Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.
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Artículo de método
Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae
En este artículo
Resumen
Resumen
Las técnicas de microinyección embrionaria son esenciales para muchos estudios moleculares y genéticos de especies de insectos. Proporcionan un medio para introducir fragmentos de ADN exógenos que codifican genes de interés, así como rasgos favorables en la línea germinal de insectos de una manera estable y heredable. Las cepas transgénicas resultantes pueden estudiarse para detectar cambios fenotípicos resultantes de la expresión del ADN integrado para responder a preguntas básicas o utilizarse en aplicaciones prácticas. Aunque la tecnología es sencilla, requiere del investigador paciencia y práctica para lograr un nivel de habilidad que maximice la eficiencia. Aquí se muestra un método para la microinyección de embriones del mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae. El objetivo es entregar por microinyección ADN exógeno al embrión para que pueda ser absorbido en las células germinales (polos) en desarrollo. La expresión del ADN inyectado de transposasas, integrasas, recombinasas u otras nucleasas (por ejemplo, proteínas asociadas a CRISPR, Cas) puede desencadenar eventos que conducen a su inserción covalente en los cromosomas. An. gambiae transgénico generado a partir de estas tecnologías se han utilizado para estudios básicos de componentes del sistema inmunológico, genes involucrados en la alimentación sanguínea y elementos del sistema olfativo. Además, estas técnicas se han utilizado para producir cepas de An. gambiae con rasgos que pueden ayudar a controlar la transmisión de parásitos de la malaria.
Introducción
Las técnicas de microinyección se han utilizado para manipular experimentalmente organismos desde principios de 19001. La microinyección se ha utilizado para estudiar tanto las funciones biológicas básicas como para introducir cambios importantes en la biología de un organismo deseado. La técnica de microinyección ha sido de particular interés para los biólogos vectoriales y ha sido ampliamente utilizada para manipular genomas vectoriales2-11. Los experimentos de transgénesis en vectores de artrópodos a menudo tienen como objetivo hacer que los vectores sean menos eficientes en la transmisión de p....
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Protocolo
1. Preparación de mosquitos para la microinyección
- Separe una jaula13 (~ 5000 cm3) con ~ 100 machos y 200-300 hembras 1-2 días adultos post-eclosión mosquitos y déjelos aparearse durante 2 días.
- Después del período de apareamiento, proporcione a los mosquitos una comida de sangre utilizando 2 ml de sangre con un dispositivo de alimentación artificial o animales vivos anestesiados dependiendo de las prácticas insectarias14. Al día siguiente, proporcione a los mosquitos una segunda comida de sangre para garantizar que todas las hembras apareadas hayan tenido la oportunidad de alimentarse y qu....
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Resultados
Un ejemplo representativo de la aplicación del protocolo de microinyección descrito se puede encontrar en Carballar-Lejarazú et al5. La intención aquí era insertar un sistema autónomo de impulsores genéticos en la línea germinal de una cepa de laboratorio, G3, de An. gambiae. El sistema fue diseñado para dirigirse al locus ortólogo cardinal (Agcd)en el tercer cromosoma de esta especie, que codifica una hemo peroxidasa que cataliza la conversión de 3-hidroxiquinurenina en.......
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Discusión
Con la mayor disponibilidad de tecnologías de ingeniería genética precisas y flexibles como CRISPR/Cas9, los organismos transgénicos pueden desarrollarse de una manera más directa y estable de lo que era posible anteriormente. Estas herramientas han permitido a los investigadores crear cepas transgénicas de mosquitos vectores que están muy cerca de lograr las propiedades deseadas de refractariedad a patógenos (modificación de la población) o esterilidad hereditaria (supresión de la población). Sin embargo, para desarroll.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell y Madeline Nottoli por la cría de mosquitos. La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria de la Universidad de California, Irvine. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tampón de microinyección | : | 1 mM de NaHPO4 tampón, pH 6.8, 50 mM Membrana de transferencia de KCl | |
| (membrana de transferencia probada genómicamente Zeta-Probe GT) | Bio-Rad | Cortado de manera ordenada y recta en una pieza de 2x1 cm | |
| Tubos cónicos de 50 ml (tubo de centrífuga desechable, polipropileno) | Marca Fisher | Corte de extremos | |
| Agua desionizada o bidestilada (ddH20) | Mili-Q | En una botella de lavado | |
| Microscopio de disección | Leica | Leica MZ12 | Para pinzas de alineación de embriones |
| Tamaño n.º 5 | |||
| Recipiente de vidrio | Pyrex | Nº 3140 | 125 x 65 |
| Corredera de vidrio | Fisher Marca | Nº 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubadora | Barnsted Lab-line | Modelo Nº 150 | 28 ° C |
| KCl | 50 mM | ||
| Película dental de látex | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinyector | Sutter Instrument | Microinyector digital XenoWorks | |
| Microcargador Puntas de pipeta | Eppendorf | 20 y micro; L microcargador epT.I.P.S. | |
| Micromanipulador | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulador | |
| Micropipeta | Lluvia | 20 y micro; L Extractor | |
| micropipetas | Sutter Instrument | Sutter P-2000 extractor | |
| Microscopio | Leica | DM 1000 LED o M165 FC | Para microinyección |
| Papel de filtro de fibra mínimo | Marca Fisher | No. 05-714-4 Papel de | cromatografía, grueso |
| Mosquitos | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, hembras adultas apareadas, alimentadas con sangre 4-5 días después de la eclosión | |
| Tampón NaHPO4; | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Malla | |||
| Pincel | Blick | Nº 05831-7040 | Fino, tamaño 4/0 |
| Placa | Plástico, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Acetato | |||
| Capilares de vidrio de cuarzo 3M | Instrumento Sutter | No. QF100-70-10 | Con filamento, 1 mm de diámetro exterior, ID 0.7 10 cm de longitud |
| Grado PCR en el agua | Roche | No. 03315843001 |
Referencias
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in ....
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Reimpresiones y permisos
