Imágenes espacio-temporales in vivo de sistemas oculares de administración de fármacos mediante microendoscopía láser confocal de fibra óptica

El aclaramiento sanguíneo, la distribución tisular y la ocupación objetivo de los medicamentos en los sistemas vivos son pilares para comprender la disposición in vivo de los medicamentos. En modelos animales preclínicos, estos parámetros generalmente se evalúan mediante muestreos frecuentes de sangre y tejidos en puntos de tiempo particulares después de la administración del medicamento. Sin embargo, estos procedimientos son generalmente invasivos, a menudo incluyen mediciones de no supervivencia y requieren grandes cohortes de animales para la potencia estadística. Puede haber costos y tiempo adicionales incurridos, junto con preocupaciones éticas por el uso excesivo de animales. Como resultado, las imágenes no invasivas se están convirtiendo rápidamente en un paso integral en los estudios de biodistribuciones. La microendoscopía láser confocal (^CLM1,2) es adecuada para aplicaciones oculares para obtener imágenes no invasivas de la distribución espacio-temporal de la terapéutica en los ojos de animales vivos con alta sensibilidad y alta resolución1,3,4.

CLM tiene el potencial de facilitar la detección robusta de los sistemas oculares de administración de fármacos (DDS), como los liposomas, antes de la cuantificación integral del DDS y la biodisponibilidad del fármaco. Los liposomas son atractivos por su flexibilidad para ajustar sus propiedades fisicoquímicas y biofísicas5,6,7,8,9,10,11 para encapsular una gran variedad de carga terapéutica y controlar el sitio tisular de liberación del fármaco y la duración de la acción. Los liposomas se han utilizado en aplicaciones oculares para la entrega de moléculas grandes, como el anticuerpo monoclonal ^{bevacizumab12}, y moléculas pequeñas como ciclosporina13 y ganciclovir14. Los liposomas cargados de fármacos tienen vidas medias biológicas más largas y efectos terapéuticos prolongados en comparación con las formulaciones de "fármacos libres" no liposomales. Sin embargo, la distribución de fármacos en el tejido ocular se extrapola típicamente a partir de las concentraciones de fármacos en los componentes fluidos del ojo (es decir, sangre, humor acuoso y humor vítreo15,16,17). Como el destino inicial in vivo de la carga de medicamentos cargada se define por las propiedades del propio nanoportador, las imágenes CLM de los liposomas fluorescentes pueden servir como sustitutos para que el medicamento revele la orientación del tejido y los tiempos de residencia del tejido in situ. Además, la evidencia visual de la administración con CLM puede dirigir el rediseño de DDS, evaluar los beneficios terapéuticos del fármaco y tal vez incluso predecir eventos biológicos adversos (por ejemplo, toxicidad tisular debido a la localización indeseable de DDS durante períodos prolongados de tiempo).

Aquí, se detalla un procedimiento paso a paso sobre cómo estudiar la biodistribución ocular de liposomas en ratones vivos con un sistema CLM de doble banda. Este sistema CLM específico puede detectar fluorescencia bicolor (con láseres de excitación verde y rojo a 488 nm y 660 nm) en tiempo real, con una frecuencia de 8 fotogramas/s. Al colocar físicamente la sonda de detección en el ojo, el protocolo demuestra la adquisición de imágenes y el análisis de liposomas verde-fluorescentes tras la administración subconjuntival en ratones preinyectados por vía intravenosa (IV) con colorante Azul evans (EB) al 2%. El tinte EB ayuda a visualizar las estructuras vascularizadas en el canal de fluorescencia roja. Mostramos resultados representativos de un estudio que evaluó liposomas neutros de 100 nm compuestos por el fosfolípido POPC (es decir, 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) y dopados con fosfolípido fl-DHPE marcado con fluoresceína (es decir, N-(fluoresceína-5-tiocarbamoil)-1,2-dihexa-decanoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina) en una proporción de 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM es capaz de capturar los liposomas marcados con fluoresceína verde a una resolución axial de 15 μm y lateral de 3,30 μm mediante la delineación de los límites del tejido ocular teñido con EB.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en SingHealth (Singapur). Los ratones hembra C57BL / 6 J (6-8 semanas de edad; 18-20 g) se obtuvieron de InVivos, Singapur, y se alojaron en un vivero de temperatura y luz controlada de la Escuela de Medicina Duke-NUS, Singapur. Los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices de la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.

NOTA: En la Figura 2 se muestra un diagrama de flujo que destaca los procedimientos principales.

1. Preparación de agentes de contraste: Evans Blue (EB) y liposomas

1. Para una solución de colorante de EB al 2%, disuelva 1 g de EB en 50 ml de solución salina estéril. Filtre la solución con filtros de 0,22 μm en tubos estériles de 1,5 ml y guárdelos a temperatura ambiente para su uso posterior.
2. Para los liposomas verde-fluorescentes, agregue POPC/Fl-DHPE (95:5), cloroformo/metanol (2:1) en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Utilice un evaporador rotativo a 150 rpm a 40 °C durante 1 h, con vacío mantenido a 0 ^mbar1 para crear una película lipídica delgada.
   NOTA: Al comparar los efectos de las propiedades liposomales (por ejemplo, tamaño, carga, saturación de lípidos, longitud de la cadena lipídica) en la distribución, mantenga un porcentaje fijo de Fl-DHPE u otros lípidos fluorescentes para confirmar que los resultados observados se deben al efecto de las propiedades probadas, y no a la carga variable de grandes colorantes hidrófobos.
3. Hidratar la película lipídica con solución salina tamponada con fosfato (para lograr 26,3 mM de liposomas fluorescentes) a 40 °C para formar vesículas multilamelares (MLV). Cargue los MLV en una jeringa de vidrio para extrusión manual (30 veces utilizando un filtro de policarbonato de tamaño de poro de 0,08 μm) para lograr el tamaño deseado de 100 nm.
   NOTA: La temperatura para la hidratación debe ser más alta que la temperatura de transición de los lípidos.
4. Filtre los liposomas pasándolos a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm. Confirme el diámetro hidrodinámico (_DH) de los liposomas utilizando un sistema dinámico de dispersión de luz.

2. Administración de EB y liposomas en ratones vivos

1. Inyecte al ratón eb IV (intravenosa) a través de la vena de la cola (2,5 mg/kg), 2 h antes de la inyección subconjuntival.
2. Para la inyección subconjuntival, primero, sedar al ratón usando isoflurano al 5% por inhalación en una cámara de inducción para lograr un plano adecuado de anestesia. Transfiera el ratón a un cono nasal y mantenga la sedación al 2% -2.5% de isoflurano mientras está en una almohadilla térmica durante todo el procedimiento.
3. Recorte los bigotes cerca del ojo a inyectar e inscríbase una gota de solución de clorhidrato de proxymetacaína anestésico tópico al 0,5% directamente sobre el ojo.
4. Cargue una jeringa de vidrio de 10 μL (con aguja de 32 G) con liposomas fluorescentes (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) y disipe todas las burbujas de aire en la jeringa antes de la inyección.
   NOTA: Se pueden acomodar hasta 20 μL de inyecto en el espacio subconjuntival de ^ratones18,19.
5. Usando una pinza, levante ligeramente la conjuntiva e inyecte lentamente en el espacio subconjuntival (Figura 1A). Retire la aguja lentamente para evitar el reflujo. Asegúrese de que se forma una ampolla visible llena de liposomas fluorescentes (Figura 1C).
6. Administre una gota de ácido fusídico antibiótico al 1% en el ojo después de la inyección y controle al ratón hasta que recupere la conciencia.

3. Configuración de CLM

1. Encienda el sistema CLM y asegúrese de que tanto el conector como la punta distal de la sonda de escaneo estén limpios.
2. Limpie el conector de la sonda de escaneo con un limpiador de conector óptico siguiendo las instrucciones del fabricante.
   1. Presione el rachet (a menudo de color) del limpiador del conector óptico para revelar una cinta de limpieza.
   2. Coloque el conector en contacto con la cinta de limpieza y deslice el conector a lo largo de la cinta mientras mantiene el contacto.
3. Limpie la punta distal (también conocida como punta de escaneo) de la sonda sumergiéndola en la solución de limpieza, seguida de la solución de enjuague proporcionada por el fabricante. También se puede usar un aplicador de punta de algodón para una limpieza más profunda si la punta está muy sucia.
4. Conecte la sonda al sistema CLM. Elija el campo de visión (FOV) y la ubicación de los archivos de adquisición en este punto.
   NOTA: Ajuste la intensidad del láser en este paso para asegurarse de que la detección de fluorescencia para Fl-DHPE esté en el rango lineal. La intensidad del láser debe mantenerse constante para la comparación entre imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo.
5. Permita que el sistema se caliente durante 15 minutos según las instrucciones y utilice el kit de calibración para calibrar el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: En el kit de calibración, hay tres viales para cada láser que contienen las siguientes soluciones: solución limpiadora, solución de enjuague y solución de fluoróforo de 488/660 nm para calibración interna. Los pasos de calibración son solicitados por el sistema y deben seguirse en consecuencia.
   1. Sumerja la punta en el vial de limpieza seguido del vial de enjuague (5 s en cada vial). Déjelo en el aire para la grabación de fondo para ambos canales.
      NOTA: Este paso es muy crucial, ya que normaliza los valores de fondo de las diferentes fibras de la sonda y garantiza la uniformidad de la imagen.
   2. Sumerja la punta en el vial de limpieza seguido del vial de enjuague (5 s en cada vial). Sumerja la punta en el vial de fluoróforo de 488 nm durante 5 segundos para normalizar los valores de señal de diferentes fibras en la sonda.
   3. Sumerja la punta en el vial de limpieza seguido del vial de enjuague (5 s en cada vial). Sumergir la punta en el vial de enjuague hasta que la señal de fluorescencia se registre en 3.5.2. Desaparece. Sumerja la punta en el vial de fluoróforo de 660 nm para normalizar los valores de señal de diferentes fibras en la sonda.
      NOTA: Siga todos los pasos de calibración para lograr una calibración adecuada y una calidad de imagen óptima.
6. Después de calibrar la sonda, compruebe que los valores de fondo de las sondas sean lo más bajos posible. Para el sistema CLM utilizado, mantenga los valores de fondo por debajo de 100. Realice una limpieza repetida de la sonda con un aplicador de punta de algodón y calibración si los valores están por encima de 100 / valor de usuario definido o si la sonda parece estar sucia. Esto es para garantizar que el ruido de fondo se mantenga alrededor del mismo valor.
   Nota : es importante definir el valor de fondo máximo (por ejemplo, 100 como se indica en el paso 3.6) para asegurarse de que las condiciones de sondeo son similares. Esto permitirá una comparación cuantitativa adecuada entre las imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo. El valor puede diferir en diferentes sistemas y condiciones de sonda.
7. Encienda el controlador de temperatura animal (ATC). Ajuste el ATC a 37 °C. Cubra la almohadilla térmica con una cortina quirúrgica y fije el cono nasal en la almohadilla térmica.
   NOTA: Se requiere ATC con una almohadilla térmica adjunta para garantizar que el animal se mantenga caliente durante toda la duración de la imagen.
8. Sujete el soporte del microscopio de disección a la mesa para asegurarlo. Gire y ajuste el ocular del microscopio para ver el ojo del ratón ergonómicamente a través del ocular cuando el usuario esté sentado (realice los ajustes después de colocar al animal).
9. Sedar al ratón usando isoflurano al 5% en una cámara de inducción. Transfiera el ratón al cono de la nariz una vez que el animal no responda y mantenga la sedación al 2% -2.5% de isoflurano mientras está en una almohadilla térmica durante todo el procedimiento.
10. Recorte los bigotes del ratón e instile una gota de solución anestésica de clorhidrato de proxymetacaína al 0,5% en el ojo.
11. Para asegurarse de que los ojos estén limpios, deje caer unas gotas de solución salina para lavar la superficie ocular.
12. Ajuste el microscopio para que el ojo del ratón esté enfocado directamente a un aumento de 0,67x.
    NOTA: Asegúrese de lubricar los ojos con solución salina. Si los ojos no están lubricados durante toda la sesión de imágenes, pueden secarse, haciendo que el cristalino se cristalice. Como resultado, durante las imágenes de CLM, la lente puede emitir una fluorescencia roja de fondo.

4. Imágenes en vivo de ojos de ratón con CLM y adquisición

1. Encienda el láser, coloque la sonda en el ojo y comience a registrar la adquisición para observar la fluorescencia en el ojo en las regiones indicadas en el mapa ocular en la Figura 3.
   NOTA: Sostenga la sonda como un bolígrafo con el extremo distal de la sonda directamente sobre la región a la que se va a tomar la imagen.
2. Detenga la grabación cuando todas las regiones hayan sido marcadas y etiquetadas. Los archivos de adquisición se guardarán automáticamente en la ubicación del archivo elegida en el paso 3.4.
   NOTA: El archivo se guardará como un archivo de video que se puede exportar a imágenes individuales. Etiquete la bandera de acuerdo con el mapa ocular para saber exactamente la ubicación de la sonda en el marco exacto en el que se realizó la grabación.

5. Análisis de imágenes

1. Utilizando el mismo software de adquisición CLM, exporte los archivos de adquisición de imágenes para su posterior análisis. Haga clic en archivo | Exporte y elija el formato al que se va a exportar. Los archivos de formato Mkt permitirán ajustes de la tabla de búsqueda (LUT) y posteriores exportaciones a formatos de archivo de imagen utilizando el software de visualización CLM.
2. Para una comparación precisa de la intensidad de la fluorescencia, utilice la misma LUT ajustada para cada canal al exportar todos los archivos de imagen.
   NOTA: Elija el umbral LUT mínimo y máximo con respecto a los del ratón control (sin liposomas inyectados) para minimizar las lecturas de fluorescencia de fondo.
3. Abra la imagen en un software de procesamiento de imágenes/programa gratuito apropiado (por ejemplo, ImageJ). Dibuje la región de interés (ROI).
   NOTA: ROI aquí se refiere a la región de interés en el programa de procesamiento. En la mayoría de los casos, el ROI será toda la imagen escaneada. Sin embargo, en el caso de obtener imágenes del limbo, la sonda no puede simplemente obtener la imagen del limbo por separado. Por lo tanto, se debe dibujar un ROI para "cuantificar" la fluorescencia en la región del limbo, como se dibuja en la Figura 4. Para mantener el ROI consistente, use el mismo ROI en todas las imágenes.
4. Mida y registre los valores de ROI para la fluorescencia verde. Introduce los valores en una hoja de cálculo. Tabular los valores de intensidad media y de fluorescencia (u.a.) del ROI.

6. Evaluación histología

1. Sacrificar al ratón utilizando un método aprobado por el IACUC local.
2. Enucle el ojo y fije el ojo en 1 ml de formaldehído al 4% o solución de formalina al 10% durante la noche.
3. Recorte el exceso de grasas e incruste el ojo en el compuesto de Temperatura Óptima de Corte (OCT) y manténgalo congelado en un congelador de -80 ° C durante al menos un día.
4. Corte secciones de 5 μm de espesor en el criostato con temperatura de corte mantenida a 20 °C. Transfiera la sección a un portaobjetos de microscopio recubierto de poli-L-lisina.
   NOTA: La histología puede servir como validación adicional de la distribución de DDS. Sin embargo, requiere optimización adicional, experiencia técnica y sacrificio de animales que el estudio pretende reducir mediante el uso de CLM.

El protocolo demuestra la utilidad de CLM para evaluar la distribución ocular espacio-temporal de liposomas fluorescentes verdes administrados a través de inyección subconjuntival. Para hacer uso de la capacidad de doble color (longitudes de onda de excitación de 488 nm y 660 nm) del sistema CLM, los liposomas POPC neutros de 100 nm que se inyectaron se doparon con 5% de Fl-DHPE (los datos de composición y caracterización se muestran en la Figura 1B), y EB se inyectó IV para identificar puntos de referencia en el ojo. La presencia de una capa delgada de epiesclera y la conjuntiva, ambas altamente vascularizadas, permite que la región de la esclerótica se tiña de rojo con EB (Figura 4A, etiquetada como S), mientras que la córnea que no contiene ninguna vasculatura (Figura 4A, etiquetada como C), no se tiñe y aparece negra. Esto permite una diferenciación distinta entre ambas regiones durante las imágenes de fluorescencia.

Los resultados representativos son de un estudio de distribución que abarca más de 7 días (n = 4 ratones). Como las intensidades de fluorescencia en las imágenes para el día 1 y el día 3 fueron altas (Figura 5B), las intensidades de píxeles se redujeron para una mejor visualización. Los valores reales de la intensidad de fluorescencia se reflejan en los gráficos (Figura 6). Para asegurar que las observaciones de las imágenes se debieron a la fluorescencia de los liposomas y no al tinte libre, que podría haberse desprendido de los liposomas, se incluyeron ratones de control inyectados con colorante de fluoresceína (Fl) (Figura 5A).

Se observó una reducción en los liposomas (por poder de la disminución de la señal fluorescente verde) tanto en las regiones del limbo como en las de la esclerótica a lo largo del tiempo. A medida que los liposomas se inyectaron desde la región temporal a la superior del espacio subconjuntival (Figura 3), se colocaron naturalmente justo encima de la esclerótica temporal y superior (Figura 4B) antes de llegar a otras regiones del espacio subconjuntival. En el día 1 después de la inyección, la fluorescencia detectada en la esclerótica fue hasta 6 veces mayor que el limbo para las regiones temporal y superior (Figura 6). Para el día 3 y el día 7, se observó una reducción significativa de liposomas en la esclerótica (60% del día 1 al día 3 (día 1→3) y del 88% del día 3 al día 7 (día 3→7)) en la región temporal, con una reducción del 66% y del 93% para el día 1→3 y el día 3→7 en las regiones superiores, respectivamente, p < 0,001) (Figura 6). Esta reducción se atribuyó a los mecanismos de aclaramiento ocular a través de los vasos sanguíneos y/o linfáticos que se encuentran en la conjuntiva y la epiesclera. Los liposomas también podrían haberse difundido a través de la esclerótica y ser eliminados por la coroides, que también está altamente vascularizada.

Se encontró que los liposomas se habían eliminado de una manera más lenta en el limbo. Para el limbo temporal y el limbo superior, los cambios en las señales de fluorescencia desde el día 1 hasta el día 3 después de la inyección no fueron significativos, lo que indica que los liposomas neutros tienen una preferencia por la región del limbo, particularmente la periferia corneal (Figura 5B). Los liposomas en la región del limbo comenzaron a desaparecer a partir del día 3 (d3→7: -89% para el temporal (p < 0,01) y -53% para el superior (p < 0,05)). Para el día 7, más del 90% de los liposomas fueron eliminados de todas las regiones del limbo (p < 0,05) excepto del limbo superior 1S, donde el 50% de los liposomas aún podían detectarse (p > 0,05). Esto es una indicación de que el tiempo de residencia para los liposomas neutros es mucho mayor en la periferia superior del limbo/córnea (Figura 5 y Figura 6) en comparación con otras regiones. La menor cantidad de fluorescencia se detectó en las regiones nasal e inferior en todos los puntos temporales debido a su distancia del sitio de inyección (Figura 6A, B).

En estudios más completos de aclaramiento de liposomas en el ojo previamente reportados1, hemos discutido algunas rutas en las que los liposomas podrían ser eliminados de los tejidos oculares después de la inyección subconjuntival. Si bien los liposomas pueden ser eliminados por la circulación sistémica y el aclaramiento linfático a través de la conjuntiva, la epiesclera y la coroides, que están altamente vascularizados, también podrían llegar a los tejidos intraoculares más profundos por difusión pasiva a través de la esclerótica. El flujo de líquido también podría transportar los liposomas a través de la malla trabecular o la salida de la uveosclera, lo que puede llevar a los liposomas de vuelta a la esclerótica. La eliminación a través de desgarros también es posible, y las fugas menores en el sitio de inyección podrían permitir la penetración corneal a través de la difusión pasiva.

Figura 1: Inyección subconjuntival de liposomas en el ojo. (A) Representación gráfica de liposomas verde-fluorescentes e inyección subconjuntival. (B) Composición y propiedades de la formulación liposomal dopada con FL-DHPE para imágenes oculares de CLM. (C) Liposomas verde-fluorescentes que forman una ampolla en la inyección subconjuntival. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Chaw S.Y. et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cronología del procedimiento de LMC ocular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Mapa ocular para exploraciones CLM. El área 1 se refiere a la región del limbo, mientras que el área 2 se refiere a la región de la esclerótica. Los videos e imágenes se tomaron desde 1T en sentido contrario a las agujas del reloj, seguido de 2T en una dirección similar en sentido contrario a las agujas del reloj. Como la aguja se insertó para inyección de 2T a 2S, las áreas de interés son principalmente 1T, 1S, 2T y 2S. Insertar muestra el tamaño de la sonda en relación con el ojo del ratón. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Chaw S.Y. et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de imágenes. (A) El análisis imageJ de liposomas marcados con fluorescentes se realizó utilizando regiones de interés (ROI) definidas para las regiones oculares del limbo (L) y la esclerótica (S) (B) cuantificadas en la región del limbo para la presencia de liposomas. Las posibles localizaciones de los liposomas detectados en el limbo son 1) periferia corneal, 2) limbo o 3) periferia de la esclerótica. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Chaw S.Y. et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Distribuciones de contraste en el limbo y la esclerótica. Distribución del contraste en las regiones del limbo (1S: Superior, 1N: Nasal, 1I: Inferior, 1T: Temporal) y esclerótica (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) de un ratón representativo de cada cohorte (n = 4) durante 7 días para (A) control de fluoresceína (Fl), (B) liposomas neutros de 100 nm (POPC-100). El color rojo indica tinción EB. Barra de escala = 50 μm. (C) Las imágenes tomadas se ensamblan en el mapa ocular para una mejor comprensión. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Chaw S.Y. et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Cinética de aclaramiento de liposomas POPC neutros de 100 nm en las regiones de esclerótica (A) y limbo (B) durante 7 días (n = 4 ratones por grupo). La intensidad media de fluorescencia se comparó mediante ANOVA de 2 vías con comparaciones múltiples con respecto al punto de tiempo anterior; d1→3 y d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Imágenes histológicas representativas de secciones transversales (5 μm) del ojo de ratón un día después de la inyección de liposomas Fl-DHPE. Las líneas punteadas indican dónde se pueden observar los liposomas, indicados por el color verde. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.