Seccionamiento óptico y visualización del disco intervertebral desde el desarrollo embrionario hasta la degeneración

Summary

Presentamos un método para investigar la organización espacial de los condrocitos en el anillo fibroso del disco intervertebral utilizando un método de seccionamiento óptico.

Abstract

La degeneración del disco intervertebral (IVD) es una de las principales causas de dolor lumbar y conlleva un alto grado de deterioro para los individuos afectados. Para decodificar la degeneración del disco y poder desarrollar enfoques regenerativos es esencial una comprensión profunda de la biología celular de la IVD. Un aspecto de esta biología que aún permanece sin respuesta es la cuestión de cómo las células están organizadas espacialmente en un estado fisiológico y durante la degeneración. Las propiedades biológicas del IVD y su disponibilidad hacen que este tejido sea difícil de analizar. El presente estudio investiga la organización espacial de los condrocitos en el anillo fibroso desde el desarrollo embrionario temprano hasta la degeneración en etapa terminal. Se aplica un método de seccionamiento óptico (Apotoma) para realizar análisis de tinción de alta resolución utilizando tejido embrionario bovino como modelo animal y tejido de disco humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía de columna. A partir de una densidad de condrocitos muy alta en el disco bovino embrionario temprano, el número de células disminuye durante la gestación, el crecimiento y la maduración. En los discos humanos, un aumento en la densidad celular acompañó la progresión de la degeneración tisular. Como ya se había demostrado en el cartílago articular, la formación de grupos representa un rasgo característico de la degeneración avanzada del disco.

Introduction

El disco intervertebral (IVD) es una estructura basada en cartílago que bioquímicamente y con respecto a la arquitectura celular, a primera vista, se asemeja en muchos aspectos al cartílago articular¹. De hecho, tanto la degeneración ivD como la osteoartritis (OA) del cartílago articular se caracterizan por el estrechamiento del espacio articular debido al desgaste del cartílago, el quiste subcondral y la formación de osteofitos, y la esclerosis subcondral^2,3. A pesar de estas aparentes similitudes, la arquitectura y el papel funcional de ambos tejidos difieren. Mientras que la matriz d....

Protocol

Para el análisis del desarrollo embrionario y la maduración se utilizaron discos bovinos. Para evaluar la degeneración de la IVD, se analizaron muestras humanas.

El tejido IVD humano se obtuvo de pacientes sometidos a cirugía por degeneración del disco lumbar, prolapso de disco o trauma espinal en el Departamento de Cirugía Ortopédica del Hospital Universitario de Tübingen y el Centro de Trauma BG Tübingen. La aprobación completa del comité ético se obtuvo antes del inicio del estudio (proyecto número 244/2013BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la participación. Los métodos se llevaron a ....

Results

Usando imágenes de mosaico, la arquitectura del IVD con su densa red de fibra de colágeno en el anillo y el núcleo más blando se puede reconocer claramente (Figura 4). Se puede observar una disminución continua de la densidad celular durante el desarrollo embrionario (Figura 5). Mientras que en las primeras etapas del desarrollo de la IVD se puede encontrar una densidad celular de 11.435 células/mm² en el anulus fibroso bovino y 17.426 células/mm² en el núcleo p.......

Discussion

Utilizando microscopía de fluorescencia aumentada por imágenes de mosaico y seccionamiento óptico, evaluamos la disposición espacial de los condrocitos en el anillo de la IVD lumbar durante todo el desarrollo, la maduración y la degeneración. Si bien se podía extraer tejido degenerativo de pacientes que recibían cirugía de columna vertebral para la degeneración del disco, el análisis del período embrionario y la fase de maduración requería el uso de un organismo modelo (bovino). Se observaron altas densidades celulares e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anfotericina B	Merck KGaA,  Alemania	A2942
Portaobjetos de microscopio de adherencia SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, Alemania	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemania	462000115
AxioVision Rel. 4.8 con Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemania
CellMask Tinción de seguimiento de actina Thermo	Fischer Scientific, EE. UU	A57249
Criostato	Leica Biosystems, EE. UU.	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, EE. UU	D1306
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Alemania	41966052
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich, EE. UU	60004
Miscoscopio de fluorescencia - Axio Observer Z1 con Axio Cam MR3 y Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemania	3834000604
Formaldehído	Merck KGaA,  Alemania	104002
Imagen J 1.53a, con complemento de contador	de células National Insittute of Health (NIH), EE. UU.
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, EE. UU	A12380
Cubreobjetos microscópicos	R. Langenbrinck, Alemania	01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker	Science Sevices  GmbH, Alemania	N71310
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich, EE. UU.	P4333
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich,EE. UU.	P5119
Bisturí	pf medical AG, Alemania	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compuesto	Sakura Finetek, Países Bajos	SA6255012