Aplicación de interferencia CRISPR (CRISPRi) para silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira

Resumen

Aquí, se describe la aplicación de la interferencia CRISPR (CRISPRi) para el silenciamiento de genes específicos en especies de Leptospira. Las células de leptospira se transforman por conjugación con plásmidos que expresan dCas9 (catalíticamente "muerto" Cas9) y un ARN de guía única (sgRNA), responsable del emparejamiento de bases a la diana genómica deseada. Se presentan métodos para validar el silenciamiento génico.

Resumen

La leptospirosis es una zoonosis global desatendida, responsable de al menos 1 millón de casos al año y casi 60 mil muertes. La enfermedad es causada por bacterias patógenas y virulentas del género Leptospira,ya sea por contacto directo con las bacterias o indirectamente por la exposición al agua o al suelo contaminados. Los animales domésticos y salvajes actúan como reservorios de la infección, arrojando leptospiras de los túbulos renales colonizados del riñón, a través de la orina, al medio ambiente. La generación de cepas mutantes de Leptospira es fundamental para evaluar y comprender los mecanismos patógenos de la infección. La interferencia CRISPR (CRISPRi) ha demostrado ser una herramienta sencilla, asequible y específica para el silenciamiento de genes en leptospirapatógena. Por lo tanto, se describirán los detalles metodológicos de la obtención de los constructos del plásmido que contienen tanto dCas9 como ARN guía, la entrega de plásmidos a Leptospira por conjugación con la cepa β2163 de E. coli, y la recuperación y evaluación transconjugantes. Además, los medios de hornsby-alt-nally (HAN) recientemente descritos permiten el aislamiento relativamente rápido y la selección de colonias mutantes en placas de agar.

Introducción

La leptospirosis es una zoonosis mundial desatendida causada por especies patógenas y virulentas del género Leptospira. En humanos, la enfermedad representa más de un millón de casos y 60.000 muertes al año en todo el mundo^1,2. Hasta el momento, no existe una vacuna eficaz y a largo plazo para la enfermedad. La identificación de factores de virulencia y mecanismos patógenos es fundamental para el desarrollo de mejores estrategias terapéuticas y profilácticas. Por lo tanto, la capacidad de generar mutaciones genéticas y evaluar el fenotipo resultante es fundamental para el análisis genómico funcional^3.

La construcción de mutantes en Leptospira patógena se consideraba, hasta ahora, inherentemente ineficiente, laboriosa, costosa y difícil de implementar. Este escenario cambió drásticamente con la aplicación de la reciente interferencia CRISPR (CRISPRi) a leptospiras saprófitas⁴ y^{patógenas 5.}

El silenciamiento génico se consigue mediante la expresión de dos componentes: una variante de la enzima CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/C RISPR associated) enzima Cas9 de Streptococcus pyogenes,llamada catalíticamente muerta Cas9 (dCas9) y un ARN de guía única (sgRNA), que puede ser editado según el objetivo deseado^6,7,8. La proteína dCas9, cuando se une al sgRNA, se dirige a dianas específicas de ADN mediante el emparejamiento de bases de Watson y Crick, causando un bloqueo estérico a la elongación de la ARN polimerasa, lo que resulta en el silenciamiento de genes debido a la transcripción obstruida del gen⁷ (Figura 1).

Este manuscrito tiene como objetivo describir la construcción del plásmido para expresar tanto dCas9 como sgRNA, la conjugación entre el donante de E. coli β2163 y las células receptoras de Leptospira, la recuperación transconjugante y, finalmente, la validación de colonias mutantes seleccionadas.

Protocolo

1. Definición del protoespacial y construcción del plásmido

NOTA: En esta sección, se describe el primer paso de selección de protoespaciales apropiados para construir el sgRNA y la ligadura adicional en pMaOri.dCas9 (Figura 1). Esta secuencia protoespacial comprende una secuencia de 20 nucleótidos contra el objetivo deseado.

1. Obtener la secuencia de nucleótidos del gen de interés para silenciar en GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Envíelo al servidor web CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), con parámetros definidos para Streptococcus pyogenes Cas9 y el protoespaciador adyacente motivo NGG después de seleccionar el "Fasta Target". Defina los parámetros para "CRISPR/Cas9" y PAM (motivo adyacente protoespacial) NGG.
2. En base a los resultados obtenidos, seleccionamos protoespaciales con la mejor puntuación posible (flecha verde), que se encuentran lo más cerca posible del extremo 5' de la región codificante y, lo más importante, están contenidos en la plantilla (menos) hebra ya que el sgRNA debe emparejarse con la hebra codificante del gen para el silenciamiento génico completo.
   NOTA: El motivo NGG no está incluido en la secuencia final de sgRNA.
3. Utilice el promotor lipL32 para expresar el ARN guía único que contiene una secuencia de nucleótidos variable de 20 en el extremo 5' y una secuencia de andamios dCas9 conservada. Fusionar la secuencia de 20 nt, denominada protoespaciador, con el promotor lipL32 (en su extremo de 5' y el andamio sgRNA (extremo 3') (Figura 1B).
   NOTA: Para un promotor lipL32 bien definido, utilice la región promotora que comprende -334 al TSS (Transcription Start Site, basado en Zhukova et al.^9). Compruebe el archivo suplementario para el casete sgRNA final.
4. Generar el casete sgRNA por PCR secuencial⁵ o hacer que sea sintetizado por un proveedor comercial.
5. Después de obtener el casete, ligarlo en el plásmido pMaOri.dCas9 en el sitio de restricción XmaI en ambos extremos (cccggg)⁴.
   1. Digerir tanto el casete sgRNA como el plásmido pMaOri.dCas9 con la enzima de restricción XmaI y proceder a la ligadura(Figura 1B).
   2. Realizar los pasos de clonación en la cepa auxotrófica dT de E. coli π1^10,debido al origen pMaOri¹¹ (y por extensión, pMaOri.dCas9) de replicación, R6K-gamma.
      NOTA: Para un protocolo detallado para la ligadura y la selección de clones, consulte publicaciones anteriores de Fernandes y Nascimento¹². SgRNA-guided dCas9 se unirá a la cadena codificante del gen seleccionado de interés y, por lo tanto, obstruirá el alargamiento de la ARN polimerasa(Figura 1C),dando lugar a silenciamiento de genes.

2. Transformación de la leptospira por conjugación

NOTA: Un esquema gráfico de este paso se presenta en la Figura 2. Para hacer medios HAN y placas HAN, refiérase a Hornsby et al.¹³ y Fernandes et al.⁵.

1. Cultivar células patógenas de Leptospira a 29 o 37 °C en medios HAN¹³ bajo agitación diluyendo un cultivo saturado en HAN fresco a la 1:100; típicamente, L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 tarda 4-6 días en alcanzar la densidad celular adecuada.
   1. Asegúrese de que los cultivos alcancen un O.D. de 0.2-0.4 a 420 nm (2 a 5 x 10⁸ células/mL) antes de usarlo para la conjugación.
      NOTA: Dado que los medios HAN cambian de color a medida que aumentan las densidades celulares (debido al rojo fenol contenido en los medios DMEM), centrífuga (4.000 x g,15 min, temperatura ambiente) 1 mL del medio de cultivo para eliminar las leptospiras y aplicar sobrenadante como un espacio en blanco para medir el O.D.
2. Transformar la cepa conjugativa de E. coli β2163, auxotrófica para ácido diaminopimelico (DAP), con el plásmido pMaOri.dCas9 que contiene el casete sgRNA. Para E. coli transformación, utilice protocolos de choque térmico o electroporación. Incluir la transformación con el plásmido pMaOri.dCas9 sin casete sgRNA como control.
   1. Para la transformación de choque térmico, mezcle el ADN del plásmido (100 ng) con células de E. coli químicamente competentes e incube en hielo durante 30 min. Realizar choque de calor a 42 °C durante 90 s y colocarlo de nuevo en hielo durante 5 min. Recuperar las células añadiendo 1 mL de soporte LB, incubar a 37 °C durante 1 h y proceder al enchapado.
   2. Para la electroporación, utilice células electrocompetentes mezcladas con 100 ng de ADN plásmido. Utilice los siguientes parámetros para el pulso: 1,8 kV, 100 Ω y 25 μF. Recupere las células como se explicó anteriormente.
   3. Platee las células de E. coli del donante transformadas en el medio de agar LB complementado con el ácido diaminopimelic (DAP) (0.3 milímetros) y la espectinomicina (40 μg/mL) para seleccionar para los plásmidos.
3. Para la conjugación, seleccione una colonia de cada placa un día antes del día de la conjugación (que se determina mediante el monitoreo de la D.O. de cultivos de leptospiras).
   1. Seleccione una colonia de E. coli β2163 de las placas vacías de pMaOri.dCas9, y una de las placas de pMaOri.dCas9sgRNA. Déjalos crecer durante la noche en 10 mL de LB más DAP y espectinomicina a 37 °C.
   2. Al día siguiente, diluir los cultivos saturados 1:100 en 10 mL de LB fresco más DAP (no incluir el antibiótico aquí) hasta OD_420nm de 0.2-0.4. Normalmente, se necesitan 2-3 h para que E. coli alcance estas densidades.
4. Dentro de una campana de bioseguridad BSL2, monte un aparato de filtración colocando un filtro de membrana de ésteres de celulosa mixtos de 25 mm de diámetro y 0,1 μm de tamaño de poro en la parte superior de la base de vidrio. Coloque un embudo de vidrio de 15 mL en la parte superior y sostenga ambas piezas con abrazaderas de resorte. Conecte el vidrio a una bomba de vacío y agregue los cultivos al embudo para la filtración.
5. Añadir 5 mL de cultivo de Leptospira al embudo. Agregue un volumen de E. coli para constituir la proporción 1:1 basada en los valores de OD_420nm de ambas culturas. Encienda la bomba de vacío y concentre las células por filtración. Después de la concentración celular en el filtro de membrana, recupéralo cuidadosamente. Asegúrese de que el medio se filtra a través de la membrana.
   NOTA: La filtración tarda de 5 a 10 min.
6. Coloque el filtro en una placa EMJH disponible en el mercado (consulte tabla de materiales)complementada con DAP (0,3 mM). Asegúrese de que el lado de las bacterias está hacia arriba. Incubar las placas a 29 °C durante 24 h.
   NOTA: Si se utilizan placas HAN o EMJH¹⁴ suplementadas, E. coli puede proliferar y superar la proporción 1:1 prevista, lo que a su vez puede disminuir la eficiencia de conjugación^5.
7. Después de las 24 h, recupere los filtros de las placas y coloque cada filtro individual en un tubo cónico de 50 mL.
8. Utilice 1 mL de medio han líquido para liberar las células de la superficie del filtro por pipeteo extenso y vórtice.
9. Visualice las soluciones bacterianas mixtas recuperadas por microscopía de campo oscuro para verificar la viabilidad y la motilidad celular, y las proporciones de Leptospira: E. coli.
   NOTA: En esta etapa, se pueden ver números equivalentes de E. coli y Leptospira.
10. Diseminar 100-200 μL de este cultivo en placas HAN que contienen suero de conejo inactivado al 0,4% y 40 μg/mL de espectinomicina. Incubar placas a 37 °C en una atmósfera de CO_{2 al 3%.}
    NOTA: Normalmente, L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 células forman colonias en 5-7 días en placas de control y en 8-10 días en placas de espectinomicina. En esta etapa, E. coli no crecerá ya que son auxotróficos para laDAP.
11. Como control, diluir los cultivos a 10⁴ leptospiras/mL y añadir 100 μL en placas sin antibiótico, para controlar el crecimiento de la leptospira.

3. Selección de colonias y crecimiento y validación transconjugantes

NOTA: Las colonias deben ser evidentes para el día 10. Sin embargo, no son demasiado fáciles de visualizar. Normalmente en este punto de tiempo, las placas HAN son un poco opacas debido a las células secas que se extendieron y las colonias de Leptospira pueden aparecer como un halo transparente contra el fondo blanquecino. Se recomienda ver las placas en diferentes ángulos para lograr una diferente incidencia de luz, por lo tanto, haciendo que las colonias sean más evidentes. En tiempos de incubación más largos, las colonias pueden adquirir un aspecto más denso, y en este caso, se presentan como halos lechosos sobre un fondo oscuro.

1. Añadir 100 μL de medios HAN líquidos a cada microtubo de 1,5 mL para recuperar mutantes. Tome al menos 3 colonias de cada plato.
   1. Con la ayuda de una punta de micropipeta, "cavar" el agar para recuperar las colonias de las placas ya que las colonias de leptospiras pueden ser subsuperficiales.
      NOTA: Se espera que el agar sea llevado a lo largo de esta etapa. Las colonias deben tomarse de placas de control que contengan plásmido pMaOri.dCas9 vacío, y placas con leptospiras que contengan plásmidos que expresen tanto dCas9 como ARN guía único, diseñados para el gen diana.
   2. Dispensar la colonia recolectada en 100 μL de medios HAN en un microtubo de 1,5 mL y homogeneizar vigorosamente. En esta etapa, asegúrese de la ruptura máxima de la integridad del agar para liberar células. Vórtice la suspensión para 10 s.
2. Visualice las células recuperadas mediante microscopía de campo oscuro a un aumento de 200-400x agregando una gota de 5 μL en un portaobjetos de vidrio y cubra las muestras inmediatamente con un cubrebocas.
   1. Confirmar la presencia de leptospiras vivas y viables recuperadas de las colonias.
   2. Después de la visualización y confirmación de leptospiras viables, transferir 100 μL de células a medios HAN líquidos que contienen 40 μg/mL de espectinomicina.
3. Después del crecimiento en medios han líquidos, evaluar los cultivos para la presencia del plásmido con cebador pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) y R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), que reconocen la región que flanquea el casete sgRNA.
   1. Recoger 200 μL de cultivo, centrífuga (4.000 x g,15 min), desechar el sobrenadante y resuspend el pellet resultante en 20 μL de agua.
   2. Utilice esta suspensión como plantilla para pcr adicional, sin necesidad de extracción de ADN¹².
      NOTA: Las células con pMaOri.dCas9 representarán un amplicon de 281 pb, en comparación con las que contienen los plásmidos con el casete sgRNA que representará un amplicon de 723 pb.
4. Para la confirmación del silenciamiento de genes, realice un immunoblot utilizando extractos celulares de transconjugantes que contengan solo pMaOri.dCas9 (control negativo) y pMaOri.dCas9sgRNA.
   1. Aplique el equivalente de 5 x 10⁷ células por carril del gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS).
   2. Proteínas de electrotransferencia a una membrana para incubación con anticuerpos apropiados. Además del anticuerpo contra el gen diana para silenciar, utilice otro para el control de carga.
5. Mantenga los cultivos mutantes en medios HAN más espectinomicina para mantener el plásmido. Si no se aplican antibióticos a los medios, se puede observar un silenciamiento génico completo durante al menos tres pasajes⁵.

Resultados

A pesar de que el contenido de CG en los genomas de Leptospira spp. es típicamente alrededor del 35%; es probable que prácticamente todos los genes contengan el PAM 5'NGG 3'; este motivo debe considerarse en la hebra de la plantilla. Después de introducir la secuencia codificante de un gen (desde el inicio hasta los codones de parada), basándose en los resultados de CHOPCHOP, los protoespaciales deben seleccionarse en la hebra menos (-, plantilla). Es importante no incluir el motivo NGG en el protoespaciador sgRNA de 20 nt.

Si la conjugación se realiza con una proporción de 1:1 donante:célula receptora, durante 24 h en la superficie de las placas de agar EMJH más DAP, y 200 μL de la suspensión bacteriana recuperada se extienden sobre HAN más placas de agar espectinomicina, las colonias de transconjugantes deben ser visibles aproximadamente a los 8-10 días. La dispersión de este volumen normalmente resulta en 20-40 colonias por placa (Figura 3A). Para comprobar la viabilidad celular después de la conjugación, las células se pueden diseminar a placas HAN sin selección de antibióticos. En este caso, las colonias se pueden observar tan pronto como 7 días. Las placas HAN se vuelven de color amarillo pálido en una atmósfera de 3% de CO_2.

Después de la recolección de colonias y el crecimiento en medios líquidos más espectinomicina, se puede utilizar la PCR utilizando células enteras y cebadores pMaOri2 para un control de calidad inicial de los transconjugantes (Figura 3B). Las células leptospirales que contienen el plásmido control pMaOri.dCas9 deben dar lugar a un amplicon de 281 pb, mientras que aquellas células que contienen el plásmido para silenciar, es decir, que contienen tanto dCas9 como sgRNA, deben dar lugar a un amplicon de 723 pb. Las cartillas pMaOri2 F y R fueron diseñadas para flanquear el sitio de la restricción de XmaI, que es el sitio usado durante la ligadura del cassette del sgRNA.

Con la confirmación de la presencia de plásmidos, las células se pueden cosechar de los medios, lavarse dos veces con PBS y luego usarse para preparar un extracto de células enteras para immunoblotting. Si se produjera el silenciamiento, las proteínas diana, en este caso, ya sea LipL32 o ligA y LigB, deben observarse únicamente en las células de tipo salvaje y en las que contienen pMaOri.dCas9; incluso con tiempos de exposición más altos, no deben ser visibles proteínas correspondientes en las células que contienen pMaOri.dCas9sgRNA(Figura 3C).

Si se planifican experimentos para evaluar la virulencia de la leptospira después del silenciamiento génico, los cultivos utilizados para la conjugación deben ser de leptospiravirulenta de bajo paso. Después de que se confirma el silenciamiento de genes, se pueden congelar varias alícuotas como respaldo. Si el gen silenciado tiene un fenotipo medible, por ejemplo, basado en trabajos previos con proteínas recombinantes, los cultivos se pueden utilizar para la validación y, en este caso, las células que contienen pMaOri.dCas9 solamente, se pueden incluir como un control negativo.

Figura 1:Desarrollo de dCas9 y sgRNA que expresan plásmido. (A)Un protoespacielo de 20 nt de largo, seguido por el PAM 5'-NGG-3' de S. pyogenes dCas9, se selecciona dentro de la hebra de plantilla del gen diana para que el sgRNA posterior pueda realizar el emparejamiento de bases de Watson y Crick con la hebra codificante correspondiente, lo que resulta en un silenciamiento completo de genes. (B) El casete sgRNA está compuesto por el promotor lipL32, el protoespaciador de 20 nt y el andamio dCas9. El plásmido pMaOri.dCas9 se utiliza como columna vertebral para la ligadura de casete sgRNA en el sitio de restricción XmaI. El plásmido resultante, denominado pMaOri.dCas9sgRNA se entrega a los leptospiras, y la expresión tanto de dCas9 como de sgRNA es responsable del silenciamiento génico. (C)sgRNA-dirigido dCas9 actúa como una barrera física a la elongación de la ARN polimerasa, por lo tanto, dificultando la transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2:Representación esquemática del protocolo de conjugación. La especie deseada de Leptospira se cultiva en medios HAN, bajo agitación, hasta D.O. de 0.2-0.4 (fase de registro medio) a 420 nm. Un día antes de la conjugación, una colonia de donante recombinante de E. coli β2163 que contiene el plásmido de interés se recoge de las placas de agar LB+DAP+Spc, ya que las células se cultivan durante la noche en LB líquido con la misma suplementación. Al día siguiente, saturado E. Los cultivos de coli se diluyen en LB más DAP y se cultivan hasta la D.O. de 0.2-0.4 a 420 nm. Tanto el donante de E. coli como el receptor de Leptospira se mezclan a una proporción de células de 1:1 en la superficie de un filtro de 0,1 μm mediante un aparato de filtración bajo presión negativa. Luego, los filtros se colocan encima de las placas de agar EMJH complementadas con DAP, y la incubación continúa durante 24 h a 29 °C. El uso de EMJH limita la proliferación de E. coli, y se mantiene la proporción prevista de 1:1. Las bacterias se recuperan de los filtros mediante pipeteo con medios HAN de 1 mL, y las suspensiones se visualizan bajo microscopía de campo oscuro. Por último, se siembran 100-200 μL de cada suspensión en placas de agar HAN que contienen suero de conejo al 0,4% y se incuban a 37 °C en un 3% de_CO2. En esta etapa, se omite la DAP, y como resultado, E. coli auxotrófica no crecerá. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3:Resultados representativos para la evaluación de mutantes. (A)Se recogen colonias de placas que contienen Leptospira transformadas con pMaOri.dCas9 vacío (control negativo para futuros experimentos) y plásmidos pMaOri.dCas9sgRNA (con el gen dirigido silenciado), se homogeneizan vigorosamente en HAN líquido y se cultivan en HAN líquido que contiene espectinomicina. Las células recombinantes pueden ser validadas por PCR con cebadores flanqueando el sitio XmaI dentro de pMaOri.dCas9. (B)En este caso, las células que contenían pMaOri.dCas9 sólo resultaron en un amplicon de 281 pb, mientras que aquellas células que contenían el plásmido para silenciar, que contenía tanto dCas9 como sgRNA, mostraron un amplicon de 723 pb. Después de la confirmación de la presencia de los plásmidos, el silenciamiento del gen fue validado por análisis del immunoblot. (C)Se recomienda la incubación con anticuerpos tanto contra la proteína diana como contra una proteína control de carga; en el inmunoblot representativo, se muestran extractos de células enteras de transconjugantes que contienen pMaOri.dCas9 solos o con casetes de sgRNA dirigidos a lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) y los genes LigA y LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB). La co-incubación con anti-LipL32, anti-LigAB y anti-LipL41 (no objetivo, control de carga) confirma que la expresión de la proteína LipL32 se suprime en células que contienen pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 y tanto LigA como LigB en células que contienen pMaOri.dCas9sgRNAligAB. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Archivo suplementario: Secuencia de casete de ARN de guía única (sgRNA). La transcripción sgRNA es dirigida por el promotor constitutivo lipL32 (nucleótidos en negrita). sgRNA se compone de 20 nucleótidos que se refieren al protoespacial, responsable del emparejamiento de bases a la cadena codificante del gen diana, y la secuencia de andamios dCas9 (nucleótidos subrayados). Xma Los sitios de restricción I (cccggg) se incluyen en ambos extremos para la ligadura en el plásmido pMaOri.dCas9. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Después de la secuenciación temprana de las especies patógenas^{de 15,16, 17,18} y saprofíticas¹⁹Leptospira, la minería de datos del genoma arrojó luz sobre varios aspectos de la patogénesis de la leptospira. En la mayoría de los casos, la función de la proteína se exploró mediante el uso de la contraparte recombinante de las proteínas supuestas expuestas a la superficie de la leptospira y la posterior especulación de la función de la proteína nativa^{20,21,22, 23,24,25,26.} 

La generación de mutantes, y la evaluación de su respectivo fenotipo, son componentes clave del análisis genómico funcional. Los intentos^inicialesde generar mutantes en Leptospira spp. sin embargo, después de un análisis extenso y laborioso para inferir la identidad de genes alterados, se observó que sólo el 15% de todos los genes en L. interrogans serovar Manilae fueron interrumpidos²⁷. El knockout dirigido del gen fue alcanzado más a fondo por la recombinación homóloga que utilizaba los plásmidos del suicidio para entregar un cassette de la resistencia antibiótico flanqueado por los brazos homólogos dentro de la blanco deseada^31,32.

Mediante la aplicación de estas tecnologías, se exploraron varios aspectos de la biología básica de la leptospira y la virulencia^{31,33,34,35,36,37.} El desarrollo del vector lanzadera conjugativa E.coli-Leptospira, pMaOri ^11,permitió la entrega de componentes para el silenciamiento de genes episomales.

Anteriormente se demostró que la rotura de doble cadena inducida por Cas9 es letal para Leptospira spp. y, como alternativa, la variante catalíticamente inactiva de la enzima, dCas9, se puede utilizar para lograr el silenciamiento génico tanto en especies saprófitas como patógenas^4,5. Mediante el uso del plásmido pMaOri.dCas9 como columna vertebral para la ligadura de casetes de sgRNA, se puede obtener un silenciamiento génico específico y estable debido a la expresión tanto de dCas9 como de sgRNA; dCas9-bound sgRNA llevará a la proteína a la diana deseada por el emparejamiento de bases Watson-Crick.

Para el silenciamiento génico completo, el protoespaciador debe diseñarse en base a la hebra de plantilla del gen deseado para que el emparejamiento de bases del sgRNA se produzca con la hebra codificante. Basado en un contenido promedio de C+G del 35% en Leptospira spp., el PAM 5'-NGG-3' ocurrirá al menos 3 veces cada 100 pb. Por lo tanto, prácticamente cualquier gen dentro del genoma de Leptospira contendrá al menos un PAM. Sin embargo, si no se encuentra el motivo NGG, se puede evaluar el motivo NAG alternativo.

Las técnicas anteriores de silenciamiento de genes, como los dedos de zinc y TALE (efectores similares a los activadores de la transcripción), se basaron en la construcción de una proteína diferente para cada diana, lo que hace que estas técnicas sean laboriosas y costosas³⁸. En el caso de CRISPRi, el componente variable es el sgRNA, por lo que es necesario cambiar solo los 20 pb en el extremo 5'. Se ha observado un silenciamiento génico completo, estable y dirigido no sólo en Leptospira spp.^4,5,sino también en otras bacterias^8,39,40,41.

El desarrollo de HAN media¹³ favoreció la recuperación de mutantes al reducir drásticamente el tiempo de incubación para la formación de colonias y permitir que Leptospira creciera a 37 ^oC. Sin embargo, durante la etapa de conjugación, no se recomienda su uso ya que E. coli puede proliferar vigorosamente en este medio y superar la proporción prevista de 1:1 entre las células donantes y receptoras. En esta etapa, EMJH más DAP es la mejor opción, ya que E. coli se replica mal en este medio. Vale la pena mencionar que algunos laboratorios hacen EMJH suplementada internamente, que puede contener componentes adicionales que también podrían apoyar el crecimiento de las células de E. coli.

El protocolo de conjugación aquí presentado fue optimizado para L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130, y también se demostró que es eficaz en la transformación de una cepa patógena recientemente aislada a partir de muestras de suelo⁵. Los intentos iniciales con diferentes serovares de especies de L. borgpetersenii indican menores eficiencias de conjugación con el protocolo descrito. Así, cuando se trabaja con diferentes especies/serovares de Leptospira,las condiciones óptimas para la conjugación deben determinarse empíricamente, considerando las proporciones donante:célula receptora, densidades celulares iniciales, medios de conjugación y tiempo (24 y 48 h). Es razonable suponer que diferentes especies de Leptospira y serovares se comportarán de manera diferente con diferentes protocolos de conjugación.

A pesar de que las colonias saprófitas de Leptospira son relativamente fáciles de visualizar en placas, las colonias patógenas pueden ser más difíciles de observar. Normalmente, mediante el uso de medios HAN suplementados con suero de conejo al 0,4% y espectinomicina, se pueden observar colonias transconyugantes al día 10. En nuestra experiencia, las colonias se presentan inicialmente como un halo transparente en la superficie de los medios. En el protocolo de vídeo, se muestran colonias más densas, después de 14 días de crecimiento, ya que las transparentes eran difíciles de filmar. En esta etapa, la rotación de la placa para lograr una incidencia de luz diferente y el cambio entre fondos blancos y oscuros puede ayudar a identificar colonias.

Para la validación de mutantes, el immunoblotting ofrece un enfoque sencillo; sin embargo, dado que los anticuerpos no siempre están disponibles contra las proteínas diana, se pueden buscar estrategias alternativas para validar el silenciamiento de genes. La PCR cuantitativa de transcriptasa inversa (qRT-PCR) utilizando cebadores para el gen diana y un control constitutivo es eficaz para validar el silenciamiento génico ya que el dCas9 guiado por sgRNA es responsable del bloqueo de la transcripción génica. Si el gen diana codifica una banda proteica claramente definida en geles proteicos, SDS-PAGE puede demostrar silenciamiento, y según el silenciamiento del gen lipL32^5. Si se silencian los genes de la biosíntesis de los LPS, la coloración de los LPS puede ser empleada; en el caso de silenciar genes que codifican para enzimas con sustratos bien definidos, los ensayos cinéticos con sustratos cromogénicos son estrategias válidas; Β-galactosidasa silenciamiento en L. biflexa fue validado mediante el uso de X-gal y ONPG (orto-Nitrofenil-β-galactósido) sustratos^4.

Después de la confirmación del silenciamiento de genes, los experimentos se pueden diseñar para evaluar más a fondo el fenotipo. Los ensayos de unión se pueden realizar en el caso de silenciar las adhesinas bacterianas; los análisis del suero-desafío confirmaron el papel de LigA y de LigB en la supervivencia del suero exhibida por Leptospirapatógena^5. Los mutantes también se pueden utilizar para inocular animales para evaluar la atenuación de la virulencia; en este caso, los animales inoculados con el mutante deben compararse con los infectados con células que contienen pMaOri.dCas9 solamente.

En conclusión, el protocolo actual describe la aplicación de CRISPRi para el silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira utilizando medios HAN para facilitar la recuperación de mutantes en un plazo de 10 días. El silenciamiento génico combinado con el análisis genómico funcional mejorará nuestra comprensión de los mecanismos patógenos de Leptospiray, en última instancia, conducirá al desarrollo de mejores estrategias profilácticas para el control de la enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,1 y micro; m tamaño de poro membrana de ésteres de celulosa mixta	Millipore VCWP02500		Filtración para la conjugación bacteriana
Ácido 2,6-diaminopimélico (DAP)	Sigma	D1377	Crecimiento de E. coli auxotrófica β 2163
Agar Noble	BD & Empresa	214230	Se utiliza para la preparación de placas sólidas EMJH y HAN
Bacto Agar	BD & Empresa	214010	Se utiliza para la preparación de placas sólidas LB Sustrato
Clarity Western ECL	Biorad	170-5060	Sustrato quimioluminiscente
set dNTP	Thermo Fisher	10297-018	dNTPs para reacción PCR
Microanálisis de vidrio Portafiltros	Millipore	XX1012530	Filtración para conjugación bacteriana
Sistema de imagen	Biorad	ChemiDoc MP	Detección de quimioluminiscencia
Caldo LB, Miller	BD & Empresa	244620	Medio líquido lisogénico para E. coli cultivo
Leptospira Enriquecimiento EMJH	BD & Empresa	279510	Suplementación de EMJH media
Leptospira Base media EMJH	BD & Empresa	279410	Medio EMJH para Leptospira
Mini-PROTEAN TGX Geles 12%	Biorad	4568043	Utilizado para la eletroforesis en gel de poliacrilamida
Lector de densidad óptica	Molecular Devices	SpectraMax M2	Para mediciones de densidad óptica de cultivos bacterianos
Salina tamponada con fosfato 7.4	Sigma	806552	solución salina para el lavado de gránulos
Spectinomycin	Sigma	S0692	Selección de plásmidos de la columna vertebral pMaOri
Taq DNA Polymerase	Thermo Fisher	EP0402	Enyme, tampón y MgCl2 para la reacción de PCR
Termociclador	Biosistema aplicado	GeneAmp PCR System 9700	Utilizado para el ciclo de reacción de PCR
Timidina (dT)	Sigma	T9250	Crecimiento de E. coli y pi; auxotróficos. 1
Enzima de restricción XmaI	New Englan BioLabs	R0180L	Digestión de plásmidos e insertos