Artículo de método

Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

DOI:

10.3791/62592

⸱

13 de junio de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El éxito de la caracterización bioquímica y biofísica de los transportadores ABC depende en gran medida de la elección del sistema de expresión heteróloga. En las últimas dos décadas, hemos desarrollado una plataforma de expresión de proteínas de membrana de levadura que se ha utilizado para estudiar muchas proteínas importantes de membrana fúngica. El huésped de expresión Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ se elimina en siete transportadores ABC endógenos principales y contiene el factor de transcripción Pdr1-3 con una mutación de ganancia de función que permite la sobreexpresión constitutiva de genes de proteínas de membrana heterólogas integradas de manera estable como copias individuales en el locus genómico PDR5. La creación de vectores plásmidos versátiles y la optimización de estrategias de clonación en un solo paso permiten la clonación, mutagénesis y expresión rápidas y precisas de transportadores ABC heterólogos. Aquí, describimos el desarrollo y el uso de una nueva etiqueta doble mGFPHis escindible con proteasa (es decir, la proteína fluorescente verde mejorada con levadura monomérica yEGFP3 fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad de seis histidinas) que fue diseñada para evitar la posible interferencia de la etiqueta con la proteína de interés y para aumentar la eficiencia de unión de la etiqueta His a las resinas de afinidad de níquel. La fusión de mGFPHis a la proteína de membrana ORF (marco de lectura abierto) permite una fácil cuantificación de la proteína mediante la inspección de geles de poliacrilamida y la detección de productos de degradación conservando la etiqueta mGFPHis. Demostramos cómo esta característica facilita el cribado con detergente para la solubilización de proteínas de membrana. Se presenta un protocolo para el aislamiento eficiente, rápido y confiable de las preparaciones de membrana plasmática a pequeña escala del transportador de eflujo multifármaco Cdr1 marcado con C-terminalmente marcado como Candida albicans Cdr1 sobreexpresado en S. cerevisiae ADΔΔ. Este protocolo de aislamiento de membranas plasmáticas a pequeña escala genera membranas plasmáticas de alta calidad en un solo día laborable. Las preparaciones de membrana plasmática se pueden utilizar para determinar las actividades enzimáticas de las variantes mutantes Cdr1 y Cdr1.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La extracción de proteínas de membrana integral de su entorno lipídico nativo puede afectar dramáticamente su estructura y función1,2,3,4. La compleja composición lipídica de las membranas biológicas5 asegura que puedan ocurrir interacciones proteína-lípido de importancia crítica6. Los lípidos mantienen la integridad estructural de las proteínas de membrana, lo que les permite funcionar correctamente en su(s) destino(s) compartimental(es) de membrana7,8. Por lo tanto, un primer paso crítico en la purificación de proteínas de membrana es la extracción de la proteína de su entorno nativo sin afectar su estructura y / o función.

Existen muchos obstáculos para caracterizar la estructura de las proteínas de membrana, la mayoría de los cuales están relacionados con su naturaleza hidrofóbica, y las dificultades de expresar proteínas de membrana correctamente plegadas y funcionales en las cantidades requeridas para la cristalografía de rayos X o la microscopía crio-electrónica (crio-EM)9,10,11,12. Existen tres tipos de sistemas de expresión de proteínas de membrana:homólogos 9,heterólogos13,14,15y sistemas de expresión in vitro 16,17. Los niveles de expresión a menudo bajos, o los costos prohibitivos, de muchos sistemas de expresión dejan solo unos pocos huéspedes como la opción preferida para producir proteínas de membrana. Incluyen el huésped bacteriano, Escherichia coli,las levaduras S. cerevisiae y Pichia pastoris,y eucariotas superiores como las células de insectos Sf9 o las líneas celulares de mamíferos18. Todas las tecnologías de expresión de proteínas de membrana tienen ventajas y desventajas; sin embargo, S. cerevisiae es quizás el organismo modelo eucariota mejor estudiado adecuado para la producción de proteínas de membrana. Es altamente versátil con aplicaciones en ingeniería genética, descubrimiento de fármacos, biología sintética y la expresión de proteínas de membrana eucariota14,19,20,21.

En este estudio, se utilizó una tecnología patentada de expresión de proteínas de membrana S. cerevisiae 21, con S. cerevisiae ADΔ14 y ADΔΔ22 como los huéspedes preferidos(Figura 1A),para sobreexpresar y estudiar la principal bomba de eflujo multifármaco de C. albicans Cdr1. Ambas cepas de S. cerevisiae son derivados de AD1-8u-23 que tienen los genes ura3 (ADΔ) o ura3 e his1 (ADΔΔ) eliminados para eliminar cualquier falso positivo de uracilo o prototrofo de histidina que surja a través de la integración no deseada en los loci genómicos URA3 o HIS1. La eliminación de las 7 principales bombas de eflujo multifármaco23,indicadas en la Figura 1A, hace que ADΔΔ sea exquisitamente sensible a la mayoría de los xenobióticos. El factor de transcripción mutante de ganancia de función Pdr1-3 causa la sobreexpresión constitutiva de proteínas de membrana heterólogas como Cdr1 (octógonos rojos en la Figura 1A)después de la integración del casete de transformación heterólogo-ORF -contiene (Figura 1A) en el locus genómico PDR5 (rectángulo azul en la Figura 1A) a través de dos eventos de recombinación homólogos. La localización adecuada de la membrana plasmática de las proteínas marcadas con C-terminal mGFPHis se puede confirmar mediante microscopía confocal(Figura 1A),y la etiqueta His se puede utilizar para la purificación de afinidad de níquel de la proteína marcada. Sin embargo, la clonación de algunos transportadores de ABC fúngicos (por ejemplo, Candida krusei ABC1)en plásmidos derivados de pABC3 no fue posible porque no pudieron propagarse en Escherichia coli debido a la toxicidad celular. Esto provocó el desarrollo de la clonación de un solo paso de proteínas de membrana14,24 etiquetadas en su terminal N o C con varias etiquetas de afinidad, epítopo o reportero directamente en S. cerevisiae ADΔΔ(Figura 1C). S. cerevisiae Las cepas ADΔΔ que sobreexpresan varios mutantes CDR1 también se pueden crear de manera eficiente mediante el uso de hasta cinco fragmentos individuales de PCR que se superponen en 25 pb(Figura 1C). Empleando este protocolo, muchos ORF de interés pueden ser clonados, expresados y caracterizados a bajo costo y con alta eficiencia en un lapso de tiempo muy corto. La eficiencia de transformación se reduce solo ~ 2 veces con cada fragmento de PCR adicional. 

Si se desea, los niveles de expresión también pueden manipularse fácilmente mediante el diseño de imprimación para ajustar de manera predecible los niveles de expresión a cualquier lugar entre el 0,1% y el 50% de los niveles de expresión constitutiva generalmente altos25. El vector de clonación derivado pABC314 optimizado, multifuncional, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contiene un sitio de escisión de la proteasa HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), una proteasa que funciona mejor a 4 °C que la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) de uso frecuente27. L es un enlazador de cinco aminoácidos (GSGGS), mGFP es un mutante monomérico (A206K)28,29 versión de la variante de proteína de fluorescencia verde mejorada por levadura yEGFP330,y el suyo es un enlazador de tres aminoácidos (GGS) seguido de la etiqueta de purificación de proteína de afinidad de níquel de seis histidinas (HHHHHH).

Esta tecnología de expresión se ha utilizado con éxito en el descubrimiento de fármacos y el estudio de proteínas de membrana. La primera estructura para un fármaco azol fúngico diana, S. cerevisiae Erg1131, se resolvió utilizando esta tecnología. También permitió la caracterización detallada de C. albicans Cdr132 , 33,34y la creación de una molécula de Cdr1 deficiente en cisteína35 adecuada para estudios de reticulación de cisteína para verificar cualquier estructura futura de alta resolución. Muchos otros transportadores ABC de los principales patógenos fúngicos humanos (es decir, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei y el complejo de especies Fusarium solani) también se han estudiado en detalle utilizando esta plataforma de expresión24,36,37,38,39. Esto ha permitido la generación de un panel de cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan bombas de eflujo que se ha utilizado en pantallas de alto rendimiento para descubrir el nuevo sustrato de bomba de eflujo fluorescente Rojo del Nilorojo 40 y específico41 y de amplio espectro14,33,42,43,44 inhibidores de la bomba de eflujo. El uso de este sistema también permitió el descubrimiento de la clorgirina como el primer inhibidor de la bomba de eflujo multifármaco fúngico de amplio espectro de su tipo42.

La solubilización completa de las proteínas de membrana y la creación de una preparación homogénea de proteína-micela de membrana desprovista de lípidos endógenos, requiere altas concentraciones de detergente45. Pero desafortunadamente, esto también a menudo inactiva la proteína de membrana5,8,45,46. Las propiedades de los monómeros detergentes y su agregación en solución se ven afectadas por las propiedades físicas de la cola hidrofóbica, la longitud y ramificación de la cadena alquilo, la presencia de un núcleo aromático o cadena lateral de fluoroalquilo, o el número de unidades de polioxietileno. Por lo tanto, el cribado de detergente es un primer paso importante para determinar el detergente más adecuado para la solubilización y purificación de proteínas de membrana.

C. albicans es un importante patógeno fúngico humano de individuos inmunocomprometidos que puede causar infecciones invasivas graves y potencialmente mortales47, y puede volverse resistente a los medicamentos antimicóticos azoles48,49. Uno de los principales mecanismos de la resistencia a múltiples medicamentos de C. albicans es la sobreexpresión de Cdr150,que es untransportador de casete de unión a ATP (ABC) tipo II de la subfamilia ABCG ubicado en la membrana plasmática. Los transportadores ABCG fúngicos de tamaño completo (que consisten en dos dominios de unión a nucleótidos [NBD] y dos dominios transmembrana [TMD]) se conocen más comúnmente como transportadores de resistencia a medicamentos pleiotrópicos (PDR) y se caracterizan por su topología única de dominio invertido [NBD-TMD]2. Los transportadores PDR solo se encuentran en las plantas52,53 y hongos54. A pesar de su importancia, no hay estructuras para los transportadores PDR, aunque recientemente se han resuelto estructuras para transportadores ABCG humanos de tamaño medio, lo que ayudó a crear el primer modelo tentativo para Cdr133. Nuestra evidencia experimental reciente sugiere, sin embargo, que este modelo es defectuoso posiblemente porque los transportadores de PDR de hongos tienen NBD asimétricos característicos que resultan muy posiblemente en un mecanismo de transporte único. Por lo tanto, se requiere una estructura de alta resolución de Cdr1 tanto para el diseño racional de nuevos inhibidores de la bomba de eflujo que puedan ayudar a superar la resistencia a los medicamentos mediados por el eflujo, como para proporcionar información sobre el mecanismo de acción de esta importante familia de transportadores ABC.

El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos fiables para la expresión, solubilización y purificación de Cdr1 en el huésped de expresión de S. cerevisiae modificado genéticamente, con el objetivo final de obtener una estructura de alta resolución para Cdr1. Como parte de este proceso, se diseñó una doble etiqueta mGFPHis escindible con proteasa(Figura 1B)con un enlazador de 16 residuos que separa la etiqueta del extremo C de Cdr1, lo que mejoró la unión de la etiqueta de afinidad 6x His adjunta a la resina de afinidad de níquel y permitió el monitoreo de los niveles de expresión de Cdr1 en células vivas y durante todo el proceso de purificación. También se desarrolló un protocolo reproducible para preparaciones de proteínas de membrana plasmática de levadura a pequeña escala que contienen aproximadamente un 10% de C. albicans Cdr1 (según lo estimado por la tinción de Coomassie después de SDS-PAGE), que podría usarse para la caracterización bioquímica de Cdr1.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de existencias frescas o congeladas de células ADΔ y ADΔΔ competentes para la transformación

  1. Inocular 25 ml de 2x YPCD [es decir, 2x YPD; 2% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 4% (p/v) dextrosa), 0,079 % (p/v) CSM (mezcla completa de suplemento)]35 medio con una sola colonia de levadura e incubar durante la noche (o/n) durante 16 h a 30 °C con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).
  2. Inocular 225 mL de 2x medio YPCD con el cultivo de 25 mL o/n y comprobar la densidad óptica celular a 600 nm (OD600); el OD600 suele ser ~0.5-1.0.
    NOTA: En esta etapa, asegúrese de que todos los materiales necesarios para el siguiente experimento de transformación estén fácilmente disponibles.
  3. Cultive el cultivo a 30 °C durante otras ~6-8 h con agitación a 200 rpm hasta que la densidad celular alcance un OD600 de ~6-8.
    NOTA: Los siguientes pasos se realizan a temperatura ambiente (RT) a menos que se indique lo contrario.
  4. Cosechar estas células de fase logarítmica por centrifugación a 3.000 x g durante 3 min.
  5. Resusped las células y lávelas dos veces con agua estéril de doble destilación (ddH2O; es decir, 200 ml y luego 20 ml).
  6. Cosecha las células a 3.000 x g durante 3 min.
  7. Lentamente (es decir, agregue 30 alícuotas iguales de solución de células competentes congeladas (FCC) cada minuto durante 30 minutos) resuspenda el pellet celular en X ml de FCC [5% (p/v) glicerol, 10% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)] en hielo (donde X = OD600;por ejemplo, si OD600 = 6 resuspend en 6 mL, o si OD600 = 3 resuspend en 3 mL).
    NOTA: La composición correcta de FCC es fundamental para el éxito de la transformación.
  8. Mantenga las células en hielo durante 2 h antes de la transformación o guarde las alícuotas a -80 °C hasta que sea necesario.
    NOTA: Las células ADΔ y ADΔΔ son muy sensibles a la congelación. Por lo tanto, las células deben enfriarse lentamente a -80 ° C: coloque tubos de microcentrífuga helados que contengan alícuotas de células de 50-600 μL en una caja de almacenamiento de plástico (RT). Coloque la caja en un recipiente de poliestireno (RT) más grande y cierre el recipiente con una tapa de poliestireno adecuada. Luego, coloque el recipiente en el congelador de -80 ° C.
    PRECAUCIÓN: La congelación lenta es fundamental para la supervivencia celular.

2. Transformación de ADΔ y ADΔΔ con CaCDR1-XLmGFPHis y confirmación de los transformadores correctos mediante PCR de colonias y secuenciación de ADN

NOTA: El plásmido pABC3-CDR1-mGFPHis fue creado utilizando estrategias de clonación convencionales descritas en detalle en Lamping et al., 201055 y se ilustra en la Figura 1B. C. albicans CDR1 de tipo salvaje se aisló como un fragmento de PacI /NotI del plásmido pABC3-CaCDR1A-GFP14 y se clonó en pABC3-XLmGFPHis26.

  1. La PCR amplifica todo el casete de transformación CDR1 con una ADN polimerasa de alta fidelidad y un par de cebadores PDR5-pro/PDR5-ter35 utilizando 1-10 ng de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis como plantilla de ADN o, alternativamente, digerir 2 μg de pABC3-CaCDR1-XLmGFPSa hasta completar con la enzima de restricción de 10 U AscI a 37 °C (Figura 1A,B).
    NOTA: El casete de transformación CDR1 (Figura 1A)comprende el promotor PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminador PGK1 - marcador de selección URA3 - pdr5 región descendente.
  2. Realice la electroforesis en gel de agarosa y extraiga en gel el cassette de transformación de ~8 kb.
    NOTA: La purificación en gel del cassette de transformación CaCDR1 de ~8 kb elimina cualquier posible ADN plásmido no digerido, lo que podría conducir a transformadores incorrectos que tienen todo el plásmido, en lugar del cassette de transformación lineal, integrado en el locus genómico PDR5.
  3. Desnaturalizar la cantidad requerida de ADN portador de esperma de salmón (2 mg / ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5) durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo y mantener en hielo. Use tubos tapados con tornillo para hervir el ADN del esperma de salmón para evitar la apertura de la tapa.
  4. Mezcle 50 μL de ADN de espermatozoides de salmón desnaturalizos con 14 μL del cassette de transformación (500-2,000 ng) y mantenga los 64 μL de mezcla de ADN en hielo hasta su uso posterior.
    NOTA: Utilice 10 ng de un plásmido lanzadera de levadura E. coli(por ejemplo, pYES2) como control de transformación positiva(Figura 2B).
  5. Resuspónda de células competentes frescas o congeladas descongeladas rápidamente durante 5 min en un baño de agua a 30 °C y divídalas en alícuotas de 50 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  6. Cosechar células por centrifugación durante 1 min en una microfuge a velocidad máxima (18.000 x g).
  7. Retire el sobrenadante y mantenga la bolita celular en RT.
  8. Para cada transformación, mezcle combinaciones de 296 μL (RT) de 260 μL de polietilenglicol al 50% (p/v) (PEG 3350) y 36 μL de acetato de litio de 1 M (LiAc), mediante pipeteo repetido, con los 64 μL apropiados de mezclas de ADN heladas.
  9. Añadir la mezcla apropiada inmediatamente a una alícuota de pellet celular competente de 50 μL.
  10. Resuspend el pellet celular en los 360 μL de mezcla PEG-LiAc-DNA mediante el vórtice completo durante unos 30 s.
  11. Incubar la mezcla celular en un baño de agua a 30 °C durante 1 h.
    NOTA: Las células ADΔ y ADΔΔ se transforman mejor a 30 °C que a 42 °C35.
  12. Cosecha las células a 18.000 x g durante 10 s. Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet celular en 80 μL de ddH2O.
  13. Extienda las células en una placa de agar CSM-URA35 [es decir, 0.67% (p/ v) base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 0.077% (p/ v) CSM menos uracilo, 2% (p / v) glucosa y 2% (p / v) agar].
  14. Incubar las placas durante 2-3 días a 30 °C hasta que los transformadores prototrofos de uracilo sean claramente visibles.
    NOTA: Espere ~ 100 transformadores por μg del casete de transformación lineal ~8 kb CaCDR1 y ~4 x 104 transformadores por μg pYES2.
  15. Elija cinco transformadores independientes y extiéndalos en una placa CSM-URA fresca para separar los transformadores prototrofos de uracilo de los restos de células huésped no transformadas.
  16. Elimine cualquier posible mutante pequeño cultivando los transformadores en placas de agar YPG [1% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 2% (v/v) de glicerol y 2% (p/v) de agar](Figura 2D).
    NOTA: Los mutantes pequeños tienen mitocondrias defectuosas y, por lo tanto, no pueden crecer en fuentes de carbono no fermentables. Son bastante comunes en S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ y ADΔΔ son particularmente propensos a adquirir el fenotipo pequeño.
  17. Realice pcr de colonias de levadura y confirme que al menos tres transformadores independientes se integran correctamente en el locus genómico PDR5 (Figura 1C)amplificando todo el casete de transformación CaCDR1 de ~ 8 kb con una ADN polimerasa específica que está optimizada para amplificar productos de PCR a partir de fuentes de plantillas de ADN impuras. Utilice un conjunto de cebadores que se unan justo fuera del sitio de integración y alícuotas de 1 μL de suspensiones celulares (en ddH2O) derivadas de colonias individuales como plantillas de ADN.
    NOTA: Esta ADN polimerasa en particular amplifica de manera confiable ~ 8 kb fragmentos de PCR de células de levadura intactas. Sin embargo, para una amplificación confiable, se requieren 45 ciclos de PCR, y las células de levadura deben resuspendérse a OD600 1-10 en ddH2O.
  18. Confirme el producto de amplificación de PCR correcto de ~ 8 kb mediante electroforesis en gel de agarosa de ADN de una porción de 1 μL de la reacción de PCR.
  19. Elimine el exceso de cebadores de amplificación de una porción de 10 μL de la reacción de PCR con una mezcla enzimática de una exonucleasa de ADN de una sola cadena y una fosfatasa siguiendo las instrucciones del fabricante antes de secuenciar todo el ORF utilizando porciones de la muestra de ADN tratada con los cebadores apropiados.

3. Protocolo de aislamiento de membrana plasmática de levadura a pequeña escala

  1. Células de levadura en crecimiento
    1. Precultra una sola colonia de levadura en 10 mL de YPD a 30 °C durante ~7-8 h con agitación a 200 rpm.
    2. Inocular 40 mL de medio YPD con el preculto de 10 mL e incubar las células a 30 °C o/n (~16 h) con agitación a 200 rpm hasta que la densidad celular alcance un OD600 de 1-3.
  2. Cosecha de células de levadura
    1. Cosechar 40 unidades OD (ODU; por ejemplo, 1 mL a un OD600 de 1 = 1 ODU) de células de fase logarítmica a 4.200 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Resusped y lave las células dos veces con ddH2O estéril helada (es decir, 40 ml y luego 1 ml; cosechar las células entre pasos por centrifugación a 4.200 x g durante 5 min a 4 °C).
    3. Vuelva a colocar el pellet en 1 ml de ddH2O estéril helado y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenfriado (sobre hielo).
    4. Cosechar células a 3.300 x g durante 3 min a 4 °C.
    5. Aspirar el sobrenadante.
    6. Resusped el pellet celular en tampón homogeneizador de 0,5 ml [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glicerol; pH 7,5] recién suplementado con 1 mM de fenilmetilsulfonilo fluoruro (PMSF).
      NOTA: Siempre agregue PMSF fresco porque PMSF se inactiva rápidamente al exponerse al agua.
      PRECAUCIÓN: PMSF es un inhibidor de la serina proteasa, que es extremadamente corrosivo y destructivo para los tejidos. Puede causar daño ocular irreversible.
    7. Guarde la suspensión celular a -80 °C o úselo inmediatamente.
  3. Aislamiento de membranas plasmáticas
    1. Si está congelado, descongele las células en hielo durante ~ 1 h.
    2. Agregue perlas de sílice heladas de 0,5 mm de diámetro a la suspensión de celda de 0,5 ml para alcanzar un volumen total de 1 ml.
    3. Romper celdas con 6 ciclos de vórtice a máxima intensidad de agitación durante 1 min intercalado con períodos de enfriamiento de 3 min sobre hielo.
    4. Haga un agujero delgado en la parte inferior del tubo con una cuchilla de bisturí calentada.
    5. Recoja el homogeneizado de células rotas a través de la parte inferior del tubo instalado en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml helado con un giro de baja velocidad de 10 s (~ 200 rpm).
      NOTA: Esto asegura que las perlas de sílice permanezcan en el tubo original.
    6. Centrifugar la célula homogeneizar a 5.156 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar restos celulares, células intactas y núcleos.
    7. Transfiera 450 μL de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga helado de 1,5 ml y agregue 1 ml adicional de HB helada complementada con PMSF fresco (1 mM).
      NOTA: Este paso de dilución es crítico para la recuperación de proteínas de membrana plasmática de alta calidad.
    8. Cosechar membranas plasmáticas a 17.968 x g durante 1 h a 4 °C y resuspender el pellet de membrana plasmática, mediante pipeteo repetido, en 100 μL de HB recién suplementado con 1 mM PMSF. Afloje el pellet celular para una homogeneización adecuada de la membrana plasmática agitando el pellet celular con la punta de la pipeta de 100 μL antes de liberar los 100 μL de HB y el pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
    9. Mida la concentración de proteínas de la preparación de la membrana plasmática con un kit de ensayo de proteínas que sea compatible con tampones que contengan agente reductor y detergente.
    10. Guarde las membranas plasmáticas a -80 °C o manténgalos en hielo para su uso inmediato.

4. Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

  1. Ensamble el aparato para preparar geles de poliacrilamida.
  2. Para dos geles separadores (poliacrilamida al 7%) mezclar 2,1 ml de acrilamida al 40%/bisacrilamida, 3 ml de tampón separador 4x (1,5 M Tris, dodecil sulfato de sodio al 0,4% [SDS] (p/v); pH 8,8) y 6,9 ml de ddH2O. Añadir 8 μL de tetrametilendiamina (TEMED) y 60 μL de persulfato de amonio al 10% (APS) para iniciar la polimerización de la acrilamida.
    PRECAUCIÓN: La acrilamida/bis-acrilamida es muy tóxica. Causa irritación de la piel, neuropatía periférica y es un carcinógeno. TEMED es perjudicial si se ingiere o inhala. APS es perjudicial si se ingiere. Causa irritaciones graves en los ojos y la piel.
  3. Vierta ~ 4-5 ml de esta mezcla en el aparato de gel ensamblado, hasta ~ 2 cm desde la parte superior.
  4. Coloque cuidadosamente ~ 1-2 ml de 0.1% SDS en la parte superior para crear un menisco plano.
  5. Deje que la poliacrilamida se establezca durante ~ 60 minutos en RT.
  6. Prepare una mezcla de gel de apilamiento para dos geles mezclando 0.5 mL de acrilamida al 40% / bis-acrilamida, 1 mL de tampón de apilamiento 4x (0.5 M Tris, 0.4% SDS (p/ v); pH 6.8) y 6.9 mL de ddH2O. Agregue 2 μL de TEMED y 30 μL de APS al 10% para iniciar la polimerización de acrilamida.
  7. Retire la capa de SDS al 0,1% del gel separador polimerizado y enjuague con ddH2O para eliminar los rastros de SDS.
  8. Vierta la mezcla de gel de apilamiento sobre el gel de separación.
  9. Coloque un peine en el gel de apilamiento y retire las burbujas de aire de alrededor del peine.
  10. Deje que el gel de apilamiento se establezca durante ~ 60 minutos en RT.
  11. Retire el peine y enjuague las ranuras de gel con agua. Coloque el gel en el tanque de gel y llene el tanque de gel hasta la parte superior con 1x tampón de funcionamiento (24.8 mM Tris, 190 mM de glicina, 0.1% SDS).
    NOTA: Prepare 1x búfer en ejecución a partir de un buffer stock 10x (248 mM Tris, 1,9 M de glicina, 1% SDS (p/v) en ddH2O) almacenado en RT.
  12. Mezcle muestras de membrana plasmática de 5-10 μL (es decir, 10-20 μg de proteína) con volúmenes iguales de colorante de carga de proteína 2x [120 mM Tris-HCl (pH 6.8), glicerol al 20%, azul de bromofenol al 0.02%, SDS al 4%, ditiothreitol (TDT) de 200 mM] y cargue inmediatamente en ranuras de gel individuales sumergidas en el tampón en funcionamiento.
    PRECAUCIÓN: La TDT es dañina si se ingiere. Causa irritaciones graves en los ojos y la piel.
    NOTA: Haga un caldo de 10 ml de 2x colorante de carga de proteínas, alícuota y guárdelo a -20 ° C. No caliente las muestras mezcladas, sino que las cargue inmediatamente en ranuras de gel individuales para que la etiqueta GFP no se desnaturaliza y se puedan detectar las señales de fluorescencia en el gel.
  13. Cargue los marcadores de peso molecular de la proteína (rango de 10-245 kDa) en una ranura separada para permitir la estimación del tamaño de fragmentos de proteínas individuales.
  14. Realice la electroforesis en gel a 200 V hasta que el tinte de carga azul llegue al fondo del gel (generalmente 45-55 min).
  15. Examine el gel para la fluorescencia GFP en gel con un sistema de imágenes en gel (las longitudes de onda de excitación y emisión son 475-485 nm y 520 nm, respectivamente).
  16. Después de las imágenes de fluorescencia en gel, fije las proteínas mediante una agitación suave del gel en ~ 10-20 ml de solución fijadora de gel de proteína (40% de etanol, 10% de ácido acético) durante 15 min a RT.
  17. Enjuague el gel dos veces durante 10 min con 10 ml de ddH2O y visualice las bandas de proteínas colocando el gel en una solución de tinción coloidal de Coomassie de 10 ml con agitación suave durante ~ 1 h en RT.
  18. Para una mejor visualización de las bandas de proteínas, desmanche el gel una o dos veces en ~ 20 ml de ddH2O durante ~ 1 h antes de grabar imágenes con el sistema de imágenes en gel.

5. Determinación de las actividades de CDR1 ATPasa 57

  1. Las muestras diluidas de membrana plasmática >2,2 mg/ml a 1-2 mg/ml en HB.
  2. Equilibrar el cóctel de ensayo ATPasa (75 mM MES-Tris, 75 mM de nitrato de potasio, 0,3 mM de molibdato de amonio, 7,5 mM de azida de sodio; pH 7,5) y Mg-ATP (28,8 mM de sal disódica atp, 28,8 mM MgCl2;pH 7,0) a 30 °C en una incubadora de 30 °C.
    PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxica.
    NOTA: Asegúrese de que todas las existencias tampón y botellas estén libres de fosfato; es decir, lavar la cristalería con 1% (vol/vol) HCl y enjuagar varias veces con ddH2O. Además, manténgalo separado de otros artículos de vidrio que probablemente contengan trazas de fosfato comúnmente presentes en los detergentes utilizados para lavar la cristalería.
  3. Añadir 90 μL de cóctel de ensayo con o sin inhibidor de la Cdr1-ATPasa (20 μM de oligomicina) en pozos individuales de una placa de microtitulación de 96 pozos.
    NOTA: El ensayo se realiza por triplicado.
  4. Agregue 5 μL de las membranas plasmáticas aisladas (~ 5-10 μg de proteína) o estándares de fosfato (0-100 nmoles Pi) en los pozos apropiados de la placa de microtitulación.
    NOTA: Mantenga la primera y la última columna para dos conjuntos separados de estándares de fosfato.
  5. Comience el ensayo agregando 25 μL de Mg-ATP de 28,8 mM precalentados (concentración final de 6 mM) con una pipeta multicanal en pozos individuales e incube a 30 °C durante 30 min.
  6. Detenga la reacción agregando 130 μL de reactivo de desarrollo (L-ascorbato de sodio al 1,6%, 1% SDS, molibdato de amonio al 12% en ácido sulfúrico 6 M).
    PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico concentrado reacciona violentamente con el agua. Es corrosivo y puede causar daño en la piel y los pulmones.
  7. Incubar en RT durante 10 min.
  8. Lea la absorbancia de los pozos de la placa de microtitulación a 750 nm con un lector de placas de microtitulación.
    NOTA: Apegarse al tiempo de incubación de 10 minutos para el desarrollo del tinte azul (es decir, un complejo reducido de fósforo-molibdeno) es fundamental para la precisión del ensayo porque el desarrollo del tinte azul continúa con el tiempo.
  9. Obtener la actividad atPasa específica de Cdr1 (es decir, la actividad ATPasa sensible a la oligomicina) restando la actividad atPasa en presencia de oligomicina de la actividad total de la ATPasa en ausencia de oligomicina.

6. Pantalla de detergente a pequeña escala

  1. Combinar las preparaciones de membrana plasmática (es decir, 2,5 mg de proteína de membrana plasmática) de células que sobreexpresan Cdr1-mGFPHis con tampón GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (p/v) glicerol; pH 7,5; recién suplementado con 1 mM PMSF] que contenga 5 mg del detergente de prueba, para alcanzar un volumen total de 0,5 ml suplementado con detergente al 1% (p/v).
  2. Gire la mezcla a 4-8 °C durante 2 h, con un dispositivo de rotación.
  3. Centrifugar la mezcla a 141.000 x g a 4 °C durante 1 h.
  4. Transfiera el sobrenadante que contiene material solubilizado a un tubo de microcentrífuga fresco.
  5. Agregue 0,5 ml de tampón GTED-20 suplementado con SDS al 2% (p/v) a la fracción de pellet insoluble e incube a 30 °C o/n en una incubadora de agitación para extraer toda la proteína de membrana insoluble en detergente.
  6. Analizar y comparar las fracciones de pellets sobrenadantes y solubilizadas por SDS-PAGE.
  7. Fotografíe geles que contengan proteínas marcadas con GFP para la fluorescencia de GFP en gel antes de la tinción de Coomassie y cuantifique los niveles de expresión con el sistema de imágenes.
  8. Utilice la fracción de proteína de membrana soluble para aplicaciones posteriores, como la cromatografía de exclusión de tamaño de fluorescencia (FSEC)58 para identificar detergentes adecuados.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se logró una alta frecuencia de transformación de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x10 4 transformadores/μg) con pYES2(Figura 2B). Como era de esperar, el control sin ADN (es decir, ddH2O solamente) no dio transformadores, y 1 μg del casete de transformación lineal CDR1-mGFPHis (Figura 1A)dio ~ 50 transformadores(Figura 2C)con el protocolo de transformación ADΔΔ optimizado. Los transformadores ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesar del progreso reciente en el análisis estructural de proteínas de membrana, actualmente no se dispone de una estructura 3D para Cdr1, o cualquier otro transportador PDR. Por lo tanto, obtener conocimiento de la estructura de Cdr1 y sus características bioquímicas es importante, ya que esto no solo proporcionará información sobre el diseño racional de nuevos medicamentos para superar la resistencia a los medicamentos mediada por el eflujo, sino también sobre el mecanismo de función de una importante subfamilia de p...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen la financiación del Fondo Marsden de Nueva Zelanda (Subvención UOO1305), y una subvención en bloque de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia (M. Niimi). Desean agradecer a la Universidad de Otago por proporcionar a G. Madani una beca de doctorado. Los autores también desean expresar su gratitud al profesor Stefan Raunser y sus colegas, el Dr. Amir Apelbaum y el Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por su apoyo y supervisión durante una visita de 6 meses de G. Madani al Instituto Max Planck de Fisiología Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemania. Los autores también agradecen al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) por proporcionar a G. Madani una beca de investigación (57381332) para visitar el MPIMP.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido 2-(N-Morfolino)etano-sulfónico (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris base; ultrapuro)Merck77-86-1
2,2-Didecilpropano-1,3-bis-β-D-maltopirranósidoAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexilpropano-1,3-bis-β-D-glucopiranósidoAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctilpropano-1,3-bis-β-D-maltopirranósidoAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propilciclohexil)-ciclohexilo &alfa;-D-maltopirranósidoGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrilamida/Bis-acrilamida (37.5:1)Bio-Rad1610148
Ácido acético (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium  009002-18-0
Molibdato de amonioSigma-Aldrich13106-76-8
Persulfato de amonio (APS)Bio-Rad1610700
Sal disódica ATPSigma-AldrichA-6419
Azul de bromofenolSERVA Electroforesis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMPara medioDCS0019
CSM menos uraciloPara medioDCS0161
Ciclohexil-1-butil-β-D-maltopirranósidoAnatraceC324SCYMAL-4
Ciclohexilo-1-heptilo-β-D-maltopiranósidoAnatraceC327SCYMAL-7
Ciclohexilo-metil-β- D-maltopirranósidoAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninaSigma-Aldrich11024-24-1
Ditiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSO Merck67-68-5
EtanolMerck459836
Etilendiaminotetraacético Ácido disódico sal (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Reactivo de limpieza de productosBiosystems aplicado78205Una mezcla de exonucleasa y fosfatasa
GlucosaFormedium50-99-7
Glicina
MerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Ácido clorhídricoMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Uso para PCR de colonias confiable
acetato de litio (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Cloruro de magnesio hexa-hidratosigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-decanoil-N-hidroxietil-glucamidaAnatraceH110SHEGA-10
n-decanoyl-N-metil-glucamidaAnatraceM320SMEGA-10
n-decil-fosfocolinaAnatraceF304SFos-colina-10
n-decil-β-D-maltopirranósidoAnatraceD322SDM
n-Dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonatoAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-dodecil-N,N-dimetilamina-N-óxidoAnatraceD360SLDAO
n-Dodecil-α-D-maltopirranósidoAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecil-β-D-maltopirranósidoAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonil-β-D-glucopiranósidoAnatraceN324SNG
n-Nonil-β-D-maltopirranósidoAnatraceN330SNM
n-Octadecil-N,N-dimetil-3-ammonio-1-propanosulfonatoAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonatoAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octil-fosfocolinaAnatraceF300SFos-colina-8
n-Octilo-β-D-glucopiranósidoAnatraceO311SOG
n-Tetradecil-fosfocolinaAnatraceF312SFos-colina-14
n-Tetradecilo-β-D-maltopiranósidoAnatraceT315STDM
n-Tridecil-fosfocolinaAnatraceF310SFos-colina-13
n-Tridecil-β- D-maltopirranósidoAnatraceT323S-n-Undecil
-β-D-maltopirranósidoAnatraceU300SUM (UDM)
n,n,n',n'-tetrametil-etilendiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctilfenoxipolietoxietanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomicinaSigma-Aldrich75351
Peptonaparamedio3049-73-7
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion  Hot Start Flex DNA PolymerasaNew England BiolabsM0535SADN polimerasa de alta fidelidad
polietilenglicol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polioxietilenosmonooleato de orbitánSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Nitrato de potasioSigma-AldrichP8394
Kit de ensayo de proteínasBio-Rad5000122Kit de ensayo de proteínas RC DC II
QC Tinción coloidal de CoomassieBio-Rad1610803
Prisma Escalera de proteínas ultra (10-245 kDa)AbcamAB116028
Azida sódicaSigma-Aldrich71289
Dodecil sulfato de sodioSigma-Aldrich151-21-3SDS
L-ascorbato de sodio BioXtraSigma-Aldrich11140
Sacarosa MonododecanoatoAnatraceS350SDDS
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich339741
Extracto de levaduraFormedium008013-01-2
Base nitrogenada de levadura sin aminoácidosFormediumCYN0402
  Equipo (tipo)
centrífuga  (Eppendorf 5804)Centrífuga Eppendorf
(Beckman Ultra)Beckman
(Sorvall RC6)Sorvall
FSEC (sistema de cromatografía NGC de media presión equipado con un detector de fluorescencia, un muestreador automático, un fraccionador)Bio-Rad
Imágenes en gel (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Lector de microplacas (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
(C1000 Touch)de alimentación Bio-Rad
(PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Incubadora de agitación Bio-Rad
(Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
Espectrofotómetro UV/visible (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd
Glicerol Merck 56-81-5 Centrífuga Aparato Termociclador PCR Fuente

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86(2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74(2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436(2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146(2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231(2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153(2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23(2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191(2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Expresi n de prote nas de membranaSaccharomyces cerevisiaetransportadores ABCetiqueta mGFPHiscribado de detergentescromatograf a de exclusi n molecularelectroforesis en gelsolubilizaci n de prote nas

Artículos relacionados