Summary
Denne protokol til immunfluorescerende mærkning af både plantevirusproteiner og vektorinsektproteiner i udskårne insekttarme kan bruges til at studere interaktioner mellem virus- og vektorinsekter, insektproteinfunktioner og molekylære mekanismer, der ligger til grund for virusoverførsel.
Abstract
De fleste plantevirus i naturen overføres fra en plante til en anden af hemipteran insekter. En høj populationstæthed af vektorinsekterne, der er yderst effektive til virusoverførsel, spiller en central rolle i virusepidemier på marker. Undersøgelse af virus-insektvektorinteraktioner kan fremme vores forståelse af virusoverførsel og epidemier med det formål at designe nye strategier til bekæmpelse af plantevira og deres vektorinsekter. Immunofluorescensmærkning er blevet brugt i vid udstrækning til at analysere interaktioner mellem patogener og værter og bruges her i den hvidryggede planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt overfører den sydlige ris sorte stribede dværgvirus (SRBSDV, slægten Fijivirus, familie Reoviridae), for at lokalisere virioner og insektproteiner i midgutepitelcellerne. Ved hjælp af laserscanningskonfokalmikroskopi studerede vi de morfologiske egenskaber ved midgutepitelceller, cellulær lokalisering af insektproteiner og colokalisering af virioner og et insektprotein. Denne protokol kan bruges til at studere virusaktiviteter i insekter, funktioner af insektproteiner og interaktioner mellem virus og vektorinsekt.
Introduction
De mest beskrevne plantevira overføres af insekter fra rækkefølgen Hemiptera, der inkluderer bladlus, hvidfluer, løvhopper, plantehoppere og thrips 1,2. De piercing-sugende munddele af hemipteran insekter gennemborer plantevævet til fodring og udskillelse af spyt, samtidig med at virussen overføres effektivt2. Forskellige transmissionsmekanismer af plantevirus af vektorinsekter er blevet beskrevet. Disse omfatter ikke-vedvarende, semipersistente og vedvarende. Den persistente type er enten ikke-propagativ eller propagativ3,4, men for begge disse typer skal den overførte virus bevæge sig gennem insektets krop. I den vedvarende formeringstilstand inficerer vira oprindeligt og replikerer i epitelcellerne i insektets tarm, spredes derefter i forskellige væv og til sidst ind i spytkirtlerne, hvorfra de derefter kan indføres i en plante gennem spyt under insektfodring 5,6. Persistente overførte vira bevæger sig gennem forskellige organer og replikerer i deres insektvektorer, hvilket kræver specifikke interaktioner mellem virus- og vektorkomponenter på forskellige stadier 7,8.
Virale proteiner og insektproteiner skal interagere for at lette kritiske processer til virusgenkendelse, infektion, replikation eller spredning i vektorinsekterne 9,10. Selvom optisk mikroskopi kan bruges til at observere cellulære strukturer i insekter, kan den ikke vise virionfordeling, cellulær lokalisering eller colokalisering af virale proteiner og insektprotein eller ultrastrukturen af insektvæv og celler. Immunofluorescensmærkning blev først udført af Coons et al. i musens fagocytiske celler ved hjælp af mærkning af specifikke fluoresceinantistoffer, og nu bruges den bredt11. Immunofluorescensteknikken, også kendt som fluorescensantistofteknikken, er en af de tidligste immunologiske mærkningsteknikker, der er udviklet og er baseret på den specifikke bindingsreaktion mellem antigenet og antistoffet11,12. Det kendte antistof mærkes først med fluorescein, som bruges som sonde til at detektere de tilsvarende antigener i cellerne eller vævene13,14. Efter at det fluoresceinmærkede antistof binder til det tilsvarende antigen i celler eller væv, udsender sonden lys fluorescens, når den bestråles med excitationsbølgelængder og ses med et fluorescensmikroskop for at lokalisere antigenet15.
De fleste vektorinsekter af plantevirus er hemipteraner. En højere populationstæthed af vektorinsekter, der har en høj transmissionseffektivitet for plantevirussen, kan føre til virusepidemier5. Sydlig ris sort stribet dværgvirus (SRBSDV, slægt Fijivirus, familie Reoviridae), en af de mest alvorlige patogener af ris, har hurtigt spredt sig over risdyrkningsområder i Øst- og Sydøstasien og forårsaget alvorlige udbyttetab siden 201016,17. Voksne og nymfer af den hvidryggede planthopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) overfører SRBSDV til ris på en vedvarende-formidlende måde med høj effektivitet. Feltundersøgelser har vist, at udbrud af SRBSDV-induceret ris sort stribet dværgsygdom normalt falder sammen med massemigration over lange afstande af WBPH'er, en afgørende faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikelassocieret membranprotein 7 (VAMP7) er en opløselig N-ethylmaleimidfølsom faktorbindingsproteinreceptor (SNARE), som kan formidle transport af stoffer via vesikelfusion. VAMP7 interagerer med det ydre store capsidprotein i SRBSDV in vitro, hvilket indikerer, at VAMP7 kan være tæt forbundet med virusoverførsel16.
I protokollen, der præsenteres her, udskar vi tarmen fra viruliferous WBPH som et eksempel til at mærke SRBSDV-virioner og VAMP7 i midgut-epitelceller16. Som det første invasionssted for virus spiller midgutepitelet afgørende roller i virusinfektion, replikation og transmission. Først detaljerede vi trinene til at punktafgifter tarmen fra nymfer og voksne af WBPH'er. For det andet brugte vi specifikke fluoresceinmærkede antistoffer til at mærke SRBSDV-virioner og VAMP7 i tarmepitelceller. Derefter observerede vi epitelceller og den cellulære placering af virionerne og VAMP7 via et laserscanningskonfokalmikroskop. Resultaterne viste, at SRBSDV-virioner og VAMP7 kunne colokalisere i cytoplasmaet i midgut-epitelcellerne, hvilket tyder på, at VAMP7's specifikke funktion kan være relateret til spredning af virioner fra midgut-epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nonviruliferous insektopdræt
- Saml WBPH'er fra rismarker og bagside med risplanter i 1 L glasbægre dækket med insektsikkert net i en inkubator ved 28 °C med 16 timers lys og 8 timers mørke. Fordi SRBSDV ikke overføres via æg, er nyklækkede nymfer ikke viruliferous.
- Med en børstepen børstes insekter forsigtigt fra bægerglasset, der opdrætter insekter, til et nyt bægerglas med friske risplanter hver uge, indtil WBPH-nymfer er klækket. Fortsæt med at opdrætte disse klækkede nonviruliferous nymfer til 2- eller 3-instar.
BEMÆRK: Børst forsigtigt for at undgå, at WBPH'er flyver fra bægerglasset eller beskadiger dem.
2. Virusopsamling og indsamling af viruliferous insekter
- Overfør ikke-viruliferous insekter fra glasbægrene til friske SRBSDV-inficerede risplanter, der er dækket af et insektsikkert net i en 2d viruserhvervelsesadgangsperiode (AAP) ved fodring på planter. Saml derefter insekterne i glasbægerglas, der indeholder friske risplanter.
- Efter 2 d samles insekterne fra glasbægre med en manuel aspirator til dissektion og udskæring af tarmen.
BEMÆRK: Den mindste AAP for SRBSDV er 5 min for både WBPH-nymfer og voksne, men insekterne skal have lov til at fodre på friske SRBSDV-inficerede risplanter i 2 d for at opnå erhvervelseseffektiviteten på op til 80%.
3. Fremstilling af reagens
- 8,5 g NaCl, 3,5 g Na2HPO4·12H 2 O og 0,25 gNaH2PO4opløses i 1 ml ddH2O for at fremstille 0,01 M opløsning af phosphatbufret saltvand (PBS).
- Der tilsættes 4 g paraformaldehyd til 100 ml PBS for at fremstille 4% (m/v) paraformaldehyd i PBS.
- Tilsæt 2 ml Triton X-100 i 98 ml PBS for at forberede 2% (v / v) Triton X-100.
4. Dissektion af voksne og udskæring af tarme
- Brug en pipette til at placere 100 μL PBS på et glasglas. Placer diaset på scenen i et optisk mikroskop.
- Saml de SRBSDV-inficerede voksne fra glasbægre med en manuel aspirator og læg dem i 1,5 ml rør. Placer rørene på is for at lamme insekter, og overfør derefter en lammet voksen til 100 μL PBS på diaset med maven opad.
BEMÆRK: Insekterne bliver grundigt lammet efter 5 min på is. - Brug pincet i den ene hånd til at klemme kroppen, og fjern derefter hovedet med et andet sæt pincet i den anden hånd.
- Klem siderne af maven med et sæt pincet og klem ovipositoren eller det copulatoriske organ i halen med det andet sæt. Træk derefter den intersegmentale membran i et abdominalsegment forsigtigt væk og udsæt langsomt tarmen i maven.
- Fortsæt med at rive membranen væk og træk gradvist hele tarmen ud af maven. Træk forsigtigt halen af, som er forbundet med enden af tarmen, for at fjerne hele tarmen.
BEMÆRK: Træk meget forsigtigt, ellers vil tarmen blive beskadiget. - Anbring udskårne tarme i et 200 μL centrifugeglas, tilsæt 200 μL PBS til røret, og sug forsigtigt opløsningen med en pipette for at vaske tarmene grundigt.
5. Dissektion af nymfer og udskæring af tarme
BEMÆRK: Nymfekroppe er mere skrøbelige end voksne kroppe, og tarmen beskadiges let, når den trækkes fra halen. Derfor er den mest pålidelige metode til at skære nymfetarmen ved at trække fra hovedet.
- Brug en pipette til at placere 100 μL PBS på et glasglas. Placer diaset på scenen i et optisk mikroskop.
- Saml de SRBSDV-inficerede nymfer fra glasbægre med en manuel aspirator og læg dem i 1,5 ml rør. Placer rørene på is for at lamme insekter. Overfør derefter en lammet nymfe til 100 μL buffer på diaset med maven opad.
- Brug pincet til at løsne nymfens hale. Klem derefter insektlegemet for at fiksere forsigtigt, og brug det andet sæt til at klemme hovedet. Træk forsigtigt hovedet væk fra kroppen, mens du stadig opretholder dets fastgørelse til tarmen, så hovedet løsnes fra kroppen, men tarmen stadig er fastgjort til brystkassen og maven.
BEMÆRK: Efter at hovedet er løsnet, vil nymfens corpus adiposum strømme ud, hvilket gør PBS grumset. Den uklare PBS-opløsning fjernes, og der skiftes ud med 100 μL frisk PBS. - Når pincetten stadig klemmer kroppen, skal du bruge det andet sæt til at bevæge hovedet forsigtigt og gradvist trække tarmen ud.
- Fjern forsigtigt tarmen fra hovedet med pincet, og opnå til sidst en intakt tarm uden at beskadige plantehoppens krop.
- Anbring udskårne tarme i et 200 μL centrifugeglas, tilsæt 200 μL PBS til røret, og sug forsigtigt opløsningen med en pipette for at vaske tarmene grundigt.
BEMÆRK: De udskårne tarme skal rengøres godt med PBS for at fjerne eventuelle forurenende fedtlegemer fra bughulen; De kan forstyrre farvningsprotokollen.
6. Mærkningsprotokoller for SRBSDV-virioner og et insektprotein
- Forbered antistofferne og monteringsmediet, der anvendes i dette assay. Antistoffer er anti-SRBSDV-antistof mærket med Dylight 549 (rød) mod SRBSDV-virioner 18, anti-VAMP7-antistof mærket med Dylight 488 (grøn) mod insektproteinet VAMP716,19, Dylight 633 phalloidin (blå) og monteringsmedium indeholdende 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blå).
- De nyligt udskårne og PBS-vaskede WBPH-tarme anbringes straks i 100 μL 4% (m/v) paraformaldehyd i et 200 μL centrifugeglas og holdes i 2 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: De nyligt udskårne WBPH-tarme bør ikke gennemblødes i PBS i længere tid, ellers vil epitelcellerne blive beskadiget. - 4% (m/v) paraformaldehyd fjernes med en pipettor, og der tilsættes derefter 200 μL PBS i 200 μL centrifugeglasset. Efter 10 minutter fjernes PBS ved hjælp af en pipetter for at fjerne paraformaldehyd.
- Gentag dette PBS-vasketrin to gange.
- PBS fjernes og tilsættes 200 μL nonionisk vaskemiddel Triton X-100 (2%, v/v). Permeabiliser prøverne i det nonioniske vaskemiddel i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern 2 % (v/v) Triton X-100 med en pipettetor, og vask derefter eventuelt resterende vaskemiddel væk med tre 10 minutters vask med 200 μL PBS (se trin 6.3 og 6.4).
- Fortyndet anti-SRBSDV-antistof mærket med Dylight 549 (rød) og anti-VAMP7-antistof mærket med Dylight 488 (grøn) 1:50 med 50 μL tyreserumalbumin (3%, m/v).
- De fortyndede antistoffer tilsættes til glasset, og prøverne inkuberes natten over ved 4 °C.
- Antistoffortyndingsvæsken fjernes med en pipettor, og det resterende antistoffortyndingsmiddel vaskes derefter væk med tre 10 minutters vask med 200 μL PBS.
- 1 μL Dylight 633 phalloidin fortyndes med 50 μL PBS.
- Der tilsættes 50 μL fortyndet phalloidin til røret og inkuberes prøver i 2 timer ved stuetemperatur.
- Phalloidinfortyndingsvæsken fjernes med en pipettor, og det resterende phalloidin vaskes derefter væk med tre 10 minutters vask med 200 μL PBS.
BEMÆRK: Grundige vaske er afgørende for at reducere baggrunden og uspecifik binding. - Placer en dråbe monteringsmedium indeholdende DAPI på et mikroskopglas og overfør tarmene til mediet.
BEMÆRK: Fold forsigtigt hver tarm ud med pincet og undgå at skabe bobler. Der er omkring 15 tarme pr. Slide. - Placer forsigtigt et dækglas over prøverne uden at skabe bobler.
BEMÆRK: Objektbilledet skal holdes ved 4 °C i mørke for at hæmme fluorescensdæmpning før observation med et laserscanningskonfokalmikroskop. - Se alle prøver med et laserscanningskonfokalmikroskop. Tag billederne ved hjælp af blåt lys, og gem filerne på en computer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer alle trin i denne protokol: insektopdræt, virusopkøb, udskæring af tarmen, immunfluorescerende mærkning og fremstilling af diaset.
Udskårne WBPH-tarme fra voksne blev fikseret i 4% (m/v) paraformaldehyd, permeabiliseret med 2% (v/v) Triton X-100 og derefter inkuberet med Dylight 633 phalloidin10,18. Den laserscanningskonfokale mikrograf i figur 2 viser de tre dele af den udskårne tarm efter mærkning med phalloidin, og de er henholdsvis fortarmen, midgutten og bagtarmen. Blandt disse tre dele er midgut det oprindelige infektionssted for SRBSDV. Tarmens enkeltlags epitelcellestruktur letter undersøgelsen af den cellulære lokalisering af insektproteiner og colokalisering af virus- og insektproteiner.
Vi udskårne også WBPH-tarme og inkuberede dem med Dylight 488 (grøn) mærket anti-VAMP7-antistof og SRBSDV-virioner med henholdsvis17,18,19 Dylight 549 (rød) mærket anti-SRBSDV-antistof. Figur 3 viser VAMP7 i cytoplasmaet af WBPH midgut epitelceller. VAMP7- og SRBSDV-virioner har vist sig at colokalisere i cytoplasmaet med et laserscanningskonfokalmikroskop, hvilket tyder på, at VAMP7 kan spille en rolle i virusoverførsel in vivo.
Figur 1: Oversigt over trin i opdræt af insekter, udskæring af tarme og mærkning af protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologi af WBPH tarm. Fluorescens fra Dylight 633 phalloidin (blå, mærkning actin) blev set med et laserscanning konfokalmikroskop. Vægtstang, 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fluorescensmærkning af SRBSDV-virioner og VAMP7 i WBPH midgut-epitelceller set med et laserscanningskonfokalmikroskop. Indvolde blev inkuberet med anti-SRBSDV-antistof mærket med Dylight 549 (rød) og anti-VAMP7-antistof mærket med Dylight 488 (grøn). Vægtstang, 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For de bedste resultater bør et par nøglepunkter overvejes. For det første er et højt forhold mellem viruliferous insekter blandt den samlede befolkning nødvendig. Selvom den mindste AAP for SRBSDV af WBPH-nymfer og voksne er 5 min17, skal insekterne have lov til at fodre på friske SRBSDV-inficerede risplanter i 2 d for at opnå en erhvervelseseffektivitet på op til 80%. Da SRBSDV-virionerne kan påvises i 80% af midguts18, udskårne og mærkede vi de viruliferous insekter ved 2 d efter en 2 d AAP i denne protokol. For det andet er tarmene hos voksne og nymfer forbundet med spytkirtlerne i hovedet og til ovipositoren eller kopulatororganet i halen. Således kan tarmen omhyggeligt udskæres ved at trække fra hovedet eller halen. Teknikeren skal dog vælge en passende metode til at trække baseret på insektets størrelse. Den voksne tarm kan trækkes i et intakt stykke fra halen, efter at hovedet er fjernet, mens tarmen hos den mere skrøbelige nymfe let brydes, når den trækkes fra halen20. Mere pålideligt kan nymfetarmen fjernes ved forsigtigt at trække hovedet efter at have løsnet tarmen fra halen. Ved hjælp af disse dissektion / excisionsmetoder kan vi hurtigt opnå intakte tarme og bevare tarmepitelcellernes oprindelige ultrastruktur. Derudover ødelægges andre organer og plantehoppers ydre kropsskal ikke, hvilket opretholder integriteten af andre væv og organer såsom spytkirtler og hæmolymp for at udforske virusaktiviteter og interaktioner21.
Selvom immunfluorescensmærkning er meget udbredt, kan stærke fluorescerende signaler være vanskelige at opnå uden ordentlige mærkningsprotokoller, hvilket resulterer i det dyre spild af eksperimentelle materialer og tid22,23. Før mærkning skal de udskårne tarme rengøres godt med PBS for at udelukke forurenende fedtlegemer fra bughulen. De forurenende fedtlegemer kunne forhindre antistoffer i at trænge ind i cellen og gøre synsfeltet uklart, når det observeres med laserscanningskonfokalmikroskop. Efter denne rengøring skal tarmene fastgøres straks for at bevare cellestrukturen. Sørg for, at behandlingstiden for permeabilisering ikke er for lang for at forhindre antigenoverløb. Derudover bør permeabiliserede tarme rengøres grundigt efter inkubation med luciferin-konjugerede antistoffer for at reducere baggrunden og uspecifik binding. Før dækglasset trykkes, skal du forsigtigt folde hver tarm ud med pincet og forsøge at undgå bobler. Når objektglasset er klar, skal det opbevares ved 4 °C uden lys for at hæmme fluorescensdæmpning før observation med et laserscanningskonfokalmikroskop24,25.
Virusoverførsel af insektvektoren er et afgørende skridt i epidemiologien af mange plantevirussygdomme. Afbrydelse af denne transmission er således en effektiv strategi mod virussygdomme7,8, så det er af stor teoretisk og praktisk betydning at belyse disse viras overførselsmekanisme. Immunofluorescens er således meget nyttig til lokalisering af vedvarende overførte plantevira og undersøgelse af funktionen af deres proteiner in vivo mod at forstå de forskellige trin i virusoverførsel. I de senere år har immunofluorescens og laserscanning konfokal mikroskopi været kritiske værktøjer, der er ansvarlige for gennembrud i forståelsen af virusinteraktioner i vektorceller og væv under transmission af plantevirus. Ved hjælp af den nuværende protokol var vi i stand til at lokalisere SRBSDV-virioner og VAMP7 i epitelcellerne hos midguts hos voksne og nymfer og bestemme enhver colokalisering. Phalloidin blev brugt til at mærke actin til visning af omridset af midgutepitelcellemembranen, og DAPI blev brugt til at mærke kernen. Strukturerne i WBPH-tarmen og midgut-epitelcellerne er forskellige, når de ses med laserscanningskonfokal mikroskopi. Denne protokol er en pålidelig metode til at se fordøjelseskanalens anatomi af insekter, lokalisere virioner, andre patogener og insektproteiner og studere patogenaktiviteter i insekter, insektproteinfunktioner og interaktioner mellem patogener og insektproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31630058 til X.W. og 31772134 til W.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G.
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y.
- Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
