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Immunology and Infection

Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

Haemophilus influenzae induce infiammazione delle vie respiratorie. Questo articolo si concentrerà sull'uso della citometria a flusso e della microscopia confocale per definire le risposte immunitarie dei fagociti e dei linfociti in risposta a questo batterio.

Abstract

Haemophilus influenzae (Hi) è un batterio prevalente trovato in una serie di condizioni respiratorie. Una varietà di diversi saggi / tecniche possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria / infiammatoria respiratoria a questo batterio. La citometria a flusso e la microscopia confocale sono tecnologie basate sulla fluorescenza che consentono la caratterizzazione dettagliata delle risposte biologiche. Possono essere utilizzate diverse forme di antigene Hi, inclusi componenti della parete cellulare, preparati uccisi / inattivati e batteri vivi. Hi è un batterio fastidioso che richiede mezzi arricchiti, ma è generalmente facile da coltivare in ambienti di laboratorio standard. I campioni di tessuto per la stimolazione con Hi possono essere ottenuti da sangue periferico, broncoscopia o polmone resecato, ad esempio, in pazienti sottoposti a intervento chirurgico per il trattamento del cancro del polmone). La funzione dei macrofagi e dei neutrofili può essere valutata in modo completo utilizzando la citometria a flusso con una varietà di parametri misurati, tra cui la fagocitosi, le specie reattive dell'ossigeno e la produzione di citochine intracellulari. La funzione dei linfociti (ad esempio, la funzione delle cellule T e delle cellule NK) può essere valutata specificamente utilizzando la citometria a flusso, principalmente per la produzione di citochine intracellulari. L'infezione da Hi è un potente induttore della produzione di trappole extracellulari, sia da parte dei neutrofili (NET) che dei macrofagi (MET). La microscopia confocale è probabilmente il modo più ottimale per valutare l'espressione di NET e MET, che può anche essere utilizzata per valutare l'attività della proteasi. L'immunità polmonare all'Haemophilus influenzae può essere valutata mediante citometria a flusso e microscopia confocale.

Introduction

Haemophilus influenzae (Hi) è un normale batterio commensale presente nella faringe della maggior parte degli adulti sani. Hi può avere una capsula polisaccaridica (tipi A-F, ad esempio, tipo B o HiB) o mancare di una capsula ed essere non tipizzabile (NTHi)1. La colonizzazione della mucosa con questo batterio inizia nella prima infanzia e c'è un turnover di diversi ceppi colonizzatori2. Questo batterio è anche in grado di invadere sia il tratto respiratorio superiore che inferiore; In questo contesto, può indurre l'attivazione della risposta immunitaria e l'infiammazione 3,4. Questa risposta infiammatoria può causare malattie cliniche e contribuire a una varietà di importanti condizioni respiratorie, tra cui sinusite, otite media, bronchite, fibrosi cistica, polmonite e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La maggior parte di queste condizioni sono dovute ai ceppi NTHi2. Questo articolo descriverà i metodi per valutare le risposte immunitarie respiratorie all'Hi utilizzando la citometria a flusso e la microscopia confocale.

I metodi descritti di seguito sono stati adattati da tecniche consolidate che sono state modificate per valutare la risposta infiammatoria all'Hi. La selezione di una forma antigenica appropriata di Hi è una parte fondamentale di questa valutazione. I preparati antigenici vanno dai componenti della parete cellulare ai batteri vivi. Per stabilire e standardizzare i saggi, l'uso di campioni di sangue periferico può essere molto utile inizialmente.

La citometria a flusso consente la misurazione di una varietà di parametri e saggi funzionali da un campione a livello cellulare. Questa tecnica ha il vantaggio che specifiche risposte cellulari (ad esempio, produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) o produzione di citochine intracellulari) possono essere valutate rispetto ad altri metodi più generali come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o ELISspot.

Le trappole extracellulari sono espresse dai neutrofili (NET)5,6,7 e da altre cellule come i macrofagi (MET)8. Sono sempre più riconosciuti come una risposta infiammatoria chiave, in particolare nell'infezione polmonare9. Possono essere valutati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Questa tecnica consente l'identificazione definitiva dei NET/MET e distingue la loro espressione da altre forme di morte cellulare6.

Sia la citometria a flusso che la microscopia confocale sono saggi basati sulla fluorescenza. Il loro successo dipende da protocolli di filtraggio ottimali di campioni biologici. Questi metodi richiedono del tempo per essere appresi e richiedono un'adeguata esperienza di supervisione. Gli strumenti coinvolti sono anche costosi sia da acquistare che da gestire. L'impostazione ottimale per il loro utilizzo include le principali università e gli ospedali di riferimento terziari.

I metodi utilizzati in questo protocollo sono trasferibili per lo studio di altri organismi simili coinvolti nelle malattie respiratorie (ad esempio, Moxarella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae). NTHi interagisce anche con altri comuni batteri respiratori10.

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Protocol

Questo lavoro è stato approvato dal comitato etico di ricerca umana di Monash Health. Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana.

1. Preparazione antigenica

NOTA: Tre diversi preparati antigenici possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria a Hi. Questi sono 1) un componente subcellulare (tipicamente dalla parete cellulare batterica); 2) batteri uccisi e inattivati; e 3) batteri vivi. Determinare l'uso di ciascuna preparazione antigenica prima dell'inizio di qualsiasi esperimento.

  1. Componenti subcellulari
    1. Ottenere componenti subcellulari da fonti, inclusi preparati commerciali, componenti sviluppati internamente e / o da altri ricercatori.
      NOTA: Possono essere utilizzati componenti subcellulari di solito dalla parete cellulare batterica e includono proteine della membrana esterna come P6 e lipooligosaccaride (LOS)11,12. Questi componenti subcellulari sono solitamente derivati in centri specializzati. La descrizione di come sono fatti va oltre lo scopo di questo articolo. Si raccomanda il contatto diretto con esperti in questo campo per ottenere questi componenti.
  2. Batteri uccisi/inattivati
    1. Ottenere i batteri dal campione appropriato (ad esempio, espettorato o broncoscopia). Confermare il ceppo come H. influenzae utilizzando un laboratorio di microbiologia appropriato. Eseguire la tipizzazione dei campioni di H. influenzae per confermare che non sono tipizzabili (da un laboratorio di microbiologia specializzato).
    2. Per ottenere un antigene rappresentativo, utilizzare più ceppi NTHi (almeno 5, ciascuno approssimativamente della stessa quantità) per creare un antigene aggregato. Conservare i ceppi a -70 °C in brodo di glicerolo in provette da microcentrifuga.
      NOTA: In questo esperimento sono stati utilizzati dieci ceppi distinti.
    3. Scongelare i ceppi (un tubo di microcentrifuga alla volta) su piastre di agar di cioccolato e crescere durante la notte in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2. Aggiungere i batteri a 500 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e lavarli due volte (centrifugare a 300 x g per 5 minuti). Utilizzare uno standard MacFarland 10 o uno spettrofotometro13 per aliquote NTHi ad una concentrazione di10 8 mL (utilizzando un contenitore da 5 mL o equivalente).
    4. Riscaldare inattivare i batteri mettendoli a bagnomaria ad una temperatura di 56 °C per 10 min.
    5. Sonicare i batteri utilizzando un'impostazione di sonicazione continua a una velocità medio-bassa per 30 s.
    6. Aliquota del volume appropriato di campioni in provette da microcentrifuga. Per un campione di 108 ml, utilizzare aliquote da 50 μL (cioè 20 campioni per ml), congelarli a -70 °C fino a quando nonè necessario 14.
  3. Batteri vivi
    1. In primo luogo, caratterizzare i batteri vivi come menzionato nel passaggio 1.2.1. Utilizzare una varietà ben caratterizzata. Assicurarsi che il ceppo sia conservato anche nel brodo di glicerolo a -70 °C come riserva.
    2. Coltiva i batteri su supporti arricchiti come piatti di agar al cioccolato o in brodo.
      1. Per utilizzare piastre di agar al cioccolato, distribuire i batteri per un minimo di ogni 3-4 giorni con spargitori sterili.
      2. In alternativa, utilizzare il brodo Brain Heart Infusion (BHI) arricchito con fattori X (esina) e V (β-nicotinammide adenina dinucleotide) per far crescere i batteri. Inoculare NTHi da piastre notturne in 5-10 ml di brodo BHI integrato con emina e β-nicotinammide adenina dinucleotide (entrambi 10 μg/ml) e coltura per una notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
        NOTA: Questo ha il vantaggio della riproducibilità, di un numero più elevato di unità formanti colonie (CFU) e di tutti i batteri che si trovano in una fase simile di crescita del tronco (sulle piastre, la vitalità batterica può essere maggiore a seconda della posizione nella coltura)13,15.
    3. Utilizzare una molteplicità di infezioni (MOI) di 100 batteri in una cellula per suscitare una forte risposta immunitaria mantenendo la vitalità cellulare. Utilizzare MacFarland Standard10 o spettrofotometro13 per valutare il numero di batteri.
    4. Assicurarsi che i supporti utilizzati per i test NTHi dal vivo siano privi di siero umano, poiché ciò ucciderebbe i batteri16. I campioni di siero animale (ad es. siero fetale per vitello) generalmente non causano alcun problema.
      NOTA: Utilizzare i metodi descritti di seguito per analizzare campioni di tessuto standard come sangue periferico, campioni di broncoscopia (in particolare lavaggio broncoalveolare (BAL)) e tessuto polmonare resecato. Incubare i campioni con l'antigene Hi da 10 minuti a 24 ore o più.

2. Valutazione della funzione fagocitaria mediante citometria a flusso

NOTA: Questo test richiede cellule in soluzione e viene tipicamente eseguito nel sangue intero o utilizzando il liquido BAL. Questo test è modificato da un protocollo precedentemente pubblicato basato sull'uso di preparato inattivato di Staphylococcus aureus e Pansorbin17. Il sangue intero inattivato e l'H. influenzae fisso sono sostituiti dal Pansorbin17.

  1. Mescolare NTHi ucciso, inattivato (1.2) con ioduro di propidio (PI) a 100 μg/ml in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in rapporto 1:1 per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti, quindi lavare in 500 μL di PBS. Girare verso il basso a 450 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 500 μL di PBS.
  2. Incubare 450 μL di sangue periferico (dalla venepuntura di un soggetto umano) con 50 μL di PI inattivato marcato con H. influenzae per 20 minuti a bagnomaria a 37 °C in un tubo da 5 ml.
  3. Rimuovere i campioni dal bagnomaria e aggiungere 5 μL di diidrorodamina-1,2,3 (DHR). Vortice per 10 s, quindi rimetterlo a bagnomaria per altri 10 minuti.
  4. Rimuovere i campioni dal bagnomaria e lisare gli eritrociti (500 μL di volume come elencato sopra al punto 2.2) con una soluzione 10:1 (cioè 5 ml) di cloruro di ammonio allo 0,8% (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 e 0,1 mM EDTA).
    NOTA: in alternativa, è possibile utilizzare un sistema automatizzato come Q-prep.
  5. Analizzare i campioni su un citometro a flusso entro un'ora. Analizzare un minimo di 3.000-5.000 celle (da ogni sottoinsieme di interesse) da ciascun campione per ottenere risultati rappresentativi (Figura 1).
    1. Per analizzare i campioni per la fagocitosi, determinare la proporzione di cellule che hanno ingerito batteri marcati (misurare la proporzione di cellule con la colorazione fluorescente).
    2. Quantificare il ROS mediante l'ossidazione del DHR, che si traduce in un segnale fluorescente (lo spostamento della fluorescenza mediana viene confrontato tra campioni basali e stimolati).
      NOTA: I neutrofili sono più granulari e hanno più dispersione laterale, mentre i macrofagi sono più grandi e hanno più dispersione in avanti.
    3. Distinguere i neutrofili e i macrofagi morfologicamente l'uno dall'altro per le loro dimensioni (i macrofagi sono più grandi) e granularità (i neutrofili sono più granulari).
      NOTA: I marcatori specifici per neutrofili e macrofagi non sono generalmente utilizzati, sebbene CD14 possa essere utilizzato per etichettare i monociti del sangue. La citometria a flusso può potenzialmente essere utilizzata per distinguere tra diverse forme funzionali di monociti e macrofagi (ad esempio, sottogruppi M1 e M2)18.
  6. Modificare il test come appropriato (ad esempio, utilizzare NTHi vivo non etichettato per stimolare i fagociti e misurare l'espressione di ROS mediante scissione DHR).
    1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico mediante centrifugazione a gradiente di densità. Sovrapporre il sangue sul polimero designato per la centrifugazione del gradiente di densità e centrifugare a 2300 x g per 30 minuti. Rimuovere lo strato mononucleare usando una pipetta, lavarlo due volte con PBS e risospendere le cellule in PBS a 106 cellule per ml.
    2. In alternativa, utilizzare i macrofagi BAL.
    3. Sospendere i monociti/macrofagi ad una concentrazione di 106 cellule /ml nel terreno di coltura (RPMI). Infettarli con NTHi vivo a un MOI di 100:1 per 1 ora come descritto nel passaggio 1.3.
    4. Aggiungere DHR alla sospensione come descritto al punto 2.3 per 10 minuti. Eseguire l'analisi per ROS utilizzando la citometria a flusso.

3. Valutazione della funzione dei linfociti nel sangue periferico

  1. Utilizzare preparazioni di sangue intero o cellule mononucleate per saggi di citometria a flusso14.
  2. Acquisire campioni da ciascun soggetto mediante venepuntura. Raccogliere 4 ml di sangue da una vena periferica in un tubo di eparina di litio e dividere i campioni in aliquote per il controllo e la stimolazione dell'antigene.
  3. Aggiungere anticorpi costimolatori (anti-CD28 e CD49d, 1 μL/ml) a entrambi i campioni. Aggiungere NTHi al campione di antigene e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 1 ora. Per la preparazione NTHi uccisa, aggiungere 200 μL dell'antigene a 2 mL di sangue. Per NTHi vivo, aggiungere cellule NTHi vive con un MOI di 100:1 ai globuli bianchi (misurato dall'emocitometro).
  4. Aggiungere l'agente bloccante del Golgi Brefeldin A (10 μL/ml) ai campioni e incubarli per altre 5 ore.
    NOTA: Il blocco dell'apparato di Golgi impedisce che le citochine vengano esportate al di fuori della cellula.
  5. Se si utilizza sangue intero, lisare gli eritrociti con cloruro di ammonio allo 0,8% (fase 2.4) per lasciare solo i leucociti in soluzione. Fissare i leucociti usando 500 μL di paraformaldeide all'1%-2% per 1 ora.
  6. Contare le cellule mediante emocitometro, permeabilizzare 106 cellule con 100 μL di saponina allo 0,1% per 15 minuti e incubare le cellule con anticorpi marcati con fluorescenza. Lavare le cellule e analizzarle utilizzando un citometro a flusso.
    NOTA: La quantità di anticorpi marcati con fluorescenza sarà specifica per ciascuna citochina. Seguire le istruzioni del produttore. Tipicamente, 106 cellule in 100 μL di soluzione saranno colorate per 1 ora. La maggior parte degli anticorpi ottenuti commercialmente sarà sufficiente per eseguire 25-100 test.
  7. Determinare la proporzione di cellule che rispondono all'antigene effettuando il gating della popolazione linfocitaria rilevante (le cellule sono attivate da CD45, poi da CD3 e successivamente dall'espressione di CD4 o CD8) come mostrato in Figura 2. Eseguire la colorazione di fondo su cellule non stimolate per tutte le citochine da analizzare. Screening di 100.000 cellule per analizzare ogni citochina sia per le cellule stimolate che per il controllo.

4. Valutazione della funzione linfocitaria/mediatori infiammatori nel tessuto polmonare

  1. Di solito non è possibile ottenere abbastanza linfociti dalla broncoscopia; Pertanto, utilizzare il tessuto polmonare da campioni di lobectomia. L'ottimizzazione dei campioni di tessuto polmonare richiede uno stretto collegamento con il servizio di anatomia patologica. Assicurarsi che il tessuto abbia un margine di almeno 3 cm dal tumore e sia il tessuto cellulare senza enfisema significativo (come determinato dal patologo).
  2. Rompere il tessuto polmonare in una sospensione cellulare prima che possa essere utilizzato per i saggi di citometria a flusso. Digerire il tessuto polmonare chimicamente (ad esempio, con collagenasi) o disaggregarlo meccanicamente.
    NOTA: La disaggregazione meccanica del tessuto può essere preferita in quanto è associata a una migliore colorazione superficiale delle cellule (ad esempio, etichettatura CD3/4)19.
    1. Ottenere campioni di lobectomia da un patologo (di solito ottenuti da pazienti sottoposti a trattamento del cancro del polmone). Tagliare circa 20-40 g del campione in 3-5 mm3 sezioni. Posizionarli all'interno di una camera sterile da 50 μL prima di essere frammentati meccanicamente utilizzando un apposito disaggregatore.
    2. Dopo la disaggregazione tissutale, lisare i globuli rossi con lo 0,8% di NH 4 Cl come indicato nella fase2.4.
    3. Risospendere le cellule in RPMI sterile (il volume dipenderà dal numero di celle e generalmente è di 10-20 ml), quindi filtrarle attraverso una rete sterile di nylon da 100 μm. Contare il numero di cellule vitali usando il metodo di esclusione del blu tripano.
  3. Saggio dell'infezione NTHi
    1. Risospendere le cellule polmonari ad una concentrazione cellulare finale di 4 x 106 cellule/ml per provetta (campioni di controllo e stimolati).
    2. Utilizzare una sospensione di 4 x 10 6-6 x 106 celle in 1 mL di RPMI per il tubo di controllo (negativo). Utilizzare la stessa quantità per la provetta NTHi (qualsiasi campione aggiuntivo può essere utilizzato come controllo positivo con SEB). Infettare le cellule nel tubo NTHi con un MOI di 100 batteri per cellula. Allentare il tappo di mezza rotazione per consentire il trasferimento del gas nei tubi.
    3. Posizionare le celle in un rotatore a tubo e incubarle a 37 °C ruotando a 12 giri/min.
    4. Per prevenire l'esportazione extracellulare di citochine, aggiungere un bloccante del Golgi (Brefeldin A) alle sospensioni cellulari 1 ora dopo la stimolazione ad una concentrazione finale di 10 μg/ml. Riportare le sospensioni cellulari per un'ulteriore incubazione di 16-22 ore a rotazione (fase 4.3.3).
    5. Lavare la sospensione cellulare con 500 μL di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,01% di NaN3. Fissare e permeabilizzare le cellule come descritto rispettivamente al punto 3.5 e al punto 3.6.
    6. Aggiungere gli anticorpi per la colorazione intracellulare delle citochine (la scelta degli anticorpi deve essere determinata dallo sperimentatore, come elencato nella NOTA al punto 3.6). Colorare la sospensione cellulare per specifici marcatori della superficie cellulare dei linfociti umani (ad esempio, CD45, CD3, ecc.) per 1 ora. Lavare le cellule con PBS, fissarle e permeabilizzarle come descritto nei passaggi 3.5-3.6.
    7. Incubare le cellule con anticorpi intracellulari anti-colorazione delle citochine (ad esempio, IFN-γ e TNF-α o IL-13 e IL-17A) per 1 ora.
      NOTA: Si raccomanda di colorare prima i marcatori superficiali, poi intracellulare poiché la fissazione può causare cambiamenti conformazionali nelle proteine di superficie a cui si legano gli anticorpi.
    8. Lavare le cellule con 500 μL di PBS e risospendere in 100 μL di PBS prima dell'acquisizione dei dati su un citometro a flusso.
  4. Un test bead array può essere utilizzato in combinazione per analizzare il surnatante descritto al punto 3.2 (Eseguire questa operazione senza Brefeldin A). Ciò consente l'analisi di un'ampia varietà di diversi mediatori infiammatori (potenzialmente fino a 40-50 mediatori). Raccogliere il surnatante in aliquote da 100 μL e conservarlo a -70 °C fino al momento dell'analisi. In alternativa, si possono utilizzare saggi chemiluminescenti multiplex20.
    1. Utilizzare matrici di perline multiplex per analizzare i campioni scongelati. Utilizzare il surnatante immagazzinato per analizzare la produzione di citochine seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire l'acquisizione del multiplex bead array su un citometro a flusso. Utilizzare il software pertinente per eseguire l'analisi dei dati a valle.
      NOTA: Questo test bead array può essere eseguito anche su supernatante da campioni di sangue periferico e/o BAL.

5. Valutazione della proteolisi polmonare mediante microscopia confocale

NOTA: La microscopia confocale fluorescente è complementare alla citometria a flusso e può essere utilizzata per valutare le risposte infiammatorie della proteasi e dei ROS. Le trappole extracellulari come NET e MET sono composte da cromatina extracellulare (DNA) con altri mediatori infiammatori, in particolare proteasi come l'elastasi neutrofila (NE) e le metalloproteinasi della matrice (MMP). Possono essere valutati nel BAL e nel tessuto polmonare utilizzando la microscopia confocale, e questo è stato descritto in precedenza da Sharma, R. et al.21.

  1. Valutare l'espressione diretta della proteasi nel tessuto polmonare (come descritto al punto 4.2.1) utilizzando la microscopia confocale e la zimografia in situ 15,17.
    1. Utilizzare tessuto polmonare non fisso fresco o congelato. Montare le sezioni tagliate ad uno spessore di 4 μm su vetrini superfrost/adesione. Preriscaldare le sezioni in 1x tampone di reazione per 5 minuti.
    2. Aggiungere substrato di gelatina marcato con fluoresceina (30 μg/mL per sezione) direttamente sui singoli vetrini per misurare la proteolisi tramite l'azione delle metalloproteinasi.
    3. Posizionare i vetrini in posizione orizzontale e incubare in una camera umidificata al riparo dalla luce a 37 °C per 1 ora.
    4. Risciacquare le sezioni in 1x buffer di reazione prima di essere montate.
    5. Come controllo negativo, aggiungere solo il tampone di reazione senza gelatina fluorescente alle sezioni.
    6. Utilizzare un microscopio confocale per analizzare la lisi del substrato mediante esame. Utilizzare ImageJ per determinare l'area del polmone con evidenza di proteolisi. Per questo, misurare l'area polmonare che ha una colorazione sopra lo sfondo del campione spento. Come altro controllo, utilizzare il tessuto polmonare senza gelatina fluorescente aggiunta15.
      NOTA: eseguire questa operazione su un minimo di 10 campi visivi ad alta potenza (FOV) per ogni campione.
  2. Misurare l'espressione extracellulare di ROS nel tessuto polmonare mediante immunoreattività per la 3-nitrotirosina (un prodotto tossico dello stress ossidativo)13.

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Representative Results

I risultati rappresentativi mostrano come le risposte immunitarie infiammatorie a NTHi possano essere valutate/quantificate mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Una parte fondamentale dell'interpretazione dei risultati è il confronto in fluorescenza tra campioni di controllo e stimolati. Di solito sono necessari numerosi esperimenti preliminari per ottimizzare la colorazione dei campioni. Quanti colori diversi possono essere esaminati contemporaneamente dipenderà dal numero di canali disponibili sul citometro a flusso / microscopio confocale. I risultati sono mostrati per la valutazione di 1) produzione di ROS, 2) colorazione intracellulare delle citochine del tessuto polmonare umano e 3) zimografia in situ per misurare la proteolisi polmonare.

La Figura 1 mostra la rappresentazione della produzione di ROS da parte dei monociti. La misurazione dei ROS avviene mediante l'ossidazione di DHR123 per produrre fluorescenza. Le cellule sono controllate e la loro fluorescenza mediana viene valutata mediante citometria a flusso. La fluorescenza mediana del campione stimolato viene confrontata con il controllo.

La figura 2 mostra la produzione intracellulare di citochine da parte dei linfociti derivati dal tessuto polmonare umano. Il tessuto polmonare deve essere scomposto in sospensione monocellulare prima che i test di citometria a flusso possano essere eseguiti per valutare la produzione di mediatori infiammatori, ad esempio la produzione di citochine da parte dei linfociti. Il tessuto polmonare può essere scomposto meccanicamente o digerito chimicamente, ad esempio dalla collagenasi. I metodi di degradazione meccanica possono produrre risultati superiori, in particolare in termini di mantenimento della colorazione della superficie cellulare (ad esempio, CD3 e CD4). Il filtraggio dei campioni è importante per escludere detriti che potrebbero interferire con l'analisi.

La figura 3 mostra l'espressione dell'attività della proteasi misurata mediante zimografia in situ . Il tessuto non fissato viene utilizzato per valutare l'attività della proteasi. Questi campioni vengono generalmente congelati a -70 °C fino all'analisi. Viene misurata l'area del tessuto che ha fluorescenza della proteasi e i risultati vengono confrontati tra campioni di controllo e stimolati.

Figure 1
Figura 1: Produzione di ROS da parte dei monociti. (A) Il pannello mostra la strategia di gating per le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), con la dispersione diretta e la dispersione laterale utilizzate per definire la popolazione di fagociti. Nel pannello (B), la popolazione di fagociti è ulteriormente definita dall'espressione di CD14 per marcare i monociti. Questa popolazione di monociti viene analizzata per la fluorescenza DHR nel controllo (C) e nei campioni stimolati (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Produzione di citochine nel tessuto polmonare. Le cellule vengono prima analizzate per la loro espressione del marcatore leucocitario CD45 (A) utilizzando la citometria a flusso. Questa popolazione viene poi analizzata ulteriormente per l'espressione di CD3 (B) e l'espressione di CD4/CD8 (C). Le cellule CD3/CD4+ sono valutate per la produzione di citochine intracellulari nei campioni di controllo (D) e stimolati da NTHi (E). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Zimografia polmonare in situ . Il pannello (A) mostra l'espressione di cromatina/DAPI in sezioni di tessuto polmonare. Il pannello (B) mostra una colorazione fluorescente, che indica la presenza di attività MMP. Il pannello (C) mostra l'immagine unita indicando che anche l'attività MMP è colocalizzata con l'espressione della cromatina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

I metodi elencati qui utilizzano tecniche di citometria a flusso basate sulla fluorescenza e microscopia confocale che possono essere utilizzate in combinazione per ottenere informazioni dettagliate sulla risposta polmonare infiammatoria all'Hi.

Stabilire la formulazione antigenica appropriata di Hi da utilizzare è fondamentale ed è consigliabile avere un input specifico da un microbiologo a questo proposito. Live Hi induce una risposta più forte, mentre i preparati Hi uccisi e i componenti Hi sono più standardizzati e sono più facili da conservare. PI etichetterà solo i batteri morti22; altri coloranti come la carbossifluoresceina succinimidylester (CFSE) potrebbero essere utilizzati per marcare i batteri vivi per i saggi di fagocitosi23. Una serie di esperimenti preliminari dovrebbe essere intrapresa per ottimizzare l'antigene appropriato. Per l'utilizzo di NTHi live, un MOI di 100:1 è ottimale; un MOI più basso potrebbe non indurre una chiara risposta immunitaria, mentre un MOI più alto potrebbe essere tossico per le cellule. Tuttavia, una curva dose-risposta può fornire informazioni utili e può essere molto preziosa, in particolare con l'ottimizzazione iniziale della tecnica24. Come controllo positivo, può essere utilizzata una forma ottenuta commercialmente di antigene inattivato dello Staphylococcus aureus, che è anche etichettato con PI come sopra per il test ROS / fagocitosi. Per i saggi delle cellule T, la stimolazione con superantigene E stafilococcico (SEB) può essere utilizzata come controllo positivo19,25.

I protocolli per ottenere campioni di BAL e/o tessuto polmonare devono essere chiaramente stabiliti. I campioni BAL possono essere abbastanza variabili tra i diversi operatori. Una siringa portatile per il lavaggio del lobo centrale destro produce buoni risultati26. L'ottenimento del campione di tessuto polmonare da campioni di lobectomia richiede l'instaurazione di una collaborazione con un patologo. Il campione di tessuto polmonare dovrebbe avere un certo margine dal tumore (idealmente almeno 3-4 cm). Campioni più grandi (ad esempio, almeno 25-50 g) produrranno più cellule, così come campioni che sono più prossimali senza enfisema evidente. La disaggregazione meccanica del tessuto polmonare richiede molto tempo e richiede generalmente almeno 2-3 ore per ogni campione19,27.

Esperimenti preliminari dovrebbero essere fatti per ottimizzare la colorazione di diversi fluorofori sia per la citometria a flusso che per la microscopia confocale. Le aree su cui concentrarsi includono l'identificazione del miglior pannello di colorazione, la colorazione / concentrazione e il trattamento di cellule / tessuti per massimizzare la vitalità28. L'uso di tessuto polmonare può essere associato a più detriti tissutali rispetto ad altri campioni di fluido come sangue o BAL, e questo può avere qualche effetto sulla differenziazione di diverse popolazioni cellulari mediante citometria a flusso. La scelta appropriata degli anticorpi deve essere determinata e ottimizzata negli esperimenti preliminari. Per la marcatura superficiale dei linfociti, anti-CD3 e CD4 possono essere utilizzati per le cellule T helper, anti-CD3 e CD8 per le cellule T citotossiche e anti-CD3 e CD56 per le cellule NK. La scelta delle citochine intracellulari da studiare dipende dai mediatori di interesse e dal numero di parametri/colori che possono essere analizzati sul citometro a flusso29. Una sfida specifica del lavoro con i macrofagi nel tessuto polmonare è il loro alto livello di autofluorescenza30; Questo problema può essere affrontato confrontando le cellule stimolate con il controllo di fondo e l'aggiunta di marcatori specifici per l'infiammazione come proteasi e istoni.

Un limite di queste tecniche è la necessità di personale adeguatamente addestrato e qualificato per eseguire gli esperimenti. Sono inoltre necessarie strutture consolidate per citometria a flusso e microscopia. L'uso di campioni di tessuto umano è associato a una variabilità significativa, in particolare quando si utilizza tessuto polmonare; Ciò potrebbe richiedere una serie di esperimenti preliminari per ottimizzare i saggi (specialmente con problemi di colorazione dello sfondo).

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare lo staff di Immunologia Clinica presso Monash Health per la loro assistenza in questo lavoro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

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Immunologia e infezione Numero 172 batteri polmone infiammazione citometria a flusso microscopia confocale
Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie <em>all'Haemophilus influenzae</em>
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Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

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