Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

Resumen

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Resumen

Las técnicas de microinyección embrionaria son esenciales para muchos estudios moleculares y genéticos de especies de insectos. Proporcionan un medio para introducir fragmentos de ADN exógenos que codifican genes de interés, así como rasgos favorables en la línea germinal de insectos de una manera estable y heredable. Las cepas transgénicas resultantes pueden estudiarse para detectar cambios fenotípicos resultantes de la expresión del ADN integrado para responder a preguntas básicas o utilizarse en aplicaciones prácticas. Aunque la tecnología es sencilla, requiere del investigador paciencia y práctica para lograr un nivel de habilidad que maximice la eficiencia. Aquí se muestra un método para la microinyección de embriones del mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae. El objetivo es entregar por microinyección ADN exógeno al embrión para que pueda ser absorbido en las células germinales (polos) en desarrollo. La expresión del ADN inyectado de transposasas, integrasas, recombinasas u otras nucleasas (por ejemplo, proteínas asociadas a CRISPR, Cas) puede desencadenar eventos que conducen a su inserción covalente en los cromosomas. An. gambiae transgénico generado a partir de estas tecnologías se han utilizado para estudios básicos de componentes del sistema inmunológico, genes involucrados en la alimentación sanguínea y elementos del sistema olfativo. Además, estas técnicas se han utilizado para producir cepas de An. gambiae con rasgos que pueden ayudar a controlar la transmisión de parásitos de la malaria.

Introducción

Las técnicas de microinyección se han utilizado para manipular experimentalmente organismos desde principios de 1900¹. La microinyección se ha utilizado para estudiar tanto las funciones biológicas básicas como para introducir cambios importantes en la biología de un organismo deseado. La técnica de microinyección ha sido de particular interés para los biólogos vectoriales y ha sido ampliamente utilizada para manipular genomas vectoriales^2-11. Los experimentos de transgénesis en vectores de artrópodos a menudo tienen como objetivo hacer que los vectores sean menos eficientes en la transmisión de patógenos al promulgar cambios que disminuyen la aptitud de un vector o aumentan la refractariedad a los patógenos que transmiten. Los mosquitos transmiten una variedad de patógenos humanos y tienen un impacto significativo en la morbilidad y la mortalidad en todo el mundo. El género de mosquitos Anopheles transmite los patógenos parásitos de la malaria humana, Plasmodium spp. Los experimentos de ingeniería genética con Anopheles han tenido como objetivo comprender mejor la biología y reducir la capacidad vectorial de estos mosquitos en los esfuerzos por desarrollar nuevas estrategias de eliminación de la malaria.

Los mosquitos vectores que contribuyen con la mayor cantidad de infecciones de malaria en todo el mundo se encuentran en el complejo de especies anopheles gambiae. Sin embargo, la mayoría de los experimentos exitosos de transgénesis se han realizado en el vector de la malaria del subcontinente indio, Anopheles stephensi. Si bien existen muchas cepas de Anopheles gambiae adaptadas al laboratorio, el número de líneas transgénicas de Anopheles gambiae spp. reportadas en la literatura no se compara con el de Anopheles stephensi. Se cree que el embrión de Anopheles gambiae es más difícil de inyectar y lograr una transgénesis exitosa que Anopheles stephensi,aunque se desconocen las razones de estas diferencias. Este protocolo describe un método que ha demostrado ser consistentemente exitoso en el logro de la transgénesis de embriones de Anopheles gambiae a través de la microinyección. El protocolo se basa en un método previamente desarrollado por Hervé Bossin y Mark Benedict¹² con algunos detalles adicionales y alteraciones añadidas que se han encontrado para aumentar la eficiencia de la transgénesis.

Protocolo

1. Preparación de mosquitos para la microinyección

1. Separe una jaula¹³ (~ 5000 cm³) con ~ 100 machos y 200-300 hembras 1-2 días adultos post-eclosión mosquitos y déjelos aparearse durante 2 días.
2. Después del período de apareamiento, proporcione a los mosquitos una comida de sangre utilizando 2 ml de sangre con un dispositivo de alimentación artificial o animales vivos anestesiados dependiendo de las prácticas insectarias¹⁴. Al día siguiente, proporcione a los mosquitos una segunda comida de sangre para garantizar que todas las hembras apareadas hayan tenido la oportunidad de alimentarse y que los mosquitos parcialmente alimentados se hayan hinchado por completo.
3. Utilice los mosquitos para la recolección de embriones 2-4 días después de la segunda comida de sangre.
   NOTA: La nutrición larvaria es importante para la robustez adulta y la aptitud reproductiva. Ver Benedict et al. (2020) para obtener información sobre cómo criar insectos sanos¹⁴. No se han observado diferencias significativas en la puesta de huevos cuando los mosquitos se alimentan de un comedero artificial o animales vivos anestesiados. Use cualquier método que se use rutinariamente para Anopheles gambiae en el insectario.

2. Preparación embrionaria

1. Use un aspirador para colocar 20-30 hembras en un tubo cónico transparente de 50 ml que ha sido cortado (con una sierra de cinta) para que esté abierto en ambos extremos y está cubierto con película dental de látex en un extremo y malla de nylon y papel de filtro en el otro (Figura 1).
   NOTA: Los mosquitos depositarán sus huevos en el papel de filtro y la malla de nylon mantendrá el papel de filtro firmemente en su lugar. Los huevos de mosquito son de forma cilíndrica, ~ 500 μm de longitud, ~ 200 μm de diámetro en su punto más ancho y disminuyen en los extremos anterior y posterior(Figura 2).
2. Coloque el tubo lleno de mosquitos en una pequeña placa de Petri (60 mm x 15 mm) llena de agua de doble destilación (ddH₂O). Coloque el tubo y el plato en una incubadora a 28 °C durante 45 min (Figura 3).
3. Retire el tubo de la incubadora e inserte el tubo en una jaula vacía. Golpee suavemente el tubo para permitir que los mosquitos salgan volando y retire el tubo de la jaula una vez que todos los mosquitos hayan volado.
4. Cuando el tubo esté libre de mosquitos, desenrosque el anillo inferior, retire el nylon y use fórceps para quitar cuidadosamente el papel de filtro con los huevos del tubo. Coloque el papel de filtro en una placa de Petri de plástico (100 mm x 15 mm) que contenga una capa de papel de filtro humedecido con ddH₂O.
5. Observa los huevos. Los huevos que han envejecido hasta el punto en que son de color gris claro(Figura 4)están listos para la alineación.
   1. Si los huevos todavía son blancos, devuélvalos a la incubadora y verifique el color cada 5 minutos. Los huevos blancos son frágiles, se rompen fácilmente y no sobreviven bien después del proceso de inyección, lo que resulta en una eclosión baja.
   2. Los huevos que son de color gris oscuro o negro han envejecido demasiado. No los use.

3. Alineación embrionaria

1. Corte un trozo de membrana secante de nylon (2 cm x 1 cm) con una cuchilla de afeitar, asegurándose de que el borde esté bien recortado.
   NOTA: Si el borde no es recto, los huevos no permanecerán fijados a la membrana correctamente durante el proceso de inyección.
2. Coloque una membrana en un portaobjetos de vidrio y cubra la membrana con un trozo de papel de filtro (2 cm x 2 cm), dejando al descubierto ~ 1 mm del filtro de membrana (Figura 5).
   NOTA: Asegúrese de que los portaobjetos del microscopio estén limpios antes de usarlos y use fórceps limpios para manipular el filtro de membrana.
3. Humedezca el papel de filtro con H₂O desionizado, ya que los huevos morirán si se desecan durante períodos prolongados de tiempo.
   NOTA: No ponga demasiada agua en el papel porque los embriones se moverán durante el proceso de inyección, pero asegúrese de que haya suficiente para evitar que el embrión se seque(Figura 6A,B). El exceso de agua se puede eliminar absorbiéndola con un trozo de papel defiltro.
4. Transfiera suavemente 30-50 embriones al borde de la membrana con un pincel (tamaño # 0). Use el cepillo para alinear los huevos verticalmente a lo largo de la membrana enrollándolos suavemente sobre la diapositiva para que el lado ventral (convexo) esté orientado hacia arriba.
5. Oriente todos los huevos en la misma dirección para que cuando los óvulos se observen bajo el microscopio de microinyección, el extremo posterior (más puntiagudo, Figura 6A,B)esté en una posición hacia abajo y forme un ángulo de ~15° con la aguja(Figura 6C). Cubra todo el borde de la membrana con huevos (30-50) y coloque el portaobjetos debajo del microscopio para inyección.
   NOTA: Elija los huevos cuidadosamente. Deseche los que son blancos (demasiado jóvenes o sin desarrollar) o gris oscuro (demasiado viejos y romperán la aguja), y los anormales(Figura 7). Asegúrese de que el papel de filtro permanezca húmedo en todomomento.

4. Preparación del ADN

1. Purifique los ADN de plásmidos para inyección, como mínimo, con un kit maxiprep de plásmido de ADN libre de endotoxinas siguiendo los protocolos del fabricante.
2. Resuspender el ADN en agua de grado PCR y centrifugar a 17.100 x g en una centrífuga refrigerada durante 30 min a 4 °C. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico nuevo y limpio de 1,5 ml. Micropipeta cuidadosamente para evitar la transferencia de partículas no deseadas de la columna.
3. Realice una segunda precipitación de ADN utilizando una décima parte del volumen de acetato de sodio 3M y un volumen doble de etanol al 100%.
4. Resuspend el ADN en 300-500 μL de agua de grado PCR para una concentración final de plásmido de 1000 ng/μL. Mezcle el cóctel de plásmidos en el tampón de inyección para obtener una concentración final de plásmido de 300-400 ng/μL y haga alícuotas de 10-20 μL.
   NOTA: El ADN se puede almacenar a -20 °C. Las alícuotas de microinyección de ADN se pueden almacenar a -20 °C, o a -80 °C si se utilizan componentes de ARN. No exceda los 800 ng/μL de ADN en la mezcla de inyección porque la viscosidad hará que las agujas se obstruyan.

5. Preparación de la aguja

1. Haga las agujas tirando de capilares de cuarzo de 10 cm utilizando un extractor de micropipeta programable.
2. Examine la aguja bajo el microscopio para asegurarse de que la punta esté bien formada. Asegúrese de que el ajuste de la aguja en el extractor programable produzca una punta que comience a disminuir ~ 0.5 mm desde el extremo terminal y termine en un punto fino (consulte la Figura 6). Las agujas que se rompen fácilmente generalmente tienen una contracción demasiado larga.
   NOTA: Las condiciones pueden diferir según el extractor de agujas (los autores pondrán a disposición, previa solicitud, la configuración del extractor programable que utilicen. Las restricciones de la revista nos impiden citar una marca específica). Las agujas se pueden tirar a mano, pero esto requiere un conjunto de habilidades que no están disponibles en la mayoría de los laboratorios.

6. Microinyección embrionaria

1. Use una punta de microcargador para llenar las agujas con 2 μL de mezcla de ADN. Inserte la aguja en el soporte de la aguja y conecte el tubo de la bomba de presión automatizada (Figura 8).
2. Importante: Alinee la aguja de manera que forme un ángulo de 15° con el plano de la diapositiva (Figura 8).
3. Abra la punta de la aguja tocando cuidadosamente el primer óvulo e inyéctelo insertando la punta de la aguja ≤ 10 μm en el polo posterior. Una inyección exitosa conducirá a un pequeño movimiento del citoplasma dentro del óvulo.
4. Use los controles de la etapa coaxial del microscopio para pasar al siguiente óvulo para continuar la inyección.
   1. Para asegurarse de que la punta de la aguja permanezca abierta y no se haya obstruido, presione el botón Inyectar antes de ingresar a otro embrión y visualice la pequeña gota en la abertura de la aguja.
   2. Si la aguja se obstruye, presione el botón Borrar para limpiar la aguja y repita la prueba de visualización de gotas. Ajuste la presión según sea necesario si la abertura de la punta de la aguja se hace un poco más grande para asegurarse de que el tamaño de la gota permanezca pequeño.
   3. Inyecte ~ 40-50 huevos con una aguja.
      NOTA: Asegúrese de que el papel de filtro permanezca húmedo en todo momento. Mantenga suficiente contrapresión en la aguja para mantenerla despejada. Una aguja que no se puede destapar debe reemplazarse con una aguja nueva. La colocación del embrión, la inserción con aguja y la inyección se facilitan con microscopios que tienen controles coaxiales para el movimiento horizontal de la etapa (Figura 9).
5. Después de que se completen las inyecciones, enjuague los huevos en un recipiente de vidrio forrado con papel de filtro y lleno con 50 ml de H₂O desionizado(Figura 10).
   NOTA: Los embriones comenzarán a eclosionar 2 días después de la inyección y pueden tardar hasta 3-5 días. Las larvas eclosionadas deben transferirse inmediatamente (verifique 2 veces al día) a un recipiente limpio con agua y alimentos.

Resultados

Un ejemplo representativo de la aplicación del protocolo de microinyección descrito se puede encontrar en Carballar-Lejarazú et al⁵. La intención aquí era insertar un sistema autónomo de impulsores genéticos en la línea germinal de una cepa de laboratorio, G3, de An. gambiae. El sistema fue diseñado para dirigirse al locus ortólogo cardinal (Agcd)en el tercer cromosoma de esta especie, que codifica una hemo peroxidasa que cataliza la conversión de 3-hidroxiquinurenina en...

Discusión

Con la mayor disponibilidad de tecnologías de ingeniería genética precisas y flexibles como CRISPR/Cas9, los organismos transgénicos pueden desarrollarse de una manera más directa y estable de lo que era posible anteriormente. Estas herramientas han permitido a los investigadores crear cepas transgénicas de mosquitos vectores que están muy cerca de lograr las propiedades deseadas de refractariedad a patógenos (modificación de la población) o esterilidad hereditaria (supresión de la población). Sin embargo, para desarroll...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x Tampón de microinyección	:		1 mM de NaHPO4 tampón, pH 6.8, 50 mM Membrana de transferencia de KCl
(membrana de transferencia probada genómicamente Zeta-Probe GT)	Bio-Rad		Cortado de manera ordenada y recta en una pieza de 2x1 cm
Tubos cónicos de 50 ml (tubo de centrífuga desechable, polipropileno)	Marca Fisher		Corte de extremos
Agua desionizada o bidestilada (ddH20)	Mili-Q		En una botella de lavado
Microscopio de disección	Leica	Leica MZ12	Para pinzas de alineación de embriones
			Tamaño n.º 5
Recipiente de vidrio	Pyrex	Nº 3140	125 x 65
Corredera de vidrio	Fisher Marca	Nº 12-549-3	75x26 mm
Incubadora	Barnsted Lab-line	Modelo Nº 150	28 ° C
KCl			50 mM
Película dental de látex	Crosstex International	No. 19302
Microinyector	Sutter Instrument		Microinyector digital XenoWorks
Microcargador Puntas de pipeta	Eppendorf		20 y micro; L microcargador epT.I.P.S.
Micromanipulador	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulador
Micropipeta	Lluvia		20 y micro; L Extractor
micropipetas	Sutter Instrument	Sutter P-2000 extractor
Microscopio	Leica	DM 1000 LED o M165 FC	Para microinyección
Papel de filtro de fibra mínimo	Marca Fisher	No. 05-714-4 Papel de	cromatografía, grueso
Mosquitos	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, hembras adultas apareadas, alimentadas con sangre 4-5 días después de la eclosión
Tampón NaHPO4;			1 mM, ph 6.8
Malla
Pincel	Blick	Nº 05831-7040	Fino, tamaño 4/0
Placa			Plástico, (60x15 mm, 90x15 mm)
Acetato
Capilares de vidrio de cuarzo 3M	Instrumento Sutter	No. QF100-70-10	Con filamento, 1 mm de diámetro exterior,  ID 0.7 10 cm de longitud
Grado PCR en el agua	Roche	No. 03315843001