Adquisición de datos de resonancia magnética funcional en estado de reposo en la rata

Resumen

Este protocolo describe un método para obtener datos estables de resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) de una rata que utiliza dosis bajas de isoflurano en combinación con dosis bajas de dexmedetomidina.

Resumen

La resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) se ha convertido en un método cada vez más popular para estudiar la función cerebral en un estado de reposo, sin tareas. Este protocolo describe un método de supervivencia preclínica para obtener datos de rs-fMRI. La combinación de dosis bajas de isoflurano con la infusión continua del agonista del receptor adrenérgico α₂ dexmedetomidina proporciona una opción sólida para la adquisición de datos estable y de alta calidad, al tiempo que preserva la función de la red cerebral. Además, este procedimiento permite la respiración espontánea y una fisiología casi normal en la rata. Se pueden combinar secuencias de imágenes adicionales con la adquisición de estado de reposo creando protocolos experimentales con estabilidad anestésica de hasta 5 h utilizando este método. Este protocolo describe la configuración del equipo, el monitoreo de la fisiología de la rata durante cuatro fases distintas de la anestesia, la adquisición de escaneos en estado de reposo, la evaluación de la calidad de los datos, la recuperación del animal y una breve discusión del análisis de datos posterior al procesamiento. Este protocolo se puede utilizar en una amplia variedad de modelos preclínicos de roedores para ayudar a revelar los cambios resultantes en la red cerebral que ocurren en reposo.

Introducción

La resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) es una medida de la señal dependiente del nivel de oxígeno en la sangre (BOLD) cuando el cerebro está en reposo y no participa en ninguna tarea en particular. Estas señales se pueden utilizar para medir las correlaciones entre las regiones del cerebro para determinar la conectividad funcional dentro de las redes neuronales. rs-fMRI es ampliamente utilizado en estudios clínicos debido a su no invasividad y la baja cantidad de esfuerzo requerido de los pacientes (en comparación con la fMRI basada en tareas) por lo que es óptimo para diversas poblaciones de pacientes¹.

Los avances tecnológicos han permitido adaptar la rs-fMRI para su uso en modelos de roedores para descubrir los mecanismos subyacentes a los estados de enfermedad (ver referencia² para su revisión). Los modelos animales preclínicos, incluidos los modelos de enfermedad o knockout, permiten una amplia gama de manipulaciones experimentales no aplicables en humanos, y los estudios también pueden hacer uso de muestras post mortem para mejorar aún más los experimentos². Sin embargo, debido a la dificultad tanto para limitar el movimiento como para mitigar el estrés, la adquisición de resonancia magnética en roedores se realiza tradicionalmente bajo anestesia. Los agentes anestésicos, dependiendo de su farmacocinética, farmacodinámica y objetivos moleculares, influyen en el flujo sanguíneo cerebral, el metabolismo cerebral y potencialmente afectan las vías de acoplamiento neurovascular.

Ha habido numerosos esfuerzos para desarrollar protocolos anestésicos que preserven el acoplamiento neurovascular y la función de la red cerebral^3,4,5,6,7,8. Anteriormente informamos de un régimen anestésico que aplicaba una dosis baja de isoflurano junto con una dosis baja del agonista del receptor adrenérgico α₂ dexmedetomidina^9. Las ratas bajo este método de anestesia exhibieron respuestas BOLD robustas a la estimulación del bigote en regiones consistentes con las vías de proyección establecidas (núcleos talámicos ventrolaterales y ventromediales, corteza somatosensorial primaria y secundaria); Las redes cerebrales de estado de reposo a gran escala, incluida la red de modo predeterminado^10,11 y la red de prominencia¹² también se han detectado constantemente. Además, este protocolo anestésico permite repetir las imágenes en el mismo animal, lo que es importante para controlar la progresión de la enfermedad y el efecto de las manipulaciones experimentales longitudinalmente.

En el presente estudio, detallamos la configuración experimental, la preparación animal y los procedimientos de monitoreo fisiológico involucrados. En particular, describimos las fases anestésicas específicas y la adquisición de exploraciones durante cada fase. La calidad de los datos se evalúa después de cada exploración en estado de reposo. También se incluye en la discusión un breve resumen del análisis posterior a la exploración. Los laboratorios interesados en descubrir el potencial del uso de rs-fMRI en ratas encontrarán útil este protocolo.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron en un escáner de resonancia magnética de 9.4 T y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Dartmouth College. Se obtuvo una aprobación adicional para grabar y mostrar los animales utilizados en el video y las figuras a continuación.

1. Preparativos antes del escaneo

1. Línea de infusión subcutánea
   1. Retire parcialmente una aguja de 23 G de su paquete para que el punto de la aguja permanezca estéril.
   2. Sostenga de forma segura el cubo de la aguja y use una cuchilla de afeitar para marcar el eje de la aguja donde se encuentra con el cubo.
   3. Sujete un soporte de aguja alrededor del eje directamente debajo de la puntuación y rompa suavemente el eje del cubo.
   4. Inserte 1/3 del eje de la aguja (extremo romo) en la línea PE50 previamente esterilizada con suficiente longitud de línea para extenderse desde la bomba de medicamento hasta el animal dentro del orificio del imán.
2. Dilución de dexmedetomidina y atipamezol
   1. Preparar una solución de clorhidrato de dexmedetomidina diluido utilizando 0,5 ml de caldo de 0,5 mg/ml mezclado con 9,5 ml de solución salina estéril en un frasco de vidrio transparente y estéril (concentración diluida = 0,025 mg/ml).
   2. Preparar una solución de atipmezol diluido utilizando 0,1 ml de caldo de 5 mg/ml mezclado con 9,9 ml de solución salina estéril en un frasco de vidrio transparente y estéril (concentración diluida = 0,05 mg/ml).
3. Parámetros de escaneo
   1. Utilice los parámetros presentados en la Tabla 1 para preparar secuencias de escaneo.

2. Anestesia de fase 1: inducción y preparación animal

1. Arreglo
   1. Asegúrese de que todo el equipo esté encendido y funcione correctamente, incluido el mezclador de oxígeno y aire, la almohadilla térmica y el sistema de eliminación activa (consulte la Figura 1).
   2. Ajuste el punto de ajuste de temperatura del sistema de calefacción a 37,5 °C.
2. Inducción animal
   1. Coloque al animal (rata macho Sprague Dawley de 90 días de edad) en la cámara de inducción e induzca anestesia con isoflurano al 2,5% en aire enriquecido con oxígeno al 30%.
      NOTA: Se puede utilizar una amplia gama de edades de animales y ambos sexos.
   2. Una vez que el animal esté anestesiado, retírelo de la cámara, pese al animal y colóquelo en el cono de la nariz (al 2,5% de isoflurano) en la almohadilla térmica en el espacio de preparación.
3. Preparación animal
   1. Aplique ungüento lubricante oftálmico en cada ojo para evitar el secado.
   2. Confirme la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta de pellizco del dedo del dedo del dedo del día.
   3. Use clippers para afeitar un área cuadrada de 2 "por 2" en la región lumbar inferior de la espalda del animal (es decir, directamente sobre la cola).
   4. Administrar 0,015 mg/kg de la solución de dexmedetomidina con una inyección intraperitoneal (p.p.) (por ejemplo, una rata de 300 g recibiría 0,18 ml) en el cuadrante inferior derecho del abdomen utilizando una aguja de 25 G.
   5. Cambie el flujo de isoflurano desde el espacio de preparación a la cuna del animal.
   6. Mueva al animal a la cuna del animal. Coloque los dientes frontales de la rata de forma segura sobre y de la barra de mordida. Empuje el cono de la nariz sobre la nariz para asegurar un ajuste apretado.
      NOTA: Si el cono de la nariz no cubre la mandíbula inferior, use una película de parafina para mantener suavemente la mandíbula cerrada mientras se sella alrededor del cono de la nariz.
   7. Coloque la almohadilla respiratoria debajo del abdomen de la rata debajo de la caja torácica y vuelva a colocarla hasta que la forma de onda de la respiración muestre un canal profundo centrado en cada respiración (consulte la forma de onda de la respiración en la Figura 2).
   8. Monitoree la respiración del animal utilizando el software de monitoreo de fisiología. Pase a la siguiente fase de la anestesia cuando la respiración sea inferior a 40 respiraciones/min (lpm; aproximadamente 5 min después de la inyección de dexmedetomidina).

3. Anestesia de fase 2: configuración animal

1. Inserte barras para los oídos en el canal auditivo para estabilizar la cabeza de la rata en la cuna del animal. Una vez colocado, tire hacia adelante de la barra de mordida y confirme que la cabeza no se mueva. Reajuste el cono de la nariz y la película de parafina según sea necesario (consulte la Figura 3a).
2. Inserte la sonda de temperatura en una cubierta de sonda desechable prelubricado. Inserte suavemente la sonda de temperatura aproximadamente 1/2 "en el recto y péguela con cinta adhesiva a la base de la cola con cinta médica.
3. Coloque el clip del oxímetro de pulso en el área metatarsiano del pie trasero, asegurándose de que la fuente de luz esté en la parte inferior del pie (palma).
   NOTA: La rotación del clip puede afectar a la señal; por lo tanto, crear un soporte para mantener la pata y el clip en posición vertical conducirá a una mayor estabilidad. También tenga en cuenta que hasta que la rata esté a temperatura corporal normal, la saturación de oxígeno puede ser baja (<95%).
4. Utilice el peso de la rata para calcular la velocidad de perfusión para expulsar 0,015 mg/kg/h de dexmedetomidina (una rata de 300 g recibe 0,18 ml/h).
5. Configure la bomba de medicamento para expulsar la velocidad de infusión calculada.
6. Llene una jeringa de 3 ml con la solución estéril de dexmedetomidina diluida e inserte la punta de la aguja en el extremo abierto de la línea de infusión esterilizada (que se extiende desde la bomba del medicamento hasta la cuna del animal con la aguja subcutánea previamente conectada). Llene la línea y asegure la jeringa en el soporte de la jeringa de la bomba de medicamentos.
7. Mueva el bloque de empuje hacia adelante hasta que toque el émbolo y el medicamento se expulse a la aguja, asegurando que la línea de infusión esté completamente llena.
8. Con una toallita con alcohol, limpie el área afeitada para eliminar cualquier vello perdido.
9. Pellizque la piel aproximadamente dos dedos de ancho por encima de la base de la cola. Inserte 1/3 de la aguja de la línea de infusión en la piel de la tienda.
10. Asegure la aguja a la piel con un trozo de cinta médica ancha de 3". Coloque un segundo trozo de cinta médica ancha sobre el primero, a través de la rata, y unido a ambos lados de la cuna del animal (ver Figura 4).
    NOTA: Es de vital importancia que la aguja ferromagnética esté bien asegurada para evitar el movimiento durante la exploración.
11. Comience la infusión de dexmedetomidina subcutánea.
12. Coloque un trozo de gasa en el puente de la nariz de la rata para crear una superficie nivelada para la bobina. Use cinta de papel, que no interfiera con la señal de resonancia magnética, para asegurar la bobina a la cabeza de la rata, centrándola sobre el cerebro (ver Figura 3b,c).
13. Asegure todas las líneas y cables dentro de la cuna del animal con cinta de laboratorio y verifique si todas las señales de fisiología son estables (ver Figura 2).
14. Coloque toallas de papel sobre el animal, asegurándolas a la cuna del animal con cinta de laboratorio. Si usa un sistema de calentamiento de aire, envuelva una lámina de plástico alrededor de toda la cuna para contener el aire caliente.
15. Mueva al animal hacia el orificio y ajuste el imán.

4. Anestesia de fase 3: adquisición de exploración anatómica

1. Reducir el isoflurano al 1,5%, lo que resulta en un aumento constante de la respiración a aproximadamente 45-50 lpm. Permanecer en este nivel durante la duración de la exploración anatómica.
2. Utilice el escáner localizador FLASH para asegurarse de que el cerebro está alineado con el isocentro magnético(Figura 5a). Reposicione al animal y repita si es necesario.
3. Ejecute el escaneo del localizador RARE de mayor resolución y use esta salida de escaneo para alinear 15 cortes sagitales centrados en todo el cerebro (de izquierda a derecha, Figura 5b).
4. Usando la rebanada sagital media, alinee la rebanada axial central con la decusación de la comisura anterior, que aparece como una mancha oscura (Figura 5c). Anote el desplazamiento de división que se utilizará más adelante en los análisis de estado de reposo.
5. Adquiera 23 cortes utilizando los protocolos axiales FLASH y RARE para ayudar en el registro en un espacio común durante el análisis posterior al escaneo.
6. Shim a través de todo el cerebro usando la secuencia PRESS.

5. Fase 4: Adquisición de escaneo de estado en reposo

1. Después de completar las exploraciones anatómicas, reduzca el isoflurano a 0.5% a 0.75%, ajustando para que la respiración del animal sea de 60-65 respiraciones por minuto. Permanezca en este nivel durante al menos 10 minutos antes de comenzar el escaneo en estado de reposo para garantizar la estabilidad.
2. Cuando la fisiología es estable (el rango de respiración es de 60-75 lpm sin jadeos ni irregularidades, la temperatura corporal central es de 37.5 ± 1.0 ° C y la saturación de oxígeno es del 95% o más), adquiera una exploración EPI de 15 cortes utilizando el mismo desplazamiento de corte que la serie axial anatómica.
3. Una vez completado cada análisis en estado de reposo, compruebe la calidad mediante un análisis de componentes independiente (ICA) para descomponer los datos en componentes espaciales y temporales.
4. Obtenga al menos tres exploraciones de estado de reposo de alta calidad.

6. Recuperación posterior al escaneo

1. Cuando se complete la exploración, aumente el isoflurano al 2% y detenga la infusión subcutánea de dexmedetomidina.
2. Retire la cuna del animal del orificio del imán, desenvuelva al animal y retire las barras para los oídos, la sonda de temperatura, el clip del oxímetro de pulso y la aguja de dexmedetomidina.
3. Inyecte 0,015 mg/kg de la solución diluida de atipmozol en el músculo de la pata trasera de la rata utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G (es decir, una rata de 300 g recibiría 0,09 ml).
4. Coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa encima de una almohadilla térmica y monitoree hasta que el animal sea ambulatorio.

Resultados

Después de cada análisis de estado de reposo, la estabilidad se evalúa mediante un análisis de componentes independiente (ICA; script de ejemplo incluido en Archivos suplementarios). La figura 6 muestra ejemplos de salidas de componentes de análisis de estado de reposo. La figura 6a muestra un componente de señal de un escaneo con alta estabilidad. Tenga en cuenta que espacialmente, el componente tiene una alta regionalidad. Dentro del curso de ...

Discusión

La estabilidad del animal, tanto física como fisiológicamente, es clave para obtener datos de estado de reposo de alta calidad. Este protocolo logra la estabilidad al pasar por cuatro fases distintas de la anestesia. Es imperativo que el animal haya alcanzado los umbrales fisiológicos establecidos antes de pasar a la siguiente fase de la anestesia; dado que este método se basa en mecanismos fisiológicos de autorregulación, los animales individuales pueden requerir cantidades de tiempo ligeramente diferentes en cada fase ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
9.4T	MRI Varian/Bruker		Varian actualizado con la consola Bruker que ejecuta el software Paravision 6.0.1
Mezclador de aire-oxígeno	Sechrist	Modelo 3500CP-G
Análisis de NeuroImágenes Funcionales (AFNI)	NIMH/NIH	Versión AFNI_18.3.03	Disponible gratuitamente en: https://afni.nimh.nih.gov/
Cuna de animales	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	soporte para ratas con barra de mordida, cono de nariz y barras para las orejas
Fisiología Animal Monitoreo & Sistema de compuerta	SAII	Modelo 1025	Sistema compatible con RM que incluye saturación de oxígeno, temperatura, respiración y oximetría de pulso de fibra óptica
complemento Antisedán (clorhidrato de atipamezol)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Fabricante Artículo #10000449
Tijeras cerámicas seguras para resonancia magnética	MRIequip.com	MT-6003
Clippers	Patterson Veterinary	07-882-1032	Kit combinado de recortadora de retoque Wahl, Artículo del fabricante #09990-1201
Dexmedesed (clorhidrato de dexmedetomidina)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Productos Veterinarios, Artículo del fabricante#17033-005-10
Fundas de termómetro rectal digital	Medline	MDS9608
Biblioteca de software FMRIB		FMRIB MELODIC Versión 3.15	Disponible gratuitamente en: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating Pad	Cara Inc.	Modelo 50
Pinzas de hemostático, rectas	Kent Scientific	INS750451-2
Isoflurano	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Etiqueta privada, fabricante Artículo #14043-0704-06
Vaporizador de isoflurano	VetEquip Inc.
Cinta de laboratorio, 3/4"	VWR International	89097-990
, calibre 23	BD	305145	cubo de plástico retirado
Película de laboratorio Parafilm	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Artículo del fabricante #HSFHS234526A
Bobina de superficie plana	Bruker	T12609	2cm
Polietileno Tubo	Braintree Scientific	PE50 50FT	0.023" (diámetro interior), 0.038" (diámetro exterior)
Pomada oftálmica Puralube	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Fabricante Artículo #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
Solución salina estéril al 0,9%	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Fabricante Artículo #14208186
Almohadillas estériles de preparación con alcohol Medline		MDS090735
Cinta quirúrgica, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "cinta médica ancha"
Cinta quirúrgica de papel blanco, 1/2" (microporo 3M)	Medline	MMM15300	3M Healthcare
Jeringas, 1 mL con aguja de calibre 25	BD	309626
Jeringas, 3 mL	BD	309657
Sistema de inducción y barrido ventilado	VetEquip Inc.	942102	Cámara de inducción de 2 litros con depuración
		411724	caudalímetro
		931600	cubo de barrido, cono de nariz "al vacío 921616
			sin reinhalación