Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

Zhaokai Li; Liu Liu; Zhong Wang

doi:10.3791/62643

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Artículo de método

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

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DOI:

10.3791/62643

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22 de febrero de 2022

Zhaokai Li^*¹^,² , Liu Liu^*¹ , Zhong Wang¹

¹Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de los iCM a través del flujo de calcio (^{Ca2 +}).

Resumen

La reprogramación cardíaca se ha convertido en una terapia potencialmente prometedora para reparar un corazón dañado. Al introducir múltiples factores de transcripción, incluidos Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos se pueden reprogramar en cardiomiocitos inducidos (iCM). Estos iCM, cuando se generan in situ en un corazón infartado, se integran eléctrica y mecánicamente con el miocardio circundante, lo que lleva a una reducción en el tamaño de la cicatriz y una mejora en la función cardíaca. Debido a la eficiencia, pureza y calidad de reprogramación relativamente bajas de los iCM, la caracterización de los iCM sigue siendo un desafío. Los métodos utilizados actualmente en este campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR, se centran principalmente en la expresión de genes y proteínas específicas del corazón, pero no en la maduración funcional de los iCM. Desencadenada por potenciales de acción, la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje en los cardiomiocitos conduce a una rápida afluencia de calcio en la célula. Por lo tanto, cuantificar la tasa de afluencia de calcio es un método prometedor para evaluar la función de los cardiomiocitos. Aquí, el protocolo introduce un método para evaluar la función de iCM por flujo de calcio (^Ca2+). Se estableció una cepa de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 cruzando ratones Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (denominado Myh6-Cre a continuación) con ratones Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (denominados Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación). Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) de ratones neonatales P0-P2 se aislaron y cultivaron in vitro, y se introdujo una construcción policistrónica de MGT en los NCF, lo que llevó a su reprogramación a iCM. Debido a que solo los iCM reprogramados con éxito expresarán el reportero GCaMP3, la maduración funcional de los iCM se puede evaluar visualmente mediante flujo de ^{Ca2 +} con microscopía de fluorescencia. En comparación con los NCF no reprogramados, los NCF-iCM mostraron un flujo transitorio significativo de calcio y una contracción espontánea, similar a los CM. Este protocolo describe en detalle el establecimiento de cepas de ratones, el aislamiento y la selección de corazones de ratones neonatales, el aislamiento de NCF, la producción de retrovirus para la reprogramación cardíaca, la inducción de iCM, la evaluación del flujo de ^{Ca2 +} de iCM utilizando nuestra línea reportera, y el análisis estadístico relacionado y la presentación de datos. Se espera que los métodos descritos aquí proporcionen una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los iCM para estudios de reprogramación cardíaca.

Introducción

El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad grave en todo el mundo. Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo y representan aproximadamente 18,6 millones de muertes en 20191,2. La mortalidad total de las ECV ha disminuido durante el último medio siglo. Sin embargo, esta tendencia se ha ralentizado o incluso revertido en algunos países subdesarrollados1, lo que exige tratamientos más eficaces de las ECV. Como una de las manifestaciones fatales de las ECV, el IM representa aproximadamente la mitad de todas las muertes atribuidas a las ECV....