotación.
  8. Distribuya los EB por toda la placa y asegúrese de que estén a la misma distancia entre sí. Incubar el plato en una incubadora deCO2 . La primera formación de brotes ocurre dentro de las 24-48 h.
  9. En el día 12, el gel de colágeno que contiene EB se transfiere cuidadosamente a un portaobjetos de vidrio (75 x 26 mm) utilizando una espátula.
  10. Retire el exceso de líquido con una pipeta (P1000) y deshidrate el gel colocando una gasa de lino de nylon y tarjetas de filtro absorbentes (papel secante de gel) encima del gel. Aplicar presión colocando un peso (250 g) durante 2 min. Retire con cuidado los papeles de nylon/filtro y deje que las guías se sequen al aire durante 30 minutos en RT.
  11. Lave las diapositivas tres veces con PBS durante 5 minutos en RT.
  12. Fijar los EB con solución de zinc (ver Tabla de materiales) o/n a 4 °C. Alternativamente, fijar los EB fluorescentes en mosaico con paraformaldehído (PFA) (4%) o/n a 4 °C en la oscuridad.
  13. Retire el fijador. Lave las diapositivas cinco veces con PBS durante 5 minutos en RT.
  14. Permeabilizar los EBs en PBS que contienen 0,1% Triton-X100 durante 15 min a RT.
  15. Retire la solución de permeabilización. Lave las diapositivas cinco veces con PBS durante 5 minutos.
  16. Incubar los EB en el tampón de bloqueo (PBS con albúmina sérica bovina al 2%, BSA) durante 1 h a RT.
  17. Para teñir los brotes endoteliales, utilice un anticuerpo primario anti-PECAM-1 anti-ratón de rata (dilución 1:100) para bloquear el tampón o/n a 4 °C.
  18. Lave las diapositivas cinco veces con PBS durante 5 minutos.
  19. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario Alexa 555 anti-rata de cabra en tampón de bloqueo (dilución 1:250) y, cuando sea necesario, con el anticuerpo anti-α-SMA conjugado con FITC en tampón de bloqueo (dilución 1:250) para teñir las células murales durante 2 h a RT en la oscuridad.
  20. Lave las diapositivas tres veces con PBS durante 5 minutos y una vez con H20 antes de montarlas.

7. Análisis confocal de imágenes, morfométrico y cuantitativo de brotes endoteliales de EB

  1. Adquiera imágenes de alta resolución de los EB inmunoteñidos mediante la fusión del plano focal (apilamiento z) utilizando un microscopio confocal. Utilice un objetivo de ampliación de 10x para obtener imágenes de EB completos.
  2. Analizar las imágenes adquiridas utilizando ImageJ para evaluar la morfología y cuantificar las características de los brotes endoteliales PECAM-1 positivos según los métodos de cuantificación establecidos13,14,21.
    1. Calcule el número medio de brotes endoteliales por EB contando manualmente el número total de brotes por EB individuales.
    2. Mida las longitudes de los brotes individuales con la herramienta de dibujo ImageJ. Defina la base del brote endotelial comenzando en el área central de EB y dibuje manualmente una línea hasta el final de la punta del brote.
    3. Calcule el número medio de células de punta por brote contando manualmente el número de células de punta por brote individual y luego calcule la media por EB.
    4. Calcule la orientación de los filopodios determinando manualmente el eje del brote padre y mida el ángulo agudo entre ellos utilizando la herramienta de ángulo del software ImageJ. Calcule el número de brotes con una orientación >50° y divídalo por el número total de brotes del EB de interés.
      NOTA: Los ángulos siempre oscilaron entre 0° y 90°.
  3. Adquiera imágenes de alta resolución de los EB inmunoteñidos utilizando un microscopio confocal. Utilice un objetivo de aumento de 40x para obtener imágenes de alta resolución de brotes endoteliales individuales.
  4. Cuantifique la cobertura del recipiente de brotes EC positivos para PECAM-1 rodeados de MC positivos para α-SMA utilizando el software ImageJ.
    1. Divida las imágenes combinadas en canales rojos y verdes separados.
    2. Convierta las imágenes en su forma binaria.
    3. Mida el área celular total del brote ocupada por separado por PECAM-1 (células endoteliales marcadas en rojo) y por células positivas α-SMA (células murales marcadas en verde).
    4. Genere la imagen combinada utilizando la función de calculadora de imágenes y el operador AND. Mida el área celular total de la imagen. Para calcular la cobertura, divida el área de la imagen colocalizada por el área de la imagen binaria PECAM-1.
  5. Para analizar la competencia celular por la posición de las células de punta endotelial / tallo de los brotes desarrollados por EB en mosaico, puntúe manualmente el número de células de punta y marque su origen genotípico en función de la señal de fluorescencia. Calcular los valores medios por EB.

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Resultados

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La descripción general del protocolo del ensayo de germinación de vasos sanguíneos se muestra en la Figura 1. Los EB de nueve días de edad derivados de tres líneas independientes 129/Ola mESC (Z/Red, R1 y E14) se disociaron enzimáticamente en células individuales utilizando colagenasa A. Las células se tiñeron para PECAM-1 y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) como se describe. Todas las líneas celulares exhibieron una diferenciación endotelial robu...

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Discusión

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Este protocolo describe un ensayo de germinación vascular basado en EB 3D imparcial, robusto y reproducible que es susceptible de detección de fármacos y genes que modulan la angiogénesis. Este método ofrece ventajas sobre muchos ensayos bidimensionales (2D) ampliamente utilizados que utilizan cultivos de células endoteliales como las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) para monitorear la migración (ensayo de rasguño lateral o el ensayo de cámara de Boyden)22,23 o proliferación (recuento de número d...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, y por la Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-mercaptoetanolMilipore, Merck805740Riesgo biológico: se deben seguir las instrucciones de seguridad adecuadas al manipular
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 cabra anti ratas IgGLife technologiesA21434
APC anticuerpo conjugado anti-ratón PECAM-1 (clon MEC13.3)BD Biosciences551262
Rata APC IgG2a y kappa; Control de isotipo (clon  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 microscopio de cultivo de tejidos con contraste de fase invertidaZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Cabina de bioseguridad BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9418
Cámara de recuento de células, Buerker, 0,100 mmMarienfeld640211
Placas de cultivo celular 60 x 15 mmCorning353802
Placas de cultivo celular, 35 x 10 mmCorning353801
Placas de cultivo celular de 12 pocillosCorning3512
CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo realBiorad1855196
Suero de polloSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Colágeno I, Alta Concentración, Cola de Rata, 100 mgCorning354249
Colagenasa Escaneo
Microscopio, TCS SP5Leica
Cubertades de vidrio, 24 × 50 mmVwr631-0146
DAPT γ? inhibidor de la secretasaSigma AldrichD5942
DC101 anti ratón VEGFR-2 ClonBioXcellBP0060
DC101 isotipo rata IgG1BioXcellBP0290
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: se deben seguir las instrucciones de seguridad adecuadas al manipular
DPBS (10x), sin calcio, sin magnesioGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Célula madre embrionaria Suero fetal bovinoGibco, Thermofisher scientific16141-079Debe someterse a pruebas en lotes para obtener la máxima viabilidad y crecimiento de las células madre embrionarias. Inactivación de calor a 60 ° C; C y almacenar en &menos; 20 ° C hasta 1 año
Microcentrífuga Eppendorf 5415REppendorf AG 
Eritropoyetina humana (hEPO), 250 U (2,5 y micro; g) (1 mL)Proteína
ESGRO (10 unidades    1 mL)Milipore, MerckESG1107
Tubos Falcon 15 mLGreiner Bio-One188271
Tubos Falcon 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Punta de filtro, transparente, estéril F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Punta de filtro, transparente, estéril F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Punta de filtro, transparente, estéril F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC conjugado anti-& alfa; Actina de músculo liso (SMA) (clon 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC rata conjugada anti-ratón CD45 (clon 30-F11)Biolegend103107
FITC Rata IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticuerpo (clon RTK4530)Biolegend400605
Medios de montaje fluorescentesDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gasa Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Papel secante en gel, grado GB003WhatmanWHA10547922
Solución de gelatina, tipo BSigma-AldrichG1393-100 ml
MEM de Glasgow (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Fijador de zincBD Pharmigen550523
IncuSafe Incubadora de CO2PHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleucina-6, humano (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamina 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Caja de portaobjetos para microscopioKartell Labware278
Portaobjetos de microscopio, StarfrostKnittel vidrioVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagen
Mm_Gapdh_3_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG Primer QuantiTectQiagen QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG Ensayo de cebador QuantiTectQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG Primer QuantiTectQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Mouse (ICR) Fibroblastos embrionarios inactivados  (2 M)Gibco, Thermofisher scientificA24903Almacene viales en nitrógeno líquido (195.79 ° C) Línea indefinida
células madre embrionarias de ratón 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033generada por el Dr. A Nagy, Instituto de Investigación Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canadá. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mecanismos del desarrollo. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
Líneas de células madre embrionarias de ratón Acvrl1 +/- y Acvrl1 +/+Generadas en el Centro Médico de la Universidad de Leiden [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
Células madre embrionarias de ratón línea E14Proporcionada por el laboratorio M Letarte y generada según Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
Línea de células madre embrionarias de ratón R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Generada por el Dr. A Nagy, Instituto de Investigación Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canadá. [Nagy, A., et al. Procediings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424– 8428 (1993)].
Células madre embrionarias de ratón línea Z/Red (cepa 129/Ola)Generadas por el Dr. A Nagy, Instituto de Investigación Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canadá [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
Espectrofotómetro NanoDrop 1000 UV/VISThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, Recombinante HumanoPeprotech100-14B
Anticuerpo Pecam-1, Rata Anti-RatónBD Biosciences550274
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific
Placa de Petri, PS, 94/16 mm, estándar, con rejillas de ventilación,estéril Greiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multicanal P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Kit de Pipetas, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
Recombinante Humano BMP-4 ProteínaR& D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Pipetas serológicas, 10 mLGreiner Bio-One607 180
Pipetas serológicas, 25 mLGreiner Bio-One760 180
Pipetas serológicas, 5 mLGreiner Bio-One606 180
Hidróxido de sodio (NaOH)Merck106498
Piruvato de sodio 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Tubos de ensayo de 5 ml de fondo redondo con tapón de filtro de celdasCorning352235
Termociclador, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Solución azul de tripano, 0,4%Gibco, Thermofisher scientific
Tripsina (2,5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
Sistema de Filtro de Vacío/Botella de Almacenamiento, 500 mLCorning430758
VEGFA165 , murino recombinantePeprotech450-32
Agua, EstérilFresenius-KabiB230531
Baño de agua, Lab-Line DigitalTermo Fischer Scientific18052A
Centrífuga de sobremesa láser confocal de Roche 10103586001 Z605212 LIF recombinante de ratón Roche 11120166001 QT00099064 de 1514012215250061

Referencias

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