Modelo biomimético tridimensional in vitro de neuroblastoma con andamios basados en colágeno

El neuroblastoma es un cáncer pediátrico del sistema nervioso simpático que surge durante el desarrollo embrionario o en las primeras etapas de la vida postnatal debido a la transformación de las células de la cresta neural¹. Es el tumor extracraneal sólido más frecuente en niños, representa el 8% de las neoplasias malignas diagnosticadas en pacientes menores de 15 años y es responsable del 15% de todas las muertes por cáncer infantil. La enfermedad muestra comportamientos clínicos muy heterogéneos debido a alteraciones cromosómicas, genéticas y epigenéticas específicas, y características histopatológicas.

Estas alteraciones contribuyen a la agresividad del neuroblastoma y a los malos resultados en los pacientes pediátricos. Por lo tanto, las terapias actuales resultan ineficaces a largo plazo para casi el 80% de los pacientes con la enfermedad clínicamente agresiva², lo que pone de manifiesto el hecho de que el tratamiento para este grupo de pacientes sigue siendo un desafío. Es probable que esto se deba a que los mecanismos de la heterogeneidad del neuroblastoma y las metástasis aún no se comprenden completamente. Sin embargo, ahora se cree ampliamente que el microambiente tumoral (TME, por sus siglas en inglés) desempeña un papel en la progresión de muchos cánceres; sin embargo, sigue siendo poco estudiado en el neuroblastoma ^3,4.

El TME nativo es un microambiente 3D complejo que involucra células cancerosas y no cancerosas rodeadas por una MEC. La MEC se refiere al componente acelular de un tejido que proporciona soporte estructural y bioquímico a sus residentes celulares y contribuye a la progresión de la enfermedad, el pronóstico del paciente y la respuesta terapéutica⁵. Esta promoción de la progresión de la enfermedad se debe a la "reciprocidad dinámica" o comunicación bidireccional continua entre las células y la MEC ^6,7,8. A medida que el cáncer progresa, el colágeno del estroma se reorganiza a menudo en patrones lineales perpendiculares a la interfaz estroma-cáncer, que las células cancerosas utilizan como ruta migratoria hacia la metástasis 9,10,11.

Los principales componentes de este andamio biológico funcional nativo incluyen una red fibrosa de colágenos tipo I y II y otras proteínas, incluyendo elastina, glicoproteínas como la laminina, así como una serie de proteoglicanos y otros componentes solubles^12,13. Estas proteínas de la MEC nativa se han convertido en biomoléculas naturales atractivas para el desarrollo de modelos in vitro 3D 3D³. La aplicación de andamios 3D para el cultivo celular in vitro es cada vez más popular debido a su mayor representación fisiológica de la EMT en comparación con el cultivo tradicional de monocapa 2D. Los andamios 3D fabricados ayudan a la adhesión, proliferación, migración, metabolismo y respuesta celular a los estímulos observados en los sistemas biológicos in vivo.

El componente principal de estos andamios 3D es el colágeno, que es un actor clave en muchos procesos biológicos normales, incluida la reparación de tejidos, la angiogénesis, la morfogénesis de tejidos, la adhesión celular y la migración¹¹. Las matrices 3D basadas en colágeno han demostrado su robusta funcionalidad para modelar la MEC, sirviendo como un microambiente biomimético in vitro al tiempo que permite las interacciones célula-MEC, así como la migración e invasión celular. Estas matrices 3D también proporcionan un análisis más preciso de la respuesta celular a los fármacos quimioterapéuticos que el cultivo tradicional 2D o "plano" en muchos modelos de cáncer 14,15,16, incluido el neuroblastoma ^17,18. El análisis genético de cultivos celulares 3D ha reportado una mayor correlación con el perfil de tejido humano, incluso en comparación con modelos animales¹⁹. En general, la piedra angular de estos andamios 3D es proporcionar a las células un entorno in vitro adecuado, que recapitule la arquitectura del tejido nativo y facilite la diafonía molecular bidireccional⁸.

Para aumentar la complejidad de los modelos basados en colágeno, se incorporan otros componentes comunes de la MEC en el proceso de ingeniería de tejidos, creando así modelos más relevantes desde el punto de vista fisiológico para reflejar las TME de nicho de diferentes tejidos. Por ejemplo, los GAG, polisacáridos cargados negativamente presentes en todos los tejidos de los mamíferos²⁰, facilitan la adhesión, migración, proliferación y diferenciación celular. El sulfato de condroitina es un tipo específico de GAG que se encuentra en el hueso y el cartílago, que se ha utilizado anteriormente en aplicaciones de ingeniería de tejidos para la reparación ósea 21,22,23,24,25. La nanohidroxiapatita (nHA) es el principal constituyente inorgánico de la composición mineral de los tejidos óseos humanos, constituyendo hasta el 65% del hueso en peso²⁶ y, por lo tanto, se utiliza ampliamente para el reemplazo y la regeneración ósea²⁷. Por lo tanto, los GAG y la nHA son compuestos atractivos para reconstruir la MEC del neuroblastoma primario y modelar los sitios metastásicos más comunes de neuroblastoma, médula ósea (70,5%) y hueso (55,7%)²⁸.

Los andamios que incorporan estos componentes de ECM se desarrollaron originalmente para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos con un análisis exhaustivo de su biocompatibilidad, toxicidad y características osteoconductoras y osteoinductivas^29,30. Son matrices porosas a base de colágeno producidas mediante técnicas de liofilización para controlar sus propiedades físicas y biológicas. Los andamios de colágeno suplementados con nHA (Coll-I-nHA) o condroitina-6-sulfato (Coll-I-GAG) demostraron tener éxito en la imitación de la EMT primaria en el cáncer de mama³¹ y la metástasis ósea en el cáncer de próstata¹⁵, así como en el neuroblastoma¹⁷. La técnica de liofilización utilizada para fabricar estos andamios compuestos produce una homogeneidad reproducible en el tamaño de los poros y la porosidad dentro de los andamios^22,23,24. Brevemente, se fabrica una suspensión de colágeno (0,5% en peso) mezclando colágeno fibrilar con ácido acético 0,05 M. En el caso de Coll-I-GAG, se añade un 0,05% en peso de condoitina-6-sulfato aislado del cartílago de tiburón a la suspensión de colágeno durante la mezcla. Para los andamios compuestos Coll-I-nHA, las partículas de hidroxiapatita de tamaño nanométrico se sintetizan como se describió anteriormente²⁷ y se agregan a la suspensión de colágeno en una proporción de 2:1 con respecto al peso del colágeno durante el proceso de mezcla. Todos los andamios se reticulan físicamente y se esterilizan mediante un tratamiento deshidrotérmico a 105 °C durante 24 h²⁵. Los andamios cilíndricos (6 mm de diámetro, 4 mm de altura) se obtienen utilizando un punzón de biopsia y pueden ser reticulados químicamente con 3 mM de Clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida y 5,5 mM de N-hidroxisuccinimida (EDAC/NHS) en agua destilada (_dH2O) para mejorar las propiedades mecánicas de las construcciones³⁰. Este proceso de fabricación bien optimizado de dos andamios de colágeno crea andamios con propiedades mecánicas reproducibles, incluido el tamaño de los poros, la porosidad y la rigidez (kPa). Tanto los andamios Coll-I-GAG como los Coll-I-nHA tienen diferentes propiedades físicas, lo que crea diferentes condiciones ambientales. Las propiedades de cada andamio se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Resumen de las propiedades mecánicas de los dos andamios adoptados para el estudio de la biología del neuroblastoma.

En este artículo se describe un protocolo de ensamblaje de un sistema basado en andamios 3D para imitar mejor el microambiente del neuroblastoma utilizando líneas celulares de neuroblastoma y andamios basados en colágeno previamente descritos suplementados con nHA (Coll-I-nHA) o condroitina-6-sulfato (Coll-I-GAG). El protocolo incluye métodos posteriores para analizar los mecanismos de crecimiento de las células de neuroblastoma en un entorno fisiológicamente más relevante utilizando métodos de bajo costo previamente optimizados y adaptados del cultivo de monocapa 2D Figura 1.

Figura 1: Flujo de trabajo general del protocolo. (A) Las células se cultivan hasta un número suficiente, se dividen, se cuentan y se vuelven a suspender en un volumen apropiado de medio. (B) A continuación, este material celular se somete a una dilución en serie para preparar un total de 4 suspensiones celulares de diferentes densidades. (C) Los andamios a base de colágeno se siembran estérilmente en placas de 24 pocillos no adherentes, y (D) se agregan 20 μL de suspensión celular al centro de cada andamio y se dejan incubar a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad durante 3-5 h. (E) Luego se agrega lentamente un medio de crecimiento completo (1 mL) a cada andamio y las placas se vuelven a colocar en la incubadora para permitir el crecimiento celular durante el período de tiempo deseado. (F) En cada punto de tiempo predeterminado, se recuperan varios andamios para la evaluación de la viabilidad y el crecimiento celular, el análisis de la expresión génica y la tinción histológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Diseño experimental

NOTA: El número de andamios y celdas necesarios para cada experimento dependerá de la escala del experimento y se puede calcular utilizando las herramientas de esta sección sobre diseño experimental.

1. Número de andamios necesarios
   1. Determinar el cronograma experimental general y los intervalos de evaluación para los cambios en la biología celular (por ejemplo, el crecimiento y el metabolismo celular).
      NOTA: Por ejemplo, el plazo experimental es de 14 días, con una evaluación del crecimiento celular cada 7 días. Por lo tanto, los puntos de tiempo experimentales son los días 1, 7, 14 dando un total de 3 puntos de tiempo.
   2. A continuación, decida el número de aplicaciones experimentales que se aplicarán en cada momento. Trate de completar los mismos análisis en cada punto de tiempo para monitorear los cambios.
      NOTA: Los análisis típicos del crecimiento celular en andamios incluyen ensayos de viabilidad celular, cuantificación de ADN, tinción e imágenes histológicas y análisis de expresión génica. Estos se analizarán con más detalle en la sección 5.
   3. Decidir cuándo utilizar el mismo andamio para múltiples aplicaciones posteriores, por ejemplo, después de la evaluación de la viabilidad celular utilizando un ensayo adecuado, reutilizar el andamio para el aislamiento de ADN/ARN (discutido en 5.1.11).
   4. Mantenga un mínimo de 3 réplicas biológicas para cada aplicación, por ejemplo, 3 andamios para la viabilidad celular y la cuantificación del ADN, 3 para la histología y 3 para el análisis de la expresión génica. Como esto equivale a 9 andamios por punto de tiempo, planee usar 27 andamios para 3 puntos de tiempo.
   5. Finalmente, multiplique este número por el número de parámetros o condiciones experimentales (por ejemplo, evaluación de múltiples líneas celulares, densidades iniciales de siembra, composiciones de andamios).
      NOTA: En este protocolo, se evaluaron 4 densidades de siembra iniciales diferentes para una línea celular, lo que resultó en 108 andamios (27 andamios x 4 condiciones) que se requirieron. Para tener en cuenta el error humano y dar cobertura adicional, agregue ~ 10% a este número, por ejemplo, si se requieren 108 andamios, prepare 120 andamios.
2. Número de celdas necesarias
   NOTA: Se recomienda un volumen de 20 μL de suspensión celular para sembrar células en un andamio cilíndrico (diámetro 6 mm, altura 4 mm) en el día 0. El número de células por cada 20 μL de suspensión celular se ajusta según el diseño experimental, calculado en la sección 1.1. Una densidad de siembra inicial común es de 2 × 10⁵ células por 20 μL, que se utiliza como ejemplo para el siguiente protocolo.
   1. Para calcular la cantidad total de células necesarias para el experimento, multiplique las 2 × iniciales por 10⁵ células por cada 20 μL por el número de andamios necesarios.
      NOTA: Por ejemplo, 30 andamios multiplicados por 20 μL dan un volumen total de 600 μL. Si cada andamio requiere 2 × 10⁵ células, 600 μL de suspensión contienen un total de 6 × 10 6 células (2 × 10⁵ × 30), lo que da un requerimiento final de⁶ × 10⁶ células en 600 μL. El número de parámetros experimentales dictará el número total de células necesarias. Este protocolo, por lo tanto, describe el cultivo celular utilizando un matraz de cultivo celular multicapa, que puede manejar el mismo número de células que 10 matraces tradicionales de 175^cm2.

2. Preparación de andamios a base de colágeno

NOTA: Los andamios cilíndricos Coll-I-nHA y Coll-I-GAG (diámetro 6 mm, altura 4 mm) se preparan utilizando los métodos establecidos 15,21,27. Una vez reticulados químicamente según los métodos publicados anteriormente¹⁷, los andamios deben usarse dentro de 1 semana.

1. Después de la fabricación de los andamios con las propiedades mecánicas deseadas, asegúrese de que los andamios estén completamente hidratados y lavados a fondo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: Esto generalmente toma ~ 12 h después de la reticulación de los andamios y se puede llevar a cabo en contenedores de residuos de cultivo de tejidos de 100 mL a 4 °C, con un máximo de 50 andamios por contenedor y 2 mL de PBS por andamio.
2. Guarde los andamios en PBS a 4 °C hasta que estén listos para su uso.

3. Propagar células de neuroblastoma en un matraz de cultivo celular multicapa

NOTA: La densidad óptima de siembra para el matraz multicapa variará. Para el matraz utilizado en este experimento, la densidad óptima según las instrucciones del fabricante es de 1 × 10⁷ células. Antes de sembrar el matraz multicapa, propagar las células a una densidad de 1 × 10⁷ células o superior en un matraz de cultivo de tejidos apropiado (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T175 cm² ). Para sembrar las células en el matraz multicapa (sección 3.1), cultivarlas hasta que confluyan al 70-80%, cosechar y contar el número de células por ml, consultando los pasos 3.2.16-3.2.20 para realizar el recuento celular. Una vez contada la suspensión celular, se procede inmediatamente a la siembra del matraz multicapa. El trabajo de cultivo celular debe realizarse en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.

1. Siembra del matraz de cultivo celular multicapa
   1. Precalentar 550 mL de medio de crecimiento completo (varía según la línea celular en uso) y 100 mL de PBS estéril en un baño de agua a 37 °C durante 20 min.
   2. Utilizando la suspensión celular recolectada, calcule el volumen requerido de la suspensión celular necesaria para lograr la densidad óptima de siembra de 1 × 10⁷ celdas utilizando la ecuación (1), donde WANT se refiere al número de celdas requeridas para sembrar el matraz multicapa, y HAVE se refiere al número de celdas/mL en la suspensión celular:
      (1)
      p. ej..
   3. Agregue el volumen requerido de la suspensión celular a 100 ml del medio de crecimiento precalentado.
   4. Coloque un nuevo matraz multicapa en la campana, retire la tapa y sostenga el matraz en un ángulo de 60°. Pipetee lentamente los 100 ml de la suspensión celular en el matraz, por el lado en ángulo del cuello. Tape el matraz y colóquelo de lado para permitir que las células se distribuyan uniformemente por las capas.
   5. En un ángulo de 60°, agregue 400 ml del medio de crecimiento precalentado al matraz multicapa vertiendo o pipeteando lentamente por el lado en ángulo del cuello. Si el cuello se llena, vuelva a colocar el matraz en posición vertical o tape el matraz y colóquelo de lado antes de volver a verter.
      NOTA: Vierta lentamente para evitar la formación excesiva de burbujas. Golpee suavemente el matraz en posición vertical para permitir que todas las burbujas suban a la parte superior y retírelas con una pipeta de 10 ml. Asegúrese de que el matraz esté lleno hasta la rosca inferior del cuello; Agregue más medio, si es necesario, para lograr esto.
   6. Tapar el matraz multicapa e incubarlo con el cuello inclinado hacia abajo a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
   7. Revise el crecimiento cada 2-3 días para ver si hay confluencia. Para comprobar la confluencia de las dos capas inferiores del matraz multicapa, obsérvelas bajo una lente de objetivo 4x de un microscopio invertido.
      NOTA: Cuando se siembra con 1 × 10⁷ células de neuroblastoma, el matraz de 10 capas generalmente tardará una semana en volverse confluente, aunque esto puede variar según la línea celular utilizada.
2. Mantenimiento rutinario de las células en el matraz multicapa
   1. Precalentar 550 mL de medio de crecimiento completo (varía según la línea celular en uso), 50-100 mL de tripsina y 300 mL de PBS estéril en un baño de agua a 37 °C durante 20 min.
   2. Compruebe que el matraz multicapa tenga una confluencia del 70-80%.
   3. Coloque el matraz multicapa en una campana de flujo laminar y deseche el medio gastado del matraz vertiéndolo. Inicialmente, incline el matraz de modo que el medio se vierta sobre la presa de aire en un contenedor de desechos. Mientras vierte, gire el matraz 180° hasta que el medio fluya por el cuello en ángulo del matraz. Gire el matraz hacia adelante y hacia atrás a lo largo de este eje para eliminar cualquier líquido restante.
   4. Lave las células agregando 100 ml de PBS estéril precalentado lentamente por el cuello en ángulo. Tapar el matraz, colocarlo de lado para permitir una distribución uniforme del PBS y girar el matraz hacia atrás y hacia adelante para lavar las células.
   5. Deseche el lavado PBS de la misma manera que 3.2.3. Repita los pasos de lavado.
   6. Diluir 50 mL de tripsina precalentada en 50 mL de PBS estéril precalentado. Agregue 100 ml de solución de tripsina diluida al matraz multicapa, tape y coloque el matraz de lado para permitir una distribución uniforme de la tripsina. Si la línea celular es altamente adherente, use 100 ml de tripsina sin diluir.
   7. Incubar el matraz durante 2-5 min a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad, controlando el desprendimiento celular bajo el microscopio. Si es necesario, golpee el matraz con firmeza para ayudar a que se desprenda o vuelva a colocarlo en la incubadora durante un minuto más.
   8. Colocar el matraz multicapa en una campana de flujo laminar y neutralizar la tripsina con 100 mL de medio de crecimiento. Tape el matraz, colóquelo de lado y muévalo hacia atrás y hacia adelante para asegurar una neutralización completa.
   9. Vierta la suspensión celular neutralizada en 4 tubos de centrífuga cónicos de 50 ml.
      NOTA: Si se requiere una extracción completa de células, lave el matraz multicapa nuevamente con 100 ml de PBS estéril y viértalo en 2 tubos de centrífuga de 50 ml.
   10. Centrifugar la suspensión celular en tubos de centrífuga de 50 ml a 340 × g durante 3-4 min para granular las células.
   11. Regrese los tubos de centrífuga a la campana de flujo laminar y deseche con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante de cada gránulo.
       NOTA: El gránulo será grande y relativamente suelto y, por lo tanto, puede romperse fácilmente.
   12. Agregue 1-5 ml de medio de crecimiento a cada gránulo y vuelva a suspenderlo pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   13. Agrupe los 4 gránulos resuspendidos en un tubo de centrífuga de 50 ml, mézclelos bien con la pipeta y anote el volumen total.
   14. Realice una dilución adecuada de la suspensión celular para el recuento de células, de modo que cada cuadrado exterior del hemocitómetro contenga entre 30 y 100 células.
       NOTA: Una dilución inicial adecuada es 1:100; para ello, pipetear 10 μL de la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL y diluirlo con 990 μL de PBS estéril. Pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces para que se mezcle bien.
   15. Coloque un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga el stock de células en la incubadora mientras cuenta.
   16. Tomando un hemocitómetro limpio, coloque un cubreobjetos limpio sobre la rejilla, como se muestra en la Figura 2.
   17. Pipetear 10 μL de la suspensión celular diluida en la cámara del hemocitómetro. Si la cámara se llena antes de que se dispensen los 10 μL, deje de pipetear.
   18. Coloque el hemocitómetro debajo del objetivo 4x de un microscopio óptico. Ajuste el enfoque grueso y fino para visualizar las celdas.
   19. Cuente el número de celdas en los cuatro cuadrados de las esquinas exteriores de la cámara como se resalta en la Figura 2. Suma los cuatro conteos y divídelos por 4 para calcular el promedio de celdas por cuadrado.

Figura 2: Recuento de células con hemocitómetro. Se agregan diez microlitros de suspensión celular al hemocitómetro debajo del cubreobjetos. A continuación, la cámara se coloca bajo la lente del objetivo de 4x de un microscopio y se cuenta el número de células en las cuatro esquinas exteriores de la cuadrícula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

20. Multiplique el recuento promedio por el factor de dilución (por ejemplo, 100) y multiplique este número por 10,000 para obtener el número de células por ml usando la ecuación (2).
    (2)
21. Calcule el número total de células en la solución madre multiplicándolo por el volumen total de la masa celular (por ejemplo, si los 4 gránulos resuspendidos combinados formaron una solución de 20 ml, multiplique las células/ml por 20).
22. Para mantener el matraz multicapa, utilice la ecuación (1) descrita en el paso 3.1.2 para calcular el volumen de celdas necesario para sembrar 1 × 10⁷ celdas de nuevo en el matraz y realice los pasos 3.1.3 a 3.1.6 para volver a sembrar el matraz. Si está listo para sembrar los andamios, continúe con la siguiente sección.

4. Siembra de células de neuroblastoma en andamios

1. Preparar la suspensión de la célula madre
   NOTA: Este protocolo describirá los pasos para crear cuatro densidades de siembra diferentes de células de neuroblastoma, con un factor de multiplicación de 2 entre cada densidad. Por lo tanto, se utilizará una dilución en serie para crear tres suspensiones celulares adicionales a partir de la suspensión de la madre. El trabajo de cultivo celular debe realizarse en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
   1. Utilícese la ecuación (3) para calcular el volumen de células necesario a partir del número total de células del matraz multicapa (contado en el punto 3.2.19) para preparar la primera densidad de siembra o la suspensión de las células madre.
      (3)
      NOTA: Por ejemplo, si la densidad de siembra más alta es de 6 × 10 5 celdas por andamio requeridas para 30 andamios, y cada andamio recibe 20 μL de suspensión de celda, la suspensión de celda madre requeriría 1.8 × 10⁷ celdas (6 × 10⁵ celdas × 30 andamios) en un volumen total de 600 μL (20 μL × 30 andamios).
      Como se realizará una dilución en serie a partir de esta preparación, estos números deben duplicarse, es decir, 3,6 × 10⁷ células en un volumen total de 1200 μL. Para convertir esto en WANT en células por mL; dividir 3,6 × 10⁷ por 1200 μL y multiplicar por 1000 μL, dando 3 × 10⁷ células por ml.
      ​
   2. Agregue el volumen requerido de material celular a un tubo de centrífuga estéril de 2 ml o 15 ml y lleve a un volumen final de 1200 μl con medio de crecimiento. Etiquete este tubo como Densidad 1 (Figura 3).
2. Realice una dilución en serie para crear suspensiones celulares de densidad de siembra múltiples.
   1. A partir de la densidad 1 preparada en el paso 4.1.1, prepare tres densidades más de suspensión celular mediante dilución en serie como se indica en la Figura 3.
   2. Diluya cada densidad por un factor de 2 en el medio de cultivo. En primer lugar, agregue el volumen final requerido (600 μL del ejemplo anterior) de medio de crecimiento a tres tubos de centrífuga estériles de 2 ml o 15 ml.
   3. Transfiera la mitad de la Densidad 1 (600 μL) a uno de los tubos, mezclando bien la suspensión celular con el medio para diluir. Etiquete este tubo como Densidad 2.
   4. Transfiera la mitad de la densidad 2 (600 μL) al siguiente tubo, mezclando bien la suspensión celular con el medio para diluir. Etiquete este tubo como Densidad 3.
   5. Transfiera la mitad de la densidad 3 (600 μL) al siguiente tubo, mezclando bien la suspensión celular con el medio para diluir. Etiqueta este tubo como Densidad 4.
   6. Deseche 600 μL de la densidad 4 para que las cuatro preparaciones tengan un volumen final de 600 μL.
   7. Como control negativo, agregue 600 μL de medio de crecimiento solo a un tubo de centrífuga estéril de 2 mL. Consulte la Figura 3 para ver un esquema del proceso de dilución en serie.

Figura 3: Dilución en serie de células para preparar 4 suspensiones para 4 densidades de siembra de andamios diferentes. (A) Los números se pueden ajustar para adaptarse a la densidad de siembra deseada por andamio y (B) multiplicarse por el número total de andamios por densidad, y cada andamio recibe 20 μL de suspensión celular. En este ejemplo, la densidad 1 requiere 6 × 10⁵ celdas por andamio, lo que equivale a 1,8 × 10⁷ celdas en 600 μL para 30 andamios. Este número se duplica para comenzar la dilución en serie, ya que luego se transfieren 600 μL y se diluyen en 600 μL de medio de crecimiento en el siguiente tubo. Este proceso continúa hasta que hay 4 suspensiones celulares con un factor de 2 entre cada una. Un control negativo se realiza añadiendo 600 μL de medio solo a un tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Adición de suspensiones celulares a los andamios
   NOTA: Retire los andamios (almacenados en PBS) del refrigerador y deje que alcancen la temperatura ambiente (RT) antes de agregar las celdas.
   1. Coloque los andamios en PBS en la campana de flujo laminar.
   2. Con pinzas estériles, coloque los andamios en placas no adherentes de 24 pocillos con un andamio por pocillo (Figura 1C). Levante suavemente los andamios por sus esquinas y presiónelos ligeramente contra el costado del recipiente para eliminar el exceso de PBS. Agregue los andamios en el centro de los pocillos con la piel hacia abajo (el lado de la capa brillante del andamio, hacia abajo en las placas de plástico de 24 pocillos).
   3. Etiquete las placas de 24 pocillos con detalles de la línea celular, los parámetros relevantes (por ejemplo, la densidad de siembra) y los puntos de tiempo. Trabaje con una densidad de siembra celular a la vez, manteniendo las densidades restantes en la incubadora a 37 °C hasta que esté lista para su uso.
   4. En la campana de flujo laminar, utilice una pipeta P20 y puntas estériles para añadir suavemente 20 μL de la suspensión celular correspondiente al centro de cada andamio (Figura 1D). Mantenga las celdas completamente en suspensión mezclando bien mientras agrega las celdas a los andamios. Asegúrese de que la suspensión permanezca en la parte superior del andamio y no se deslice sobre la base del pozo, ya que esto no permitirá que la celda se adhiera al andamio.
   5. Una vez añadidas las células, incubar las placas durante 3-5 h (37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad) para permitir que la mayoría de las células se adhieran.
   6. Después de la incubación, agregue lenta y suavemente 1 ml de medio de crecimiento precalentado a cada pocillo (Figura 1E). Utilice una pipeta P1000 para añadir el medio y permitir un movimiento más lento y controlado, evitando el desplazamiento de los andamios. Si trabaja con un número muy elevado de andamios, utilice una pipeta de 10 ml con la pistola de pipetas ajustada en "caída" y "baja".
   7. Incubar las placas de 24 pocillos durante la noche (37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad).
4. Mantenimiento de celdas en los andamios
   1. Después de las primeras 24 h de unión celular (Día 1), transfiera los andamios sembrados a nuevas placas de 24 pocillos no adherentes y agregue 1-2 ml de medio de crecimiento fresco.
      NOTA: Este paso elimina las células que han caído al fondo de las placas de plástico de 24 pocillos en lugar de permitir que crezcan en los andamios. Las réplicas de andamios designadas como Día 1 se retirarán después de 24 h, como se discutió en la sección 5; por lo tanto, el mantenimiento no se aplica a estos andamios.
   2. Monitoree los andamios inicialmente cada 2-3 días para ver si hay un cambio en el color del medio de crecimiento. A medida que pasa el tiempo y las células proliferan dentro de los andamios, alimente las células con más frecuencia.
   3. Con una pistola de pipetas de 10 ml, en modo lento, retire 1 ml del medio gastado y deséchelo. Si se realizan experimentos que requieren medio acondicionado, recoja el medio gastado de las réplicas biológicas en un tubo de centrífuga de 15 ml, centrifugue a 340 × g durante 2 min para granular los restos celulares, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a -80 °C.
   4. Agregue suavemente 2 ml de medio de crecimiento precalentado a los andamios, utilizando nuevamente la función de goteo en la pipeta, y devuelva la placa de 24 pocillos a la incubadora (37 °C, 5 % de CO₂ y 95 % de humedad). Repita cada vez que se gaste el medio durante el período de crecimiento deseado.

5. Recuperación de andamios y aplicaciones

NOTA: En cada punto de tiempo, se pueden utilizar varias aplicaciones para monitorear el crecimiento celular en los andamios o evaluar los perfiles de expresión de genes y proteínas. Las condiciones de recuperación del andamio dependerán del análisis que se vaya a realizar, con múltiples métodos de recuperación descritos en las siguientes subsecciones y demostrados en la Figura 4.

1. Evaluación de la viabilidad celular dentro de andamios
   1. Esterilice el reactivo de ensayo de viabilidad celular adecuado filtrándolo a través de un filtro estéril de 0,2 μm en un tubo de centrífuga en la campana de flujo laminar. Precaliente esta solución estéril junto con el medio de crecimiento completo y el PBS estéril en un baño de agua a 37 °C.
   2. En la campana de flujo laminar, use pinzas estériles para transferir los andamios que se analizarán a una placa nueva de 24 pocillos. Etiquete la placa con todos los detalles relevantes.
      NOTA: Realice el análisis por triplicado.
   3. Agregue 900 μL del medio de crecimiento precalentado a cada pocillo, seguido de 100 μL del reactivo de viabilidad celular estéril. Incluya un control negativo añadiendo 900 μL de medio y 100 μL del reactivo de viabilidad celular estéril a un pocillo sin andamio. Vuelva a colocar la tapa en la placa y mueva suavemente la placa durante ~ 3 minutos para distribuir uniformemente el reactivo de viabilidad celular diluido por todo el pocillo. Incubar la placa a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.
      NOTA: Los tiempos de incubación deberán optimizarse para cada línea celular; Consulte las pautas del fabricante. En el caso de las líneas celulares de neuroblastoma, la incubación de 4 a 6 h parece óptima.
   4. Después de la incubación, retire la placa de la incubadora y muévala suavemente durante unos segundos.
   5. En la campana de flujo laminar, abra una nueva placa translúcida de 96 pocillos. De cada pocillo de la placa de 24 pocillos, transfiera el medio incubado y el reactivo a tres pocillos de la placa de 96 pocillos con 100 μL por pocillo, dando triplicados técnicos.
      NOTA: Esta transferencia dejará 700 μL en los pocillos de la placa de 24 pocillos.
   6. Cubra la placa de 96 pocillos con papel de aluminio para proteger el reactivo de viabilidad celular de la luz.
   7. Retire y deseche los 700 μL restantes del contenido del pocillo de cada andamio en la placa de 24 pocillos. Lave cada andamio dos veces con 1 ml de PBS estéril.
      NOTA: No se eliminará todo el color de los andamios. Estos andamios se pueden utilizar para otras aplicaciones, por ejemplo, cuantificación de ADN, colocándolos en 1 ml de Triton X-100 al 1% en solución de bicarbonato sódico (NaHCO₃) al 0,1 M y almacenándolos a -80 °C (ver sección 5.2, figura 4B).
   8. Retire la placa de 96 pocillos de la campana de flujo laminar y mida la absorbancia de cada pocillo en longitudes de onda de 570 nm y 600 nm utilizando un lector de microplacas. Registre los valores de absorbancia en ambas longitudes de onda y siga las instrucciones del fabricante para calcular el porcentaje de reducción del reactivo de viabilidad celular por parte de las células.
   9. Graficar y analizar estadísticamente los resultados de viabilidad celular utilizando el software adecuado. Introduzca valores biológicos por triplicado para producir barras de error e indicar la variabilidad del ensayo.
   10. Para examinar los cambios en la viabilidad celular a lo largo del período de tiempo experimental, realice una prueba de análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con múltiples comparaciones de las medias utilizando un software bioestadístico adecuado.
   11. Indique diferencias significativas entre los puntos de tiempo en los gráficos como ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) y **** (P≤0.0001).

Figura 4: Recuperación de andamios para diferentes análisis en cada punto de tiempo. (A) Se recuperan tres réplicas de andamios para el análisis de viabilidad celular. (B) Estos andamios pueden lavarse en PBS, colocarse en Triton X-100 al 1% en NaHCO₃ de 0,1 M y almacenarse a -80 °C para la cuantificación del ADN. (C) Se fijan tres réplicas más en PFA al 10% durante 15 min, se neutralizan en PBS y se almacenan a 4 °C para tinción histológica e imágenes. (D) Finalmente, se agregan 3 réplicas a un reactivo de lisis celular a base de fenol/guanidina y se almacenan a -20 °C para el análisis de expresión génica. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; PFA = paraformaldehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cuantificación del ADN de las células en los andamios
   NOTA: Como se menciona en la nota después del paso 5.1.7, la recuperación de los andamios para la cuantificación del ADN implica la colocación de los andamios en tubos de centrífuga de 2 mL que contienen 1 mL de Triton X-100 al 1% en una solución de NaHCO₃ al 0,1 M, seguido de un almacenamiento a -80 °C. Antes de que se pueda realizar el análisis de ADN, las células deben someterse a tres ciclos de congelación y descongelación para lisar adecuadamente las células del neuroblastoma y liberar el ADN para su cuantificación.
   1. Retire las muestras previamente almacenadas en Triton X-100 a -80 °C. Deje las muestras en RT durante 1-3 h o hasta que se descongelen.
   2. Agitar las muestras en vórtice durante 10-20 s y volver a colocarlas a -80 °C durante 18-24 h o hasta que estén completamente congeladas. Repita este proceso durante un total de tres ciclos de congelación y descongelación.
   3. Para maximizar el rendimiento del ADN, use un lisador de tejido para alterar las células en los andamios.
      1. Coloque una perla de metal en el tubo de centrífuga de 2 ml que contiene un andamio en Triton X-100 y coloque el tubo dentro del adaptador para agitar la muestra a 50 oscilaciones/segundo durante 2-3 minutos.
         NOTA: Utilice tubos de centrífuga de fondo redondo, ya que la perla de metal puede alojarse en un tubo de fondo cónico.
   4. Cuantifique el ADN en la solución Triton X-100 aplicando una tinción fluorescente de ADN bicatenario (dsDNA) y mida la emisión con un lector de microplacas. Consulte las pautas del fabricante; diluir las muestras adecuadamente en tampón de ácido tetraacético (TE) de tris-etilendiamina para preparar 8 patrones de dsDNA mediante dilución en serie en tampón TE (Figura 5).
   5. En placas negras opacas de 96 pocillos, añadir 100 μL de cada patrón o muestra a los pocillos por triplicado técnico.
   6. Diluir la tinción fluorescente de dsDNA 200 veces en tampón TE y añadir 100 μL a cada patrón/muestra con una pipeta multicanal. Cubra el plato con papel de aluminio e incube a RT durante 5 min.
   7. Mida y registre la fluorescencia de cada pocillo a 520 nm. Siga las pautas del fabricante para calcular la concentración de ADN en cada muestra.
      NOTA: Si se conoce la concentración media de ADN por célula para la línea celular que se está utilizando, los valores de concentración de ADN se pueden convertir en números de células utilizando la ecuación (4).
      (4)
   8. Graficar y analizar estadísticamente los resultados de la cuantificación del ADN utilizando el software adecuado. Introduzca valores biológicos por triplicado para producir barras de error e indicar la variabilidad del ensayo.
   9. Para examinar los cambios en la concentración de ADN/número de células a lo largo del período de tiempo experimental, realice una prueba de ANOVA de un factor con múltiples comparaciones de las medias utilizando un software bioestadístico adecuado.
   10. Indique diferencias significativas entre los puntos de tiempo en los gráficos como ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) y **** (P≤0.0001).

Figura 5: Preparación de ocho patrones de ADN para la generación de una curva estándar. Se suministra una solución madre de λADN a 100 μg/mL. Esto se diluye 50 veces en tampón TE para crear el estándar A a 2000 ng/mL; A continuación, se transfieren 400 μL de A al tubo B, que contiene 400 μL de tampón TE; A continuación, se transfieren 400 μL de B y se diluyen 2 veces en C, y así sucesivamente hasta G. El estándar H se compone únicamente de tampón TE y, por lo tanto, tiene una concentración de ADN de 0 ng/mL. Abreviatura: TE = Tris-EDTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de andamios para tinción histológica
   NOTA: Los andamios se pueden fijar y teñir con fines de microscopía e imágenes, ya sea como andamios completos para inmunofluorescencia (IF) o como cortes fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) para tinción histológica o inmunohistoquímica (IHC). Esto permite la evaluación cualitativa de la penetración y distribución celular dentro de los andamios y se puede utilizar para evaluar la expresión de proteínas.
   1. Prepare una solución de paraformaldehído (PFA) al 10% en PBS. Asegúrese de que haya suficiente solución para un volumen final de 500 μL por andamio.
   2. Precaliente esta solución a 37 °C y agregue 500 μL a los tubos de centrífuga marcados de 2 mL para la recuperación del andamio.
   3. Retire los andamios de las placas de 24 pocillos no adherentes (paso 4.4.4) y colóquelos en la campana de flujo laminar.
   4. Con pinzas estériles, transfiera los andamios a los tubos de centrífuga etiquetados que contienen un 10 % de PFA. Deje que los andamios se fijen en la solución de PFA durante 15 minutos. Neutralizar el PFA añadiendo 500 μL de PBS a cada tubo y almacenar a 4 °C.
   5. Para preparar los andamios para el procesador automático de tejidos, retírelos a 4 °C y colóquelos con pinzas en casetes de plástico etiquetados con lápiz con todos los detalles relevantes. Coloque todos los casetes en el recipiente metálico del procesador de tejidos.
   6. Comience el protocolo de 12 etapas en el procesador de tejidos para reparar, deshidratar, limpiar los andamios e infiltrarlos con parafina durante la noche. Recoja los casetes que contienen las muestras procesadas.
   7. A continuación, incruste los andamios en bloques de cera de parafina para permitir la microtomía de los andamios en rodajas muy finas para teñirlos.
      NOTA: Es especialmente importante tener en cuenta la orientación de los andamios a la hora de sacarlos de los casetes e incrustarlos en cera, ya que esto afectará al ángulo en el que se toman las imágenes. Esto es importante cuando se evalúa la infiltración celular en los andamios.
   8. Encienda el incrustador de cera y la placa fría; Levante la tapa para comprobar el nivel de cera. Rellene si es necesario.
   9. Trabajando con una muestra a la vez, abra el casete, retire el andamio y céntrelo en el molde de plástico.
   10. Vierta cera caliente sobre la muestra, asegurándose de que se mantenga la orientación correcta y ajustando con pinzas tibias, si es necesario, antes de que la cera se solidifique. Vierte más cera para llenar el molde.
   11. Coloque la tapa del casete etiquetada encima del molde de plástico y agregue cera encima. Coloque el molde en la placa fría para solidificar la cera. Almacenar durante la noche a 4 °C para asegurarse de que la cera de parafina esté completamente solidificada antes de la microtomía.
   12. Para prepararse para la microtomía, encienda un baño de agua a 35 °C, la placa de secado y el micrótomo.
   13. Inserte una cuchilla en el soporte y apriete la palanca para asegurarla.
   14. Ajuste el grosor de la moldura y de la sección, generalmente 5 mm para las secciones de andamios.
   15. Retire el andamio FFPE del molde, asegúrelo en el soporte en la parte frontal del micrótomo y recorte con cuidado el exceso de cera alrededor de los bordes de la muestra antes de cortar secciones.
   16. Comience a cortar el bloque de cera girando la palanca del micrótomo, asegurando un movimiento suave.
   17. Recoja secciones en forma de cinta, alrededor de 3 secciones de andamio a la vez, y colóquelas suavemente en el baño de agua a 35 ° C para eliminar las arrugas. Separe suavemente las secciones mientras está en el baño de agua con unas pinzas.
   18. Usando portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de polisina, levante cada sección del baño de agua para que la sección se asiente en el centro del portaobjetos. Etiqueta cada diapositiva con un lápiz.
   19. Coloque los portaobjetos de vidrio en la placa de secado o en un horno de secado a 60 °C. Una vez secos, conservarlos a 4 °C y proceder a la tinción histológica o IHQ requerida.
4. Recuperación de andamios para el análisis de la expresión génica
   1. Retire los andamios de las placas de 24 pocillos no adherentes de la incubadora (paso 4.4.4) y colóquelos en la campana de flujo laminar.
   2. Con pinzas estériles, transfiera los andamios a tubos de centrífuga de 2 ml recién etiquetados.
   3. En una campana extractora, agregue 1 ml de un reactivo de lisis celular a base de fenol/guanidina a cada tubo para lisar las células en andamios y permitir la recuperación de ARN de alta calidad.
   4. Almacene los tubos a -20 °C hasta que estén listos para realizar la extracción de ARN con un kit adecuado. Utilizando una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa estándar (RT-qPCR)¹⁷, se evalúa la expresión génica en las células de los andamios.

El modelo de andamio basado en colágeno que se describe aquí tiene muchas aplicaciones que van desde el estudio de la biología del neuroblastoma hasta el cribado de terapias contra el cáncer en un entorno fisiológicamente más similar a los tumores nativos que el cultivo celular 2D convencional. Antes de probar una pregunta de investigación determinada, es crucial obtener una caracterización completa de la adhesión, proliferación e infiltración celular dentro del marco de tiempo experimental deseado. Las condiciones de crecimiento dependerán de la biología de cada línea celular específica. Es importante destacar que se deben implementar varios métodos de evaluación del crecimiento celular para determinar las condiciones óptimas y el rendimiento robusto.

En este caso, se evaluó la viabilidad de las células de neuroblastoma cultivadas en andamios mediante un ensayo de viabilidad celular colorimétrico. Este ensayo se puede realizar con la frecuencia que se desee durante todo el período de tiempo experimental. Para el experimento descrito, se realizó una evaluación de la viabilidad celular en los días 1, 7 y 14 para dos líneas celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas en andamios Coll-I-nHA a 4 densidades diferentes (Figura 6). La viabilidad del día 1 se estableció como línea de base para comparar todas las mediciones posteriores. La tasa de reducción del reactivo de viabilidad celular refleja la biología celular y las características de crecimiento de las líneas celulares individuales, incluidas sus tasas de proliferación y metabolismo. Se esperaba una correlación entre el número de células sembradas en los andamios y el nivel de reducción. En este experimento, la reducción del reactivo de viabilidad celular generalmente aumentó con cada punto de tiempo para ambas líneas celulares en todas las densidades, como se esperaba.

A continuación, se evaluó cada densidad individualmente para ambas líneas celulares con el fin de comparar la reducción a través de los puntos temporales. Se realizó un ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para detectar diferencias significativas en la reducción entre puntos de tiempo (Figura 7). Tanto para las líneas celulares como para todas las densidades de siembra, hubo un aumento significativo (P<0,05) en la reducción del reactivo de viabilidad celular al comparar el día 1 y el día 14. Esto indicó un aumento significativo de las células metabólicamente activas presentes en los andamios. Este incremento no fue significativo en todos los casos al evaluar los intervalos de 7 días (día 1 vs. día 7, día 7 vs. día 14), demostrando la importancia de la optimización de la densidad de siembra para lograr la ventana de crecimiento deseada.

Para respaldar los resultados del ensayo de viabilidad celular, el crecimiento celular en andamios también se puede medir indirectamente a través de la cuantificación de dsDNA extraído de andamios utilizando una tinción fluorescente de dsDNA (Figura 8A). Al igual que la viabilidad celular, la cuantificación del ADN se puede realizar con la frecuencia que se desee dentro de la línea de tiempo experimental. Sin embargo, este análisis requiere la recuperación completa de los andamios y la terminación del crecimiento celular, por lo que debe tenerse en cuenta en la planificación experimental, como se discutió en la sección 1. Para este experimento, se cuantificó el ADN en los días 1, 7 y 14 para dos líneas celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas en andamios Coll-I-nHA a 4 densidades diferentes. Como se conoce la concentración media de dsDNA por célula para estas líneas celulares, fue posible derivar el número de células por muestra a partir del ADN cuantificado (Figura 8B).

La cuantificación del ADN dio lugar a una mayor variabilidad entre las réplicas biológicas que la evaluación de la viabilidad celular, pero en general aumentó para cada punto de tiempo, con los niveles más altos cuantificados en el día 14. Las células IMR32 parecen alcanzar un mayor número de células en los andamios Coll-I-nHA, como lo indica la concentración de ADN, que las células KellyLuc. A continuación, se evaluó individualmente cada densidad para las dos líneas celulares con el fin de comparar la reducción a través de los puntos temporales. Se realizó un ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para detectar diferencias significativas en la reducción entre puntos de tiempo (Figura 8B).

Tanto para las líneas celulares como para todas las densidades de siembra, hubo un aumento significativo (P<0.05) en el número de células cuando se compararon el día 1 y el día 14, con la excepción de KellyLuc en la densidad de siembra 4 (1 × 105 células/andamio), que no produjo aumentos significativos en ninguno de los puntos de tiempo. Al igual que los resultados de viabilidad celular, los aumentos no fueron significativos en todos los casos al evaluar los intervalos de 7 días (día 1 vs. día 7, día 7 vs. día 14). Al comparar las tendencias de los puntos de tiempo para la viabilidad celular y la cuantificación del ADN, hubo algunas ligeras diferencias entre los dos análisis. Sin embargo, se observaron tendencias similares en general, con valores medios que aumentaron entre intervalos de 7 días para la mayoría de las densidades. Esto demuestra la importancia de monitorear el crecimiento celular utilizando más de un método.

A continuación, se implementó una evaluación visual de la morfología y distribución del crecimiento celular en los andamios, que abarcó la tinción tradicional de hematoxilina y eosina (H&E), así como la IHQ. Se espera que los diferentes patrones de crecimiento de las líneas celulares individuales conduzcan a una variada disposición espacial en los andamios, incluyendo diferentes grados de penetración en el andamio y agrupamiento celular. Los andamios se fijaron en formol, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 mm (Figura 9A), preparando los andamios para múltiples técnicas de visualización, incluida la tinción histológica y la IHQ.

La tinción rutinaria de H&E se aplicó a las células Kelly, KellyCis83 e IMR32 cultivadas en andamios a base de colágeno en los días 1, 7 y 14 (Figura 9B). Esto permitió la visualización de la orientación espacial de las células en dos andamios basados en colágeno durante un período de 14 días. Las células Kelly sensibles al cisplatino y las células KellyCis83 resistentes se cultivaron en andamios Coll-I-nHA (Figura 9B, i) y Coll-I-GAG (Figura 9B, ii). De acuerdo con los datos publicados anteriormente, las células KellyCis83 crecieron a un ritmo más alto y se infiltraron más profundamente en ambas composiciones de andamios que la línea celular Kelly menos invasiva. La tinción H&E de otra línea celular de neuroblastoma, IMR32, cultivada en Coll-I-nHA muestra un patrón de crecimiento contrastante (Figura 9B, iii). Esta línea celular creció en racimos grandes y densamente empaquetados en los andamios de colágeno durante un período de 14 días. La microscopía confocal de campo claro se puede utilizar para visualizar la arquitectura porosa de los andamios a base de colágeno (Figura 9C) debido a la autofluorescencia de las fibras de colágeno.

Tiñimos células con faloidina dirigida a la actina citoesquelética y la contratinción nuclear, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), para monitorizar rasgos celulares específicos a lo largo de la línea de tiempo experimental. Se observó una abundancia de actina en las células de Kelly y KellyCis83 en andamios Coll-I-GAG utilizando esta técnica (Figura 9D). Estos resultados demuestran cómo se pueden utilizar múltiples técnicas de imagen para obtener información resuelta espacialmente a partir de células de neuroblastoma cultivadas en andamios utilizando este protocolo. Esta caracterización de los patrones de crecimiento celular en andamios basados en colágeno durante un período determinado mejorará la comprensión e interpretación de cualquier ensayo bioquímico posterior.

La expresión de proteínas por células cultivadas en andamios basados en colágeno se puede analizar para comparar la actividad celular con escenarios in vivo . Los datos publicados anteriormente examinaron la expresión de cromogranina A (CgA) como marcador sustituto secretado de neuroblastoma por células KellyLuc y KellyCis83Luc cultivadas en monocapas celulares, así como en andamios Coll-I-nHA y Coll-I-GAG (Figura 10). La CgA se evaluó en los medios acondicionados mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) (Figura 10A). La CgA se secreta a una tasa más alta en la línea celular KellyCis83 resistente a la quimioterapia más agresiva que en Kelly (Figura 10B, C). Esto fue significativo en el día 7 en los andamios Coll-I-GAG y Coll-I-nHA (P<0.05), mientras que no hubo diferencias significativas en este punto de tiempo para las células cultivadas como monocapa por cultivo 2D convencional.

Estos resultados también ponen de relieve la línea de tiempo experimental restringida cuando se cultivan células en una monocapa, con solo 7 días de crecimiento que resultan factibles antes de que las células alcancen la confluencia. El crecimiento de las células en andamios supera esta limitación, ya que pueden mantenerse durante un período más largo en condiciones fisiológicamente más relevantes. La combinación anterior de técnicas para adquirir información sobre la viabilidad celular, el contenido de ADN, la morfología celular y la disposición espacial, y los perfiles de expresión facilita la evaluación del crecimiento de las células de neuroblastoma en una variedad de andamios basados en colágeno. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente para satisfacer los requisitos experimentales específicos y las aplicaciones deseadas.

Figura 6: Análisis de viabilidad celular. (A) Procedimiento general para medir la viabilidad de las células de neuroblastoma en andamios basados en colágeno mediante un ensayo de viabilidad celular colorimétrico. El período de incubación debe optimizarse para cada nueva línea celular, haciendo referencia a las pautas del fabricante. (B) Reducción porcentual del reactivo de viabilidad celular por células KellyLuc e IMR32 cultivadas en andamios Coll-I-nHA a cuatro densidades de siembra iniciales diferentes, medidas en los días 1, 7 y 14. Las muestras se evaluaron por triplicado biológico con barras de error que representan la desviación estándar. Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Viabilidad celular por densidad de siembra para células cultivadas en Coll-I-nHA durante un período de 14 días. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Los números de celda titulados se refieren a la densidad inicial de siembra de celdas en los andamios en el día 0. Las muestras se evaluaron por triplicado biológico, indicado por puntos triplicados, con barras que representan la media. Se utilizó ANOVA de un factor con comparaciones múltiples para detectar diferencias significativas en el porcentaje de reducción del reactivo de viabilidad celular en los tres puntos temporales, anotados en los gráficos (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; ANOVA = análisis de varianza; ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Cuantificación del ADN extraído de células en andamios. (A) Proceso de cuantificación de dsDNA de células cultivadas en andamios a base de colágeno utilizando una tinción fluorescente de dsDNA. (B) Número de células del análisis de cuantificación de ADN por densidad de siembra para células KellyLuc e IMR32 cultivadas en Coll-I-nHA durante un período de 14 días. Los números de celda titulados se refieren a la densidad inicial de siembra de células en andamios en el día 0. Las muestras se evaluaron por triplicado biológico, indicado por puntos triplicados, con barras que representan la media. Se utilizó ANOVA de un factor con comparaciones múltiples para detectar diferencias significativas en el número de células en los tres puntos de tiempo, anotados en los gráficos (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; dsDNA = ADN bicatenario; TE = Tris-EDTA; ANOVA = análisis de varianza; ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Pasos de procesamiento de tejidos para el análisis inmunohistoquímico de andamios. (A) Representación esquemática del protocolo para el procesamiento de andamios para el análisis de imágenes. Este proceso permite la tinción histológica rutinaria y el sondeo de anticuerpos específicos utilizando anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. (B) Imágenes representativas de tres líneas celulares de neuroblastoma sometidas a tinción de H&E. Las imágenes de H&E se toman en los días 1, 7 y 14 para monitorear los patrones de crecimiento durante el transcurso del experimento. Barra de escala = 200 μm. Los cuadrados discontinuos representan el área elegida para las imágenes ampliadas 20x en el borde inferior izquierdo. Barra de escala = 20 μm. (i y ii) H&E de las líneas celulares de neuroblastoma Kelly y KellyCis83 (paneles superior e inferior, respectivamente) en dos tipos de andamios a base de colágeno. (iii) H&E de la línea celular IMR32, que representa el crecimiento celular agrupado en el andamio Coll-I-nHA. (C) Imagen representativa de la línea celular de Kelly, sometida a microscopía confocal de campo claro. La autofluorescencia de colágeno permite la visualización del andamio poroso. Barra de escala 10x = 200 μm, barra de escala 20x = 20 μm. (D) Imagen representativa de andamios incrustados seguida de análisis por IHQ con faloidina y DAPI a 10x aumento, barra de escala = 200 μm. Los cuadrados interiores más pequeños representan imágenes ampliadas (20x), barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = andamios de colágeno suplementados con condroitina-6-sulfato; H&E = hematoxilina y eosina; IHQ = inmunohistoquímica; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Expresión de proteínas por células de neuroblastoma cultivadas en andamios 3D basados en colágeno en comparación con plástico 2D. (A) Un esquema de cómo se realizó el ELISA CgA en medios acondicionados de células cultivadas en andamios 2D de plástico o 3D basados en colágeno. (B) Niveles de expresión de la proteína CgA tomados de medios acondicionados de células cultivadas en una monocapa de plástico 2D. Como las células alcanzaron la confluencia después de 7 días, el punto de tiempo de 14 días no era legible. Para el día 7 en plástico, no hubo diferencias significativas en los niveles de CgA entre las líneas celulares Kelly y KellyCis83. (C) ELISA CgA realizado utilizando medios acondicionados de células cultivadas en andamios a base de colágeno durante 14 días consecutivos. En el día 7, en ambos andamios de colágeno, los niveles de CgA son más altos en la línea celular KellyCis83 más agresiva, lo que pone de manifiesto niveles fisiológicamente más relevantes de CgA en la matriz 3D en comparación con la monocapa 2D. Esta figura ha sido modificada a partir de Curtin et al.17. Abreviaturas: 3D = tridimensional; 2D = bidimensional; CgA = cromogranina A; ELISA = ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas; nHA = nanohidroxiapatita; Coll-I-nHA = andamios de colágeno suplementados con nHA; GAG = glicosaminoglicano; Coll-I-GAG = andamios de colágeno suplementados con condroitina-6-sulfato; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbencidina; HRP = peroxidasa de rábano picante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.