Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

4.5K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/62621

⸱

30 de junio de 2021

 ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo para la preparación de endosomas de reciclaje de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.

Resumen

El tráfico endosomal es un proceso celular esencial que regula una amplia gama de eventos biológicos. Las proteínas se internalizan desde la membrana plasmática y luego se transportan a los endosomas tempranos. Las proteínas internalizadas podrían ser transitadas al lisosoma para su degradación o recicladas de vuelta a la membrana plasmática. Se requiere una vía de reciclaje endocítica robusta para equilibrar la eliminación de materiales de membrana de la endocitosis. Se informa que varias proteínas regulan la vía, incluido el factor de ribosilación ADP 6 (ARF6). La ultracentrifugación por gradiente de densidad es un método clásico para el fraccionamiento celular. Después de la centrifugación, los orgánulos se sedimentan en su superficie isopícnica. Las fracciones se recogen y se utilizan para otras aplicaciones posteriores. Aquí se describe un protocolo para obtener una fracción de reciclaje que contiene endosomas de células de mamíferos transfectadas utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad. Las fracciones aisladas fueron sometidas a Western blotting estándar para analizar su contenido proteico. Al emplear este método, identificamos que la orientación de la membrana plasmática de la envoltura y la motilidad celular 1 (ELMO1), un sustrato de toxina botulínica C3 relacionada con Ras 1 (Rac1) factor de intercambio de nucleótidos de guanina, es a través del reciclaje endocítico mediado por ARF6.

Introducción

El tráfico endosomal es un proceso fisiológico esencial que implica diversos eventos biológicos1,por ejemplo, el transporte de receptores de señalización, canales iónicos y moléculas de adhesión. Las proteínas localizadas en la membrana plasmática se internalizan porendocitosis 2. Las proteínas internalizadas se clasifican por el endosoma temprano3. Algunas de las proteínas están dirigidas a los lisosomas para su degradación4. Sin embargo, una cantidad significativa de proteínas se reciclan de vuelta a la superficie celular mediante procesos de reciclaje rápido y reciclaje lento. En el reciclaje rápido, las proteínas abandonan los endosomas tempranos y regresan directamente a la membrana plasmática. Por el contrario, en el reciclaje lento, las proteínas se clasifican primero al compartimiento de reciclaje endocítico y luego se transportan de regreso a la membrana plasmática. Varias proteínas de carga, por ejemplo, clatrina, complejo de retrómeros, complejo retriever y proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich, y complejo SCAR Homologue (WASH), participan en tales procesos de reciclaje demembranas 4,5,6,7,8,9. El equilibrio del evento de endocitosis y reciclaje es crucial para la supervivencia celular y contribuye a varios eventos celulares10,por ejemplo, la adhesión celular, la migración celular, la polaridad celular y la transducción de señales.

ARF6, una pequeña GTPasa, es un regulador reportado del tráfico endocítico7,11,12. De interés, diversos grupos de investigación han ilustrado la importancia de ARF6 en el reciclaje endocítico13,14,15,16,17. El estudio tiene como objetivo investigar la relación entre el crecimiento de neuritas mediado por ARF6 y el reciclaje endocítico. El informe anterior sugiere que la activación de ARF6 es aguas arriba de la actividad de Rac1 al actuar sobre ELMO1-dedicador del complejo citocinesis 1 (DOCK180)18. Sin embargo, la forma en que ARF6 desencadena la señalización Rac1 mediada por ELMO1-DOCK180 sigue sin estar clara. Se empleó la ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el papel del reciclaje endocítico mediado por ARF6 en dicho proceso. Mediante el uso de esto, la fracción que contiene endosoma de reciclaje se obtuvo a partir de lisados celulares19. La fracción fue sometida a Western blotting para el análisis del contenido de proteínas. Los resultados de immunoblot revelaron que bajo la presencia de FE65, una proteína adaptadora enriquecida con cerebro, ARF6 activo aumentó sustancialmente el nivel de ELMO1 en la fracción que contiene endosomas de reciclaje. El siguiente protocolo incluye los procedimientos para (1) transfectar células de mamíferos; (2) preparación de las muestras y columnas de gradiente de densidad; y (3) la obtención de la fracción que contiene endosoma de reciclaje.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Cultivo y transfección de células de mamíferos

  1. Placa 2 x 106 celdas en una placa de cultivo de 100 mm. Use cuatro platos para cada transfección.
    NOTA: El número de celdas necesarias puede variar para diferentes líneas celulares. La optimización puede ser necesaria antes de proceder al paso de aislamiento.
  2. Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Cosecha de células

  1. Desechar el medio de cultivo 48 h después de la transfección.
  2. Lave las células con PBS helado (fosfatos de sodio de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro de sodio de 140 mM) dos veces.
  3. Agregue 1 ml de PBS+ helado (PBS suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa 0.5x y cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5x) a cada plato.
  4. Recoja las células con un raspador celular y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml.
  5. Pellet las células por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante a 400 x g durante 5 min.
  6. Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular suavemente en 5 ml de tampón de homogeneización (HB; 250 mM de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM de EDTA suplementado con 0.03 mM de cicloheximida, 1x cóctel inhibidor de la proteasa y 1x cóctel inhibidor de la fosfatasa).
  7. Recoger las células por centrifugación a 1.300 x g durante 10 min.
  8. Resuspend el pellet celular en 1 mL de HB.
  9. Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce para 15-20 golpes.
    NOTA: Se podrían utilizar otros métodos de homogeneización, por ejemplo, pasar la muestra a través de una jeringa. La eficiencia de homogeneización podría revelarse observando el homogeneizado bajo un microscopio de contraste de fase.
  10. Transfiera el homogeneizado a un tubo de centrifugación de 2 ml.
    NOTA: Cosechar 50 μL de homogeneizado con 12,5 μL de tampón de muestra 5x y etiquetarlo como lisado total.
  11. Añadir 0,7 ml de HB al homogeneizado.
  12. Girar el homogeneizado diluido a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: El pellet contiene núcleos y células ininterrumpidas.
  13. Recoja 1,5 ml del sobrenadante y repita el paso 2,12 una vez.
  14. Recolectar 1,4 ml del sobrenadante y etiquetarlo como sobrenadante postnuclear (SNP).

3. Preparación de la columna de gradiente de densidad

  1. Transfiera 1,2 ml de SNP a un tubo de ultracentrífuga.
  2. Añadir 1 ml de solución de sacarosa al 62% (2.351 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7,4) a la muestra y mezclar bien mediante pipeteo suave.
    NOTA: La solución resultante es una solución de sacarosa al 40,6%.
  3. Agregue 3.3 ml de solución de sacarosa al 35% (1.177 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente en la parte superior de la muestra.
  4. Agregue 2.2 ml de solución de sacarosa al 25% (0.806 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente sobre la solución de sacarosa al 35%.
    NOTA: El índice de refracción de las soluciones de sacarosa al 62%, 40.6%, 35% y 25% a temperatura ambiente es de 1.44, 1.40, 1.39 y 1.37, respectivamente. Los índices de refracción de las soluciones de sacarosa se pudieron comprobar con un refractómetro para garantizar la precisión y la consistencia del experimento.
  5. Llene el tubo de ultracentrifugación con HB.
    NOTA: Almacene temporalmente la columna de gradiente de densidad preparada a 4 °C.

4. Fraccionamiento y recuperación de la fracción que contiene endosomas de reciclaje

  1. Centrifugar la columna a 210.000 x g durante 3 h a 4 °C.
  2. Recolecte 12 fracciones (1 ml cada una) cuidadosamente, comenzando desde la parte superior del gradiente.
    NOTA: Los endosomas de reciclaje deben encontrarse en la interfaz entre soluciones de sacarosa al 35% y al 25%. Las fracciones recogidas pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C.
  3. Diluir todas las fracciones con 1 mL de tampón de dilución (3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM EDTA).
  4. Centrifugar la muestra diluida a 100.000 x g durante 1 h a 4 °C.
  5. Aspire el sobrenadante y agregue 50 μL de 1x tampón de muestra para cosechar las fracciones.
  6. Analizar el contenido de proteínas en las fracciones mediante western blotting.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Después de fraccionar las células HEK293 no transfectadas por ultracentrifugación por gradiente de densidad, se recolectaron 12 fracciones a partir de la parte superior del gradiente. Las fracciones cosechadas se diluyeron con el tampón de dilución en una proporción de 1:1 y se sometieron a una segunda ronda de centrifugación. Las muestras se sometieron a western blotting para analizar su contenido de proteínas. Como se muestra en la Figura 1,el marcador de endosoma de reciclaje Rab11 se det...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El protocolo anterior describe los procedimientos para aislar el reciclaje de endosomas de células cultivadas por ultracentrifugación. La fiabilidad de este método ha sido demostrada por la última publicación22,demostrando que el reciclaje de endosomas se aísla con éxito de otros orgánulos(Figura 1),como el aparato de Golgi y las mitocondrias. Se debe prestar atención a algunos pasos críticos para obtener un buen resultado de separación. Al preparar las soluciones de ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong, el esquema de subvenciones directas de CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust. Las figuras de este trabajo fueron adaptadas de nuestra publicación anterior, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" publicado en faseb Journal en octubre de 2020.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL, tubo de polipropileno de pared gruesa abierto, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
plato de cultivo de tejidos de 100 mmSPL20100
13,2 mL, Tubo ultratransparente de pared delgada abierto libre certificado, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Tampón de muestrasGenScriptMB01015
cOmplete, cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTARoche11873580001
COX IV (3E11) Tecnologíade señalización de célulasde conejo 4850SAnticuerpo monoclonal de conejo para la detección de COX IV.
CicloheximidaSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mLDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con baja glucosaHyCloneSH30021.01 ELMO1
anticuerpo (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 anticuerpo (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Anticuerpo policlonal de cabra para la detección de FE65.
Suero fetal bovino, grado de investigaciónHyCloneSV30160.03
GAPDH Anticuerpo monoclonal (6C5)AmbionAM4300Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de GAPDH.
ImageLab SoftwareBio-RadMedición de la intensidad de la banda
ImidazolSigma-AldrichI2399
Lipofectamina 2000 Reactivo de transfecciónInvitrogen11668019
Anticuerpo monoclonal anti-β-COPSigmaG6160Anticuerpo monoclonal de ratón para la detección de β-COP.
Myc-tag (9B11) mAbcell Signaling Technology2276SAnticuerpo monoclonal de ratón para la detección de proteínas marcadas con myc.
OmniPur EDTA, Sal disódica, DihidratadoCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Medios de suero reducidosGibco31985070
PBS ComprimidosGibco18912014
PhosSTOPRoche
Anticuerpo policlonal específico de RAB11AProteintech20229-1-APAnticuerpo policlonal de conejo para la detección de Rab11.
SacarosaAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Rotor de cuchara oscilanteBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Rotor de ángulo fijoBeckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0,05%), rojo fenolGibco25300062
mAb 4906845001

Referencias

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Tr fico endosomalendosomas de reciclajefraccionamiento celularWestern blottingregulaci n de ARF6marcador Rab11tr fico de prote nas
Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.