Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.
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Artículo de método
Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos
En este artículo
Resumen
Resumen
Para comprender completamente la fisiología celular de las neuronas y la glía en animales que se comportan, es necesario visualizar su morfología y registrar su actividad in vivo en ratones que se comportan. Este artículo describe un método para la implantación de una ventana craneal crónica para permitir la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida. En combinación con estrategias genéticas e inyecciones virales, es posible etiquetar células y regiones específicas de interés con marcadores estructurales o fisiológicos. Este protocolo demuestra cómo combinar inyecciones virales para etiquetar neuronas en las cercanías de los astrocitos que expresan GCaMP6 en la corteza para obtener imágenes simultáneas de ambas células a través de una ventana craneal. Las imágenes multifotónicas de las mismas células se pueden realizar durante días, semanas o meses en animales despiertos y de comportamiento. Este enfoque proporciona a los investigadores un método para ver la dinámica celular en tiempo real y se puede aplicar para responder a una serie de preguntas en neurociencia.
Introducción
La capacidad de realizar microscopía de fluorescencia multifotónica in vivo en la corteza de ratones es primordial para el estudio de la señalización celular y la estructura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, la patología de la enfermedad 10,11 y el desarrollo celular12,13
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas aprobadas por el IACUC en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska.
1. Antes de la cirugía
- Prepare pipetas para inyecciones virales. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato con un extractor de pipeta y bisele la pipeta en un ángulo de 20 °. Esterilizar las pipetas durante la noche.
- Prepare trozos frescos de espuma de gel estéril cortándolos en cuadrados pequeños. Sumerja la espuma de gel en un tubo de microfuge estéril que contenga 0,5 ml de solución salina. Remoje la espuma de gel en solución salina durante al menos 30 minutos ante....
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Resultados
La calidad de la ventana craneal se puede evaluar por lo nítidas que aparecen las estructuras neuronales. En una buena ventana, las espinas dendríticas son claramente visibles (Figura 1). Con los datos estructurales y posicionales almacenados, el mismo animal puede ser fotografiado repetidamente durante días, semanas o meses para examinar las mismas células (Figura 1). Las imágenes de la Figura 1 se obtuvieron de la región de la ext.......
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Discusión
Aquí, hemos presentado un protocolo para la implantación de ventanas craneales crónicas para imágenes in vivo de astrocitos corticales y neuronas en ratones despiertos y con la cabeza restringida en una jaula casera levantada por aire. Se han proporcionado ejemplos específicos de la aplicación de ventana craneal para imágenes de astrocitos que expresan GECI y estructuras sinápticas neuronales. Con el uso de la microscopía multifotónica, la dinámica de señalización astrocítica del calcio y la dinámica sináptica e.......
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15o Hoja puntiaguda | Surgistar | 6500 | Herramientas de Cirugía 19 |
| G Agujas | BD | 305186 | Suministro de Cirugía |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Vector Viral |
| AAV1-CaMKII-0-4-CRE | Addgene | 105558-AAV1 | Vector Viral |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reactivo |
| Almohadillas de preparación de alcohol | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Suministro de cirugía |
| Biseladora | Narishige | ||
| Equipo Borosilicato Vidrio | Precision Instruments | TW100F-4 | Suministro de cirugía |
| Fresas de carburo | SS White Dental | 14717 | Herramientas de cirugía |
| Carprofeno (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institucional, LLC.Drug | ||
| Aire Comprimido | Fisher Scientific | 23-022-523 | Suministros para cirugía |
| Aplicadores de punta de algodón | Puritan | 836-WC NO BINDER | Suministros para cirugía |
| Cubreobjetos, n.º 1 espesor, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 Suministros para | cirugía |
| Taladro dental | Equipo | aséptico | |
| Dexametasona, 4 mg/mL | Mylan Institucional, LLC. | ||
| Microscopio de disección de | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (líquido de cemento dental) | Patterson Dental | 602-8518 | Reactivo |
| Duralay Polvo (cemento dental en polvo) | Patterson Dental | 602-7932 | Reactivo |
| Enrofloxacina, 2.27% | Bayer | Droga | |
| Ungüento para los ojos | Dechra | 17033-211-38 | Suministro de cirugía |
| Fiber Lite Iluminador de alta intensidad | Dolan-Jenner Industries | Pinzas de equipo | |
| (grandes) | World Precision Instruments | 14099 | Pinzas de herramientas de cirugía |
| ( Pequeño) | Mundo Instrumentos de precisión | 501764 | herramientas de cirugía |
| GCaMP6f B6; 129S-GT(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | El Laboratorio Jackson | Nº de inventario: 024105 | Línea de ratones |
| Germinador | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | El Laboratorio Jackson | Nº de inventario: 012586 | línea de ratones |
| Cabezal | Neurotar | Modelo 1, Modelo 3 | Suministro de cirugía |
| Pinzas hemostáticas | World Precision Instruments | 501705 | Soporte |
| de herramientas quirúrgicas para cuchilla o Pointed | World Precision Instruments | 501247 | |
| quirúrgicas para hojas de bisturí | World Precision Instruments | 500236 | Herramientas |
| Almohadillas de preparación de yodo | Avantor | 15648-926 | Suministro de cirugía |
| Isoflurano | Piramal | Suministro de cirugía | |
| Sistema de sobremesa de isoflurano con caja de inducción Equipo de | aparatos | ||
| Vaporizador de isoflurano | Equipo SurgiVet | ||
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reactivo |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | adhesivo instantáneo de curado rápido |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | gel adhesivo de cianoacrilato |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instruments | Equipo | |
| microscopio | |||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | |
| Gas Oxígeno Matheson | OX M250 | ||
| Gas Picospritzer | Parker | sistema de dispensación de microinyección intracelular | |
| Puntas de pipeta | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Recortadora de pelo de roedores | Wahl | Equipment | |
| Solución salina (cloruro de sodio al 0,9%) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Hojas de bisturí, tamaño 11 | Integra | 4-111 Herramientas de | cirugía |
| Tijeras | World Precision Instruments | 503667 | Herramientas de cirugía |
| de | instrumentos estereotáxicos | ||
| Tiras de esponja Sugi (tiras de esponja) | Kettenbach Dental | 31002 | Suministro de cirugía |
| SURGIFOAM (espuma de gel) | Ethicon | 1972 | Jeringa de suministro de cirugía |
| con aguja de 26 g | BD | 309625 | Suministro de cirugía |
| Tamoxifeno | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reactivo |
| Ti:Zafiro Láser Coherente | |||
| Pipetas de Transferencia | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Suministro de Cirugía |
| Manta de agua | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xilocaína MPF con Epinefrina (1:200.000), 10 mg/ mL | Fresenius Kabi USA | Droga |
Referencias
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. <....
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Reimpresiones y permisos
