Preparación de muestras para el análisis bioinformático de la metilación del ADN: estrategia de asociación para la obesidad y estudios de rasgos relacionados

Resumen

El presente estudio describe el flujo de trabajo para gestionar los datos de metilación del ADN obtenidos por las tecnologías de microarrays. El protocolo muestra pasos desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos. Todos los procedimientos se describen en detalle, y el video muestra los pasos significativos.

Resumen

La obesidad está directamente relacionada con el estilo de vida y se ha asociado con cambios en la metilación del ADN que pueden causar alteraciones en la adipogénesis y los procesos de almacenamiento de lípidos que contribuyen al desarrollo de la enfermedad. Demostramos un protocolo completo desde la selección hasta el análisis epigenético de datos de pacientes con y sin obesidad. Todos los pasos del protocolo fueron probados y validados en un estudio piloto. 32 mujeres participaron en el estudio, en el que 15 individuos fueron clasificados con obesidad según el Índice de Masa Corporal (IMC) (45,1 ± 5,4 kg/^m2); y 17 individuos fueron clasificados sin obesidad según el IMC (22,6 ± 1,8 kg/^m2). En el grupo con obesidad, se identificaron 564 sitios de CpG relacionados con la masa grasa mediante análisis de regresión lineal. Los sitios de CpG estaban en las regiones promotoras. El análisis diferencial encontró 470 CpGs hipometilados y 94 sitios hipermetilados en individuos con obesidad. Las vías enriquecidas más hipometiladas fueron en el RUNX, la señalización WNT y la respuesta a la hipoxia. Las vías hipermetiladas se relacionaron con la secreción de insulina, la señalización de glucagón y ^Ca2+. Concluimos que el protocolo identificó efectivamente los patrones de metilación del ADN y la metilación del ADN relacionada con los rasgos. Estos patrones podrían estar asociados con la expresión génica alterada, afectando la adipogénesis y el almacenamiento de lípidos. Nuestros resultados confirmaron que un estilo de vida obesogénico podría promover cambios epigenéticos en el ADN humano.

Introducción

Las tecnologías ómicas a gran escala se han utilizado cada vez más en estudios de enfermedades crónicas. Una característica interesante de estos métodos es la disponibilidad de una gran cantidad de datos generados para la comunidad científica. Por lo tanto, ha surgido una demanda para estandarizar los protocolos para permitir la comparación técnica entre estudios. El presente estudio sugiere la estandarización de un protocolo para obtener y analizar datos de metilación del ADN, utilizando un estudio piloto como ejemplo aplicado.

El gasto energético negativo predomina en los estilos de vida humanos modernos, lo que lleva a una acumulación excesiva de tejido adiposo y, en consecuencia, al desarrollo de obesidad¹. Muchos factores han aumentado las tasas de obesidad, como el sedentarismo, las dietas altas en calorías y las rutinas estresantes. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que 1.900 millones de adultos eran obesos en 2016, lo que significa que más del 20% de la población mundial tiene más de 30 kg / ^m2 de ^IMC2. La actualización más reciente de 2018 reveló que la prevalencia de obesidad en los Estados Unidos de América (EE.UU.) era superior al 42%³.

La epigenética es la adaptación estructural de las regiones cromosómicas para registrar, señalar o perpetuar estados de actividad ^alterados4. La metilación del ADN es una alteración química reversible en los sitios de dinucleótidos de citosina-guanosina (sitios CpG), formando 5-metilcitosina-pG (5mCpG). Puede modular la expresión génica regulando el acceso de la maquinaria de transcripción al ADN5,6,7,8. En este contexto, es esencial comprender qué sitios de CpG están asociados con rasgos relacionados con la ^obesidad9. Muchos factores pueden apoyar o prevenir la metilación del ADN específica del sitio. Las enzimas necesarias para este proceso, como las metiltransferasas ^{de ADN10} (DNTM) y las translocaciones de diez-once (TETs), pueden promover la metilación o desmetilación del ADN bajo exposiciones ^{ambientales11}.

Teniendo en cuenta el creciente interés en los estudios de metilación del ADN en los últimos años, la elección de la estrategia de análisis más adecuada para responder con precisión a cada pregunta ha sido una preocupación esencial de los investigadores12,13,14. La matriz de metilación de ADN 450K es el método más popular, utilizado en más de 360 ^{publicaciones14} para determinar el perfil de metilación de ADN. Puede determinar la metilación de hasta 485.000 CpGs localizados en el 99% de los genes ^conocidos15. Sin embargo, esta matriz ha sido descontinuada y reemplazada por la EPIC, cubriendo 850,000 sitios CpG. El presente protocolo se puede aplicar tanto para 450K como para EPIC16,17,18.

El protocolo se presenta paso a paso en la Figura 1 y comprende los siguientes pasos: selección de población, muestreo, preparación de experimentos, tubería de metilación de ADN y análisis bioinformático. Aquí se demuestra un estudio piloto realizado en nuestro laboratorio para ilustrar los pasos del protocolo propuesto.

Figura 1: Esquema del protocolo presentado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

El comité de ética del Hospital Universitario De la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto de la Universidad de São Paulo (HCRP-USP) aprobó el estudio (CAAE:14275319.7.0000.5440). Los participantes firmaron el formulario de consentimiento, y todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo la Declaración de Helsinki.

1. Población y muestreo

1. Reclutar participantes con IMC >30 kg/^m2 para el estudio. Para el presente estudio se reclutaron 32 mujeres de una población ^mixta19 entre 18 y 60 años de edad.
   NOTA: En el HCRP-USP, se observaron mayores tasas de obesidad principalmente en ^mujeres20. Los participantes con obesidad, con IMC ≥30 kg/^m2 (n = 15), fueron reclutados del ambulatorio de Enfermedades Metabólicas en HCRP-USP. Los participantes sin obesidad, con IMC entre 18,5 kg/^m2 y 24,9 kg/^m2 (n = 17), fueron reclutados de otras clínicas y no tenían enfermedades graves; los datos clínicos se muestran en la Tabla 1.
2. Excluir a las mujeres embarazadas, las madres lactantes, las fumadoras y consumir alcohol.

2. Antropometría y composición corporal

1. Mide el peso de los participantes utilizando una báscula antropométrica digital de 200 kg. Asegúrese de quitarse los zapatos y el exceso de ropa.
2. Evalúe la altura utilizando un estadiómetro con una graduación de 0,5 cm. Se instruyó a los participantes a permanecer descalzos, con los pies juntos y los brazos a los ^lados21.
3. Recopile la información de la masa grasa (FM) utilizando una bioimpedancia eléctrica. Después de 12 h de ayuno, evaluar con la vejiga urinaria vacía. Coloque a los participantes en posición supina, con las piernas separadas y los brazos paralelos sin tocar el cuerpo. Indique a los participantes que retiren todos los accesorios ^metálicos22.
4. Obtenga la circunferencia de la cintura (WC) utilizando una cinta métrica inextensible con una graduación de 0,1 mm. La cinta se colocó horizontalmente alrededor de la cintura media, justo encima de los huesos de la cadera. La medición ocurrió justo después de una exhalación. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), el límite de WC para las mujeres es de 88 ^cm23.

Tabla 1: Características de la población. Todas las variables fueron paramétricas (p > 0,05, Shapiro Wilk), y las diferencias se evaluaron mediante una prueba t independiente, en la que p < 0,05 se consideró significativa. *p < 0,0001. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Recogida de material biológico

1. Recolectar sangre periférica después de 12 h de ayuno, como se describió ^{anteriormente24}.
2. Recolecte 4 ml de las muestras de sangre total en tubos de recolección con anticoagulante (por ejemplo, EDTA) y guárdelas en hielo para su transporte.

4. Extracción de ADN

1. Centrifugar cada tubo que contiene la sangre a 2.000 x g durante 10 min. Recoger alrededor de 300 μL de la capa buffy (interfase blanca).
2. Extraer ADN de la sangre periférica utilizando un instrumento disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), como se describió ^{anteriormente25}. Elute el ADN en 480 μL de _H2O ultrapuro.
3. Evalúe la concentración y la calidad del ADN utilizando un fluorómetro. La integridad se evaluó mediante un análisis de gel de agarosa al 1%²⁵. Conservar en congelador a -80 °C.

5. Preparación antes del análisis de metilación

1. Asegúrese de que las muestras tengan la concentración mínima de ADN (500 ng es la entrada inicial ideal para comenzar), pero la dilución puede variar entre las muestras en este paso.
2. Algunos reactivos no están incluidos en el kit de ^{microarrays26}, así que cómpralos por ^separado27.
3. Compruebe si el kit contiene todos los reactivos utilizados durante el procedimiento; son insustituibles. Compruebe la fecha de caducidad de todos los reactivos. Asegúrese de que otros reactivos y soluciones no proporcionados en el kit también estén disponibles (95% formamida / 1 mM EDTA, 0.1 N NaOH, etanol absoluto, 2-propanol).
   PRECAUCIÓN: La formamida es un reactivo volátil; la calidad de los resultados se puede mejorar si el producto es fresco. La integridad y la calidad de la formamida y el etanol absoluto se consideran críticas porque pueden afectar el proceso de tinción propuesto por el fabricante. Los alcoholes elegidos deben ser productos ultrapuros específicos para el análisis de biología molecular.
4. Una vez adquirido el kit de microarrays, descargue los Mapas de Decodificación de Chips (DMAP). Esos archivos están disponibles en el sitio web del fabricante las 24-48 horas después del envío del kit y se excluyen en la fecha de ^{vencimiento28}. Para descargar los archivos mencionados, realice los pasos a continuación.
   1. Asegúrese de que haya una computadora con acceso a Internet disponible. Realice la descarga utilizando el cliente de archivos de decodificación de software.
   2. Antes de instalar el programa, asegúrese de que la computadora tenga acceso saliente y entrante otorgado por la institución; el cliente de archivos de decodificación no tiene restricciones de seguridad.
   3. Inicie sesión en el software Decode File Client utilizando la opción Access by BeadChip. Este inicio de sesión se realiza utilizando el ID de usuario y la contraseña de MyIllumina. Es necesario registrarse en esta ^página28.
   4. Después de iniciar sesión en el cliente de archivos de decodificación, ingrese la información que se enumera a continuación en sus respectivos campos en la página de inicio del ^software28: Lista de códigos de barras; Lista de identificadores de caja; Número de orden de compra (PO); y Número de pedido de ventas (recuerde no incluir las letras que siguen a los números).
   5. Seleccione los DMAP que desea descargar según el número de código de barras en el cuadro de compra y especifique el destino en el cuadro de diálogo para guardar los DMAP.
   6. Haga clic en el botón para iniciar la descarga.
      NOTA: Al final de la descarga, asegúrese de que las carpetas descargadas no estén vacías y almacene los archivos de forma segura, ya que serán necesarios para el paso final para convertir los experimentos a archivos de datos de intensidad (archivos IDAT). Después de la fecha de caducidad, Illumina puede eliminar los datos DMAP de su base de datos en línea.

6. Tubería de metilación del ADN

NOTA: El experimento de metilación del ADN se divide en 4 días (Figura 1). Siga las recomendaciones y especificaciones del fabricante para obtener resultados precisos.

1. Día 1: Tratamiento con bisulfito
   1. Comience desnaturalizando 500 ng de ADN genómico, luego agregue los reactivos de conversión. Para realizar este paso, siga las recomendaciones de los kits de bisulfito y ^microarray29.
   2. Tratar el ADN desnaturalizado con 130 μL del reactivo de conversión de bisulfito a la concentración estándar proporcionada por el fabricante.
   3. Incubar el tubo en un termociclador durante 16 ciclos a 95 °C durante 30 s y 50 °C durante 1 h. Baje el termociclador a 4 °C durante 10 min.
   4. Realice el paso de lavado agregando 100 μL del tampón de lavado y luego centrifugando a toda velocidad durante 30 s. La concentración no se proporciona en la guía del usuario, y el fabricante estandariza los volúmenes.
      NOTA: Este reactivo viene con el kit y no necesita ser diluido o preparado.
2. Día 2: Amplificación - Ensayo de metilación, Protocolo manual
   1. Precaliente el horno de hibridación a 37 °C y deje que la temperatura se equilibre.
   2. Aplique una etiqueta de código de barras a una microplaca de 0,8 ml.
   3. Descongele los reactivos de amplificación (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix y Multi-Sample Amp Master Mix) a temperatura ambiente (esos reactivos vienen con el kit y no necesitan ser diluidos o preparados). Luego, realice una inversión suave al menos 10 veces hasta que se mezcle todo el contenido de los tubos.
   4. Dispensar 20 μL de la mezcla de amplificación multimuestra 1 (MA1) en los pocillos de la placa.
   5. Transfiera 4 μL de la muestra de ADN de la placa convertida de bisulfito a los pocillos correspondientes en la placa de 0,8 ml. En este punto, registre la identificación de la muestra de ADN original en el formulario de seguimiento de laboratorio correspondiente a los pocillos de la placa.
   6. Dispensar 4 μL de 0,1 N NaOH en cada pocillo de la placa que contenga la Mezcla de Amplificación Multimuestra 1 (MA1) y la muestra de ADN.
   7. Selle la placa con un sello de plástico.
   8. Vórtice la placa para mezclar los reactivos con las muestras a 1.600 rpm durante 1 min. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente y retirar con cuidado el sello.
   9. Pipete 68 μL de Mezcla aleatoria de imprimación (RPM) en cada pocillo de la placa. Pipetear 75 μL de Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) en cada pocillo de la placa (sin quitar la solución anterior). Use un sello nuevo para cubrir la placa.
      NOTA: Tenga cuidado de combinar los pozos con la placa y orientarla correctamente.
   10. Vórtice la placa sellada a 1.600 rpm durante 1 min. Incubar en el horno de hibridación durante 20-24 h a 37 °C.
3. Día 3: Hibridación - Ensayo de metilación, Protocolo manual
   1. Precaliente el bloque a 37 °C.
   2. Descongele el contenido del tubo a temperatura ambiente. Invierta cuidadosa y suavemente los tubos de la Solución de Fragmentación (FMS) al menos 10 veces para mezclar bien el contenido.
   3. Retire con cuidado la placa del horno de hibridación. Centrífuga por pulsos de la placa a 280 x g.
   4. Ahora retire el sello de la placa. En cada pocillo de la placa que contenga una muestra, agregue 50 μL de solución de fragmentación (FMS) y selle la placa nuevamente. Vórtice la placa a 1.600 rpm durante 1 min.
   5. Centrifugar la placa a 280 x g durante unos segundos (realizar centrifugación por pulsos). Luego, coloque la placa sellada en el bloque calefactor a 37 ° C durante 1 h.
   6. Si se decidió pausar el experimento y congelar la placa, descongelarla a temperatura ambiente y centrifugarla a 280 x g. Si no está congelado, omita este paso y vaya al paso 6.3.7.
   7. Deje que el bloque calefactor se precaliente a 37 °C.
   8. Deje que el tampón de lavado se descongele a temperatura ambiente. Cuando se descongele, invierta al menos 10 veces para mezclar el contenido.
   9. Retire el sello de la placa.
   10. Añadir 100 μL de solución de precipitación (PM1) a cada pocillo de la placa que contenga muestras.
   11. Selle la placa de nuevo con el sello.
   12. Vórtice la placa a 1.600 rpm durante 1 min.
   13. Incubar a 37 °C durante 5 min.
   14. Luego, coloque en la centrífuga de pulso a 280 x g durante 1 min.
       NOTA: Ajuste la centrífuga a 4 °C para el siguiente paso.
   15. Retire con cuidado el sello de la placa y deséchelo.
   16. Añadir 300 μL de 2-propanol (100%) a cada pocillo que contenga la muestra.
   17. Selle la placa con extremo cuidado con un nuevo sello. Tenga cuidado de no agitar el plato.
   18. Invierta la placa al menos 10x, mezclando todo el contenido.
   19. Incubar a 4 °C durante 30 min.
   20. Centrifugadora a 3.000 x g a 4 °C durante 20 min.
       NOTA: Al final del paso 6.3.20, retire inmediatamente la placa de la centrífuga.
   21. Retire el sello de la placa y deséchelo.
   22. Invierta rápidamente la placa y escurra el líquido en una almohadilla para desechar el sobrenadante. Luego, golpee el plato en un área seca sobre una toalla de papel para drenar el líquido.
   23. Toque firmemente varias veces durante 1 minuto o hasta que todos los pozos estén libres de líquido.
   24. Deje la placa invertida y descubierta durante 1 h a temperatura ambiente.
       NOTA: Se espera ver pellets azules en el fondo de los pozos.
   25. Precalentar el horno de hibridación a 48 °C.
   26. Encienda el bloque de calor para precalentarlo. Espere 20 minutos para este proceso.
   27. Solución de resuspensión, hibridación y lavado de descongelación a temperatura ambiente. Invierta al menos 10x. Compruebe que no hay sal precipitada en la solución.
   28. Agregue 46 μL de solución de resuspensión, hibridación y lavado (RA1) a cada pocillo de la placa.
       NOTA: Los reactivos restantes deben reservarse para los pasos de tinción e hibridación.
   29. Aplique el sello a la placa. Use un sello de aluminio para cubrir la placa. Sostenga con fuerza para realizar el sellado de manera uniforme.
   30. Compruebe si todos los pozos están cerrados de forma segura para evitar la evaporación.
   31. Coloque cuidadosamente la placa recién sellada en el horno de hibridación e incube a 48 °C durante 1 h.
   32. Vórtice la placa a 1.800 rpm durante 1 min.
   33. Centrífuga de pulso a 280 x g.
   34. Transfiera la placa al bloque de calor a 95 °C durante 1 h.
   35. Prepare las cámaras de hibridación (Hyb) colocándolas juntas. Dispensar 400 μL de tampón humidificador (PB2) en los depósitos de las cámaras Hyb. Coloque la tapa inmediatamente.
   36. Cargue cada muestra de la placa en la abertura de entrada de muestra del microarray.
   37. Cargue los insertos de la cámara Hyb que contienen los microarrays en la cámara Hyb. Cierre la cámara Hyb transversalmente para evitar posibles desplazamientos de la cámara Hyb.
       NOTA: Las cámaras Hyb deben incubarse a 48 °C durante al menos 16 h, pero no más de 24 h.
4. Día 4: Tinción - Ensayo de metilación, Protocolo manual
   1. Resuspend la Solución de Tinción 4 con 330 mL de 100% EtOH, obteniendo un volumen final de 350 mL. Agite vigorosamente el frasco staining Solution 4 para asegurar una resuspensión completa. Mantener a temperatura ambiente.
      NOTA: Staining Solution 4 se puede almacenar hasta 2 semanas a una temperatura entre 2 °C y 8 °C.
   2. Retire las cámaras del horno de hibridación y deje que se enfríen en el banco durante 30 minutos antes de abrirlas.
   3. Mientras la cámara Hyb se está enfriando, llene dos recipientes de lavado con Wash Buffer (200 ml por contenedor de lavado). Recuerde etiquetar cada recipiente como "Wash Buffer" (PB1 y PB2).
   4. Llene los accesorios de alineación de microarrays con 150 ml de wash buffer.
   5. Separe los espaciadores de plástico y, si es necesario, limpie el vidrio.
   6. Para lavar las correderas de microarrays, conecte el bucle de alambre a la rejilla y sumerja el equipo de goteo en los contenedores con 200 ml de Wash Buffer para un total de 10x.
   7. Retire todos los insertos de la cámara de hibridación y retire cada matriz de los insertos. Retire el sello.
      NOTA: Durante la extracción, no toque las matrices expuestas.
   8. Al retirar los portaobjetos de microarrays de la cámara de hibridación, tenga cuidado de no derramar nada.
   9. Lave los microarrays en la solución tampón de lavado (PB1) lenta y ligeramente, moviéndose hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Pase a una solución de PB1 fresca y realice el lavado moviendo lentamente los microarrays 10 veces hacia arriba y hacia abajo en la solución.
   10. Retire el microarray del recipiente y confirme la ausencia de residuos.
   11. Utilice un espaciador transparente en la parte superior de cada microarray y guíe los espaciadores a las posiciones correspondientes.
       NOTA: Tenga cuidado de usar solo los espaciadores transparentes, no los blancos.
   12. Coloque la barra de alineación en el accesorio de alineación.
   13. Coloque una placa posterior de vidrio en la parte superior del espaciador transparente; tenga cuidado de cubrir todo el microarray. Luego, conecte abrazaderas de metal a las cámaras de flujo. Si es necesario, use tijeras para recortar los extremos de los espaciadores de la cámara de flujo.
   14. Lave inmediatamente los depósitos de la cámara de hibridación con _ddH2O y frote con un pequeño cepillo de limpieza. No permita que ningún tampón humidificador permanezca en el depósito.
   15. Pase al siguiente paso que es responsable de la micromatriz de extensión y tinción.
       NOTA: Deje todas las cámaras de flujo montadas horizontalmente en el banco del laboratorio. Solo vuelva a manipularlos cuando todo el paso de tinción esté listo. Caliente la solución de resuspensión, hibridación y lavado a una temperatura entre 20 °C y 25 °C. Mezcle suavemente hasta que no se vea ningún cristal en la solución.
   16. Coloque los reactivos en un bastidor en secuencia. Si alguno está congelado, déjelos a temperatura ambiente y luego invierta al menos 10 veces para mezclar las soluciones.
   17. Llene el circulador de agua al nivel apropiado.
   18. Encienda la bomba y ajuste la temperatura a 44 °C.
   19. Retire las burbujas que estén unidas al bastidor de la cámara.
   20. Realice pruebas en el bastidor de la cámara utilizando una sonda de temperatura. Todos los lugares probados deben estar entre 44 °C ± 0,5 °C.
       NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse sin interrupción.
   21. Cuando el bastidor alcance una temperatura de 44 °C, coloque rápidamente cada conjunto en la cámara de flujo.
       NOTA: Para los siguientes pasos, pipetee todos los reactivos en la placa de vidrio posterior.
   22. Pipeta 150 μL de solución de resuspensión, hibridación y lavado (RA1). Luego, incubar durante 30 min. Repita este paso un total de 5 veces.
   23. Pipetear 450 μL de Solución de Tinción 1 (XC1) e incubar durante 10 min.
   24. Pipetear 450 μL de Solución de Tinción 2 (XC2) e incubar durante 10 min.
   25. Pipete 200 μL de Two-Color Extension Master Mix (TEM) e incube durante 15 min.
   26. Pipetear 450 μL de formamida al 95%/1 mM EDTA e incubar durante 1 min. Repetir dos veces.
   27. Incubar durante 5 min.
   28. Disminuya la temperatura del bastidor de la cámara a 32 °C (indicado en Superior Two-Color Master Mix).
   29. Pipetear 450 μL de Solución de Tinción 3 (XC3) e incubar durante 1 min. Repetir 1x.
   30. Espere a que el bastidor de la cámara alcance la temperatura correcta.
       NOTA: Para leer la imagen de microarray inmediatamente después del proceso de coloración, encienda el escáner en esta etapa.
   31. Ahora dispense 250 μL de Superior Two-Color Master Mix (STM), seguido de una incubación de 10 minutos.
   32. Luego, dispense 450 μL de Solución de Tinción 3 (XC3), seguido de 1 min de incubación. Repita 1x.
   33. Espere 5 minutos y luego agregue 250 μL de mezcla maestra antimanchas de 2 colores (ATM) e incube durante 10 minutos.
   34. Ahora dispense 250 μL de Superior Two-Color Master Mix (STM), seguido de una incubación de 10 minutos.
   35. Luego, dispense 450 μL de Solución de Tinción 3 (XC3), seguido de 1 min de incubación. Repita 1x.
   36. Espere 5 min.
   37. Añadir 250 μL de Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) e incubar durante 10 min.
   38. Añadir 450 μL de Stain Microarray Solution 3 (XC3) e incubar durante 1 min, luego repetir de nuevo.
   39. Espere 5 min.
       NOTA: Realice el siguiente esquema de repetición: Paso 6.4.34., Paso 6.4.35. y paso 6.4.36.; Paso 6.4.37., 6.4.38.y Paso 6.4.39.; Paso 6.4.34., Paso 6.4.35. y Paso 6.4.36.
   40. Ahora, retire inmediatamente las cámaras de flujo del bastidor y colóquelas con cuidado horizontalmente en el banco del laboratorio. Asegúrese de que la temperatura sea ambiental.
   41. 6.4.41.Coloque 310 ml de solución de lavado (PB1) por cada microarray en un recipiente de lavado.
   42. Retira las abrazaderas metálicas y el cristal, y por último, el microarray.
   43. Coloque los microarrays en una rejilla de tinción y colóquelos en el recipiente de lavado que contenga 10x solución de PB1. Asegúrese de que los códigos de barras estén mirando hacia afuera de quien los esté manipulando y que todos los microarrays estén sumergidos.
   44. Muévete lenta y ligeramente con movimientos hacia arriba y hacia abajo 10x. El microarray debe eliminarse por completo de la solución antes de sumergirse nuevamente. Luego, deja que permanezca sumergido durante 5 min.
   45. Agite vigorosamente el reactivo Stain Solution 4 (XC4) para asegurar la resuspensión total. Coloque 310 ml de XC4 en un recipiente de lavado.
       NOTA: No deje que la solución repose en el recipiente de lavado durante más de 10 minutos.
   46. Mueva ligeramente el soporte de tinción al otro recipiente con XC4.
   47. Muévete lenta y ligeramente con movimientos hacia arriba y hacia abajo 10x. Asegúrese de que el microarray se elimine por completo de la solución antes de volver a sumergirse.
   48. Luego, deje que el microarray permanezca sumergido durante 5 minutos.
   49. Mueva el soporte de tinción fuera de la solución y colóquelo en un soporte de tubo con los códigos de barras hacia arriba.
   50. Retire con cuidado el microarray con pinzas de bloqueo y colóquelas en un estante para que se sequen.
   51. Séquelos con el desecador al vacío durante 50-55 min a 675 mm Hg (0,9 bar).
   52. Limpie la parte posterior de cada microarray usando EtOH.
       PRECAUCIÓN: Evite tocar las rayas y no permita que etOH gotee sobre las rayas de ninguna manera.
   53. Proceda a obtener la imagen del microarray.
   54. Guarde cuidadosamente el microarray en una caja de almacenamiento a temperatura ambiente.
       NOTA: Las imágenes de microarrays deben tomarse dentro de las 72 h.

7. Análisis bioinformático

NOTA: Es necesario cambiar algunos atributos del tipo de microarray (por ejemplo, arraytype = "450k" debe reemplazarse por arraytype = "EPIC"). El autor de la canalización ChAMP describe en detalle todos los campos que deben modificarse para analizar matrices en la página Bioconductor del ^paquete30.

1. Hoja de muestra
   1. Transfiera los archivos IDAT al ordenador para proceder con el análisis ^{bioinformático31}. Cree una hoja de muestra para llevar a cabo el análisis de ^datos31.
      NOTA: Tres columnas son esenciales para este archivo de hoja de cálculo. La primera es Sample_name. Esta columna debe incluir los nombres o códigos utilizados para identificar las muestras. El segundo es el Sentrix_position. Esta columna coloca el R01C01 correspondiente de las muestras, siendo R01 responsable de la fila de chip y la columna denominada C01. La tercera columna esencial es la Sentrix_ID, y se encarga de recibir el número que identifica el microarray. Asegúrese de poner los números correctos. Es posible agregar otra información en la hoja de muestra como valores variables. En el presente experimento, se incluyeron datos del análisis de metales.
2. Canalización ChAMP
   1. Instale RStudio (V.4.0.2) en el equipo para realizar el ^análisis30.
      NOTA: Asegúrese de que el equipo tiene un mínimo de 8 G de RAM. El análisis de datos tendrá dificultades o se bloqueará con una menor cantidad de RAM.
   2. Después de la instalación, abra RStudio e instale el paquete ChAMP ^{Bioconductor30} utilizando la línea de comandos respectiva (consulte Material complementario 1).
      NOTA: Si hay algún error al final de la instalación, instale las bibliotecas ChAMP necesarias manualmente, una por ^una26.
   3. Ahora, importe los datos sin procesar y realice el análisis. Véase el material complementario 1.
      champ.load() importa los datos en bruto y realiza el proceso de filtrado, excluyendo sondas con pval de baja detección, sitios multihit, sondas no CG, sitios CpG cerca de SNP y CpG ubicados en cromosomas sexuales.
      champ.impute() realiza la imputación KNN como predeterminada.
      campeón. QC recupera gráficos de calidad de datos (por ejemplo, gráfico de diagrama de densidad).
      campeón. SVD evalúa los efectos por lotes en función de los metadatos proporcionados en la hoja de muestra.
      champ.refbase() realiza la estimación y corrección del tipo de célula.
      campeón. DMP( ) recupera posiciones diferencialmente metiladas y asociaciones de rasgos como la masa grasa para verificar la metilación del ADN entre grupos y cambiar los parámetros, como se muestra en el Material Suplementario 1.
3. Enriquecimiento (String DB)
   NOTA: El enriquecimiento funcional se utiliza para inferir las funciones biológicas de un conjunto de genes.
   1. Para enriquecer los datos de una cadena, seleccione la lista de destinos que desea enriquecer y utilizar como entrada desde: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
   2. Para el organismo, seleccione homo sapiens y pulse el botón Buscar.
   3. Para navegar por el enriquecimiento, haga clic en el botón Análisis.
4. Envío GEO
   1. Deposite los datos en un repositorio público como geo de NCBI. Para ello, regístrese en la cuenta de remitente.
      NOTA: Complete el envío geo (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) descargando la hoja de metadatos con información descriptiva y protocolos para el experimento general y las muestras individuales. Los envíos de archivos GEO se pueden crear en cualquier software de hoja de cálculo. En segundo lugar, agregue el archivo de datos sin procesar generado a partir del script de recuento de cell-ranger para todas las bibliotecas en el directorio. IDAT y los archivos asociados o una hoja de cálculo de matriz contienen datos no normalizados. La tercera carpeta son los archivos de datos procesados. La tabla matricial es una hoja de cálculo que contiene los valores finales normalizados comparables entre filas y muestras y preferiblemente procesados como se describe en cualquier manuscrito adjunto.
   2. Coloque los archivos de datos procesados generados a partir del script de recuento de cell-ranger para todas las bibliotecas en el directorio. Utilice las credenciales del servidor FTP del remitente GEO para transferir el directorio que contiene los tres componentes.

Resultados

Después de usar la tubería ChAMP, se consideraron 409,887 sondas en el análisis después de todos los filtros (CpG no calificados, sondas no CG, CpG cerca de SNP, sitios multihit y CpG relacionados con XY); un esquema está representado en la Figura 2.

Figura 2: Pipeline of the bioinformatics analysis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, la gráfica de densidad reveló que todas las muestras tenían densidades similares de la distribución beta relacionadas con los pasos de control de calidad. Este análisis evalúa la distribución de los valores beta y señala si hay alguna muestra que deba excluirse. En este lote, no se excluyeron muestras basadas en este análisis.

Figura 3: Gráfico de densidad de valores beta obtenido con el paquete ChAMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El análisis de descomposición del valor singular (SVD) se utilizó para verificar los componentes principales que influyeron significativamente en la variabilidad de los datos de metilación del ADN. Los datos revelaron que el IMC, la CC (p < 1e10-5) y la FM (p < 0,05) tuvieron un efecto significativo en la variabilidad de los datos (Figura 4).

Figura 4: Análisis de descomposición de valores singulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La estimación del tipo de célula reveló que tanto las células asesinas naturales (NK) como las células B eran más altas en las mujeres obesas (Figura 5).

Figura 5: Fracciones celulares estimadas por el método de Houseman. Gran: granulocitos. CD4T: célula T auxiliar, linfocito. CD8T: célula t citotóxica, linfocito. Mono: monocito. Célula B: Linfocito B. NK: células asesinas naturales, linfocitos. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los niveles de metilación del ADN entre mujeres obesas y no obesas difirieron antes y después de la corrección del tipo celular. Antes de la corrección de los datos de metilación del ADN para los tipos de células, se observaron 43.463 posiciones metiladas diferencialmente (DMP), y 3.329 CpG permanecieron significativas después. 445 sitios cpG estaban en regiones intergénicas (IGR), y 2.884 estaban en regiones génicas, con la mayoría en la región promotora (n = 1.438). La distribución a lo largo de todas las regiones fue TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), primer exón (n = 273), cuerpo (n = 724) y 3'UTR (n = 59). Considerando los valores de Δβ <-0,05 y >0,05, 162 CpG fueron hipometilados y 576 hipermetilados en individuos obesos en comparación con individuos no obesos (Figura 6). Los datos están disponibles en la base de datos GEO bajo el código de registro GSE166611.

Figura 6: Posiciones diferencialmente metiladas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Es posible evaluar la diferente metilación entre grupos y encontrar sitios de CpG asociados con rasgos específicos en estudios de metilación. Para los estudios de masa grasa, se encontraron 13,222 sitios de CpG. 6.159 CpG en la región promotora se relacionaron con la masa grasa, con 470 hipermetilados y 94 hipometilados (Figura 7), y los genes respectivos fueron enriquecidos (Tabla 2).

Figura 7: Regiones promotoras de genes hipometilados e hipermetilados, independientemente relacionados con la masa grasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 2: Enriquecimiento funcional de los genes de los sitios CpG diferencialmente metilados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Material complementario 1: Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Las matrices de metilación del ADN son los métodos más utilizados para acceder a la metilación del ADN debido a su relación ^{costo-beneficio14}. El presente estudio describió un protocolo detallado utilizando una plataforma de microarrays disponible comercialmente para evaluar la metilación del ADN en un estudio piloto realizado en una cohorte brasileña. Los resultados obtenidos del estudio piloto confirmaron la efectividad del protocolo. La Figura 3 muestra la comparabilidad de la muestra y la conversión completa de bisulfito32.

Como paso de control de calidad, el algoritmo ChAMP recomendó la exclusión de sitios CpGs durante el proceso de filtrado. El objetivo de excluir las sondas es mejorar el análisis de datos y eliminar el sesgo. Los CpG de baja calidad (valores de p inferiores a 0,05) se eliminaron para eliminar el ruido experimental en el conjunto de datos. Los objetivos permanecieron superados en el análisis de la gráfica de densidad. ^Zhou33 describió la importancia de filtrar los CpG cerca de los SNP para evitar desajustes, la mala interpretación de la metilación de las citosinas polimórficas y la causa del cambio de color del diseño de la sonda tipo ^I34. Además, como los cromosomas XY se ven afectados diferencialmente por la impronta, Heiss y ^Just35 reforzaron la importancia de filtrar esas sondas porque, en las mujeres, los problemas con la hibridación pueden ser factores de ^confusión35.

La fecha de vencimiento de los DMAP, la fecha de apertura de la formamida, la calidad analítica del etanol absoluto y los recuentos totales de leucocitos se consideran pasos críticos en el protocolo.

Además, según nuestras observaciones, la estimación del tipo celular es esencial para realizar el análisis bioinformático. El método Houseman realiza la estimación del tipo de célula como se describe en el estudio de ^Tian30. Este método se basa en 473 sitios específicos de CpG que pueden predecir los porcentajes de los tipos de células más importantes, como granulocitos, monocitos, células B y células ^T36. Utilizamos la función recomendada "myRefbase" del paquete ChAMP. Después de la estimación, el algoritmo ChAMP ajusta los valores beta y elimina este sesgo del conjunto de datos. Este paso es crucial en los estudios centrados en la obesidad porque esta población tiene una diferencia considerable en los glóbulos blancos debido a su estado inflamatorio crónico.

Solo cambiamos el mapa de tapa original para el sello PCR común con respecto a la modificación del método y la solución de problemas. Después de cada proceso de centrifugación, el sello se cambió por uno nuevo. No pudimos usar el sellado térmico estándar y lo adaptamos usando papel de aluminio alrededor de la placa.

Aunque los ensayos comerciales se han considerado un estándar de oro para los estudios epigenéticos, una limitación del protocolo podría ser la especificidad de los reactivos y equipos de una marca única37,38,39,40. Otra limitación es la falta de indicadores que permitan identificar el correcto avance del ^{experimento41}.

La estandarización del presente protocolo representa una gran guía para la investigación epigenética, reduciendo los errores humanos durante el proceso y permitiendo un análisis de datos exitoso y la comparabilidad entre diferentes estudios.

Según nuestros resultados, los experimentos de metilación del ADN son adecuados para estudios que comparan individuos con y sin ^obesidad43. Además, el análisis bioinformático propuesto proporcionó datos de alta calidad y podría considerarse en estudios a gran escala.

Utilizando el análisis de SVD, identificamos que los rasgos relacionados con la obesidad (IMC, WC y FM) influyeron en la variabilidad en los datos de metilación del ADN. Como resultado significativo, la estimación del tipo celular indica que tanto las células asesinas naturales (NK) como las células B fueron más altas en las mujeres con obesidad que en las mujeres sin obesidad (Figura 5). Los mayores recuentos de esas células podrían explicarse por el estado inflamatorio de bajo grado de estos ^individuos44. Observamos que los pacientes con obesidad tienen CpG hipo e hipermetilados en regiones promotoras de genes asociados con la masa grasa. La mayoría de los sitios estaban hipometilados, lo que podría estar relacionado con el aumento natural de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en estos individuos. Esta condición de estrés oxidativo puede promover la perturbación de guanina en el sitio de dinucleótido, formando 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG), lo que resulta en un sitio de dinucleótido de 5mCp-8-OHdG y causa el reclutamiento de enzimas TET. Todos estos eventos podrían ser responsables de promover la hipometilación e hipermetilación del ADN por diferentes mecanismos de ^acción45.

Además, la tasa de adipogénesis parece aumentar en individuos con obesidad, con aproximadamente un 10% de células nuevas a células ^viejas46,47. Los aportes epigenéticos, enfatizando el ambiente obesogénico, pueden alterar las tasas de proliferación y diferenciación de las células, favoreciendo el desarrollo de la masa ^grasa48. Los cambios epigenéticos también pueden afectar a los programas adipogénicos, facilitando o restringiendo su desarrollo. Los factores de transcripción primarios (PPARγ o C/EBPα) o el ensamblaje de complejos multiproteicos, posicionados en regiones promotoras aguas abajo operadas por incluir o excluir enzimas modificadoras epigenéticas, regulan la expresión génica a través de hiper o hipometilación45. La vía PPARγ se ha descrito previamente para alterar la vía WNT, que tenía genes enriquecidos en este estudio. Aunque todavía se desconoce cómo se produce la señalización de WNT durante la adipogénesis, estudios recientes han reportado que podría tener un papel esencial en el metabolismo de los adipocitos, particularmente en condiciones obesogénicas49.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol absoluto	J.T. Baker	B5924-03
Gel de agarosa	Kasvi	K9-9100
Bioimpedancia eléctrica	Quantum BIA 450 Q - Sistema
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Kit de metilación-oro	ZymoResearch, Irvine, CA, EE. UU	D5001
Formamida	Sigma	F9037
FMS— Solución de fragmentación	Illumina	11203428	Reactivos suministrados
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brazil	AS4500
MA1— Amplificación multimuestra 1 mezcla	Illumina	11202880	reactivos suministrados
MicroAmp película adhesiva óptica Thermo	Fisher Scientific	201703982
MSM— Mezcla maestra de amplificación multimuestra	Illumina	11203410	reactivos suministrados
NaOH	F. MAIA	114700
PB1— Reactivo utilizado para preparar BeadChips para la hibridación	Illumina	11291245	reactivos suministrados
PB2— Tampón humidificador utilizado durante la hibridación	Illumina	11191130	Reactivos suministrados
2-propanol	Emsure	10,96,34,01,000
RA1— Solución de resuspensión, hibridación y lavado	Illumina	11292441	reactivos suministrados
RPM— Mezcla de cebadores aleatorios	Illumina	15010230	reactivos suministrados
STM— Reactivos superiores de mezcla maestra bicolor	Illumina	11288046	suministrados
TEM— Extensión de dos colores Master Mix	Illumina	11208309	reactivos suministrados
EDTA	Invitrogen	ultrapuro 155576-028
Placa de reacción de 96 pocillos con código de barras (0,1 ml)	ByoSystems	4346906
Placa de reacción de 96 pocillos con código de barras (0,8 ml)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1— XStain BeadChip solución 1	Illumina	11208288	Reactivos suministrados
XC2— XStain BeadChip solution 2	Illumina	11208296	Reactivos suministrados
XC3— XStain BeadChip solution 3	Illumina	11208392	Reactivos suministrados
XC4— XStain BeadChip solución 4	Illumina	11208430	reactivos suministrados