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Artículo de método

Propagación de células y órganos dentales y respiratorios en microgravedad

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DOI:

10.3791/62690

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25 de mayo de 2021

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1Center for Craniofacial Research and Diagnosis, Texas A&M College of Dentistry, 2Department of Stomatology, The Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, 3Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Insititute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método para el cultivo y crecimiento 3D de células similares a ameloblastos en microgravedad para mantener su forma alargada y polarizada, así como la expresión de proteínas específicas del esmalte. También se describen las condiciones de cultivo para el cultivo de construcciones de ingeniería periodontal y órganos pulmonares en microgravedad.

Resumen

La gravedad es uno de los determinantes clave de la función celular humana, la proliferación, la arquitectura citoesquelética y la orientación. Los sistemas de biorreactores rotativos (RCCS) imitan la pérdida de gravedad a medida que ocurre en el espacio y, en cambio, proporcionan un entorno de microgravedad a través de la rotación continua de células o tejidos cultivados. Estos RCCS aseguran un suministro ininterrumpido de nutrientes, factores de crecimiento y transcripción, y oxígeno, y abordan algunas de las deficiencias de las fuerzas gravitacionales en placas de cultivo de células u órganos 2D (bidimensionales) inmóviles. En el presente estudio hemos utilizado CCR para cocultivar células del asa cervical y células de la pulpa dental para que se conviertan en ameloblastos, para caracterizar las interacciones progenitor/andamio periodontal y para determinar el efecto de la inflamación sobre los alvéolos pulmonares. Los entornos de RCCS facilitaron el crecimiento de células similares a los ameloblastos, promovieron la proliferación de progenitores periodontales en respuesta a los recubrimientos de andamios y permitieron una evaluación de los efectos de los cambios inflamatorios en los alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume las condiciones ambientales, los materiales y los pasos a lo largo del camino y destaca los aspectos críticos y los detalles experimentales. En conclusión, los RCCS son herramientas innovadoras para dominar el cultivo y el crecimiento 3D (tridimensional) de células in vitro y para permitir el estudio de sistemas celulares o interacciones no susceptibles a entornos de cultivo 2D clásicos.

Introducción

La gravedad afecta todos los aspectos de la vida en la Tierra, incluida la biología de las células individuales y su función dentro de los organismos. Las células detectan la gravedad a través de mecanorreceptores y responden a los cambios en la gravedad reconfigurando las arquitecturas citoesqueléticas y alterando la división celular 1,2,3. Otros efectos de la microgravedad incluyen la presión hidrostática en vesículas llenas de fluido, la sedimentación de orgánulos y la convección impulsada por flotabilidad del flujo y el calor4. Los estudios sobre el efecto de la pérdida de gravedad en las células y órganos humanos se realizaron originalmente para simular el entorno ingrávido del espacio en astronautas durante misiones de vuelo espacial5. Sin embargo, en los últimos años, estas tecnologías de biorreactores 3D desarrolladas originalmente por la NASA para simular la microgravedad se están volviendo cada vez más relevantes como enfoques novedosos para el cultivo de poblaciones celulares que de otro modo no serían susceptibles a los sistemas de cultivo 2D.

Los biorreactores 3D simulan la microgravedad haciendo crecer células en suspensión y creando así un efecto constante de "caída libre". Otras ventajas de los biorreactores rotativos incluyen la falta de exposición al aire que se encuentra en los sistemas de cultivo de órganos, una reducción en el esfuerzo cortante y la turbulencia, y una exposición continua a un suministro cambiante de nutrientes. Estas condiciones dinámicas proporcionadas por un biorreactor del Sistema de Cultivo Celular Rotatorio (RCCS) favorecen la colocalización espacial y el ensamblaje tridimensional de células individuales en agregados 6,7.

Estudios previos han demostrado las ventajas de un biorreactor rotatorio para la regeneración ósea8, el cultivo de gérmenes dentales9 y para el cultivo de células del folículo dental humano10. También ha habido un informe que sugiere que el CCR mejora la proliferación y diferenciación de células EOE en ameloblastos11. Sin embargo, las células diferenciadas fueron consideradas ameloblastos basadas en la inmunofluorescencia de ameloblastina y/o expresión de amelogenina sola11 sin considerar su morfología alargada o forma celular polarizada.

Además del biorreactor de vasos de pared giratoria (RWV) desarrollado por la NASA, otras tecnologías para generar agregados 3D a partir de células incluyen la levitación magnética, la máquina de posicionamiento aleatorio (RPM) y el clinostat12. Para lograr la levitación magnética, las células marcadas con nanopartículas magnéticas son levitadas utilizando una fuerza magnética externa, lo que resulta en la formación de estructuras 3D sin andamios que se han utilizado para la biofabricación de estructuras de adipocitos13,14,15. Otro enfoque para simular la microgravedad es la generación de fuerzas G multidireccionales mediante el control de la rotación simultánea alrededor de dos ejes, lo que resulta en una cancelación del vector de gravedad acumulativo en el centro de un dispositivo llamado clinostat16. Cuando las células madre de la médula ósea se cultivaron en un clinostato, se inhibió la formación de hueso nuevo a través de la supresión de la diferenciación de osteoblastos, ilustrando uno de los efectos desdiferenciadores de la microgravedad16.

Los sistemas in vitro para facilitar el cultivo fiel de ameloblastos proporcionarían un gran paso adelante hacia la ingeniería del tejido del esmalte dental17. Desafortunadamente, hasta la fecha, el cultivo de los ameloblastos ha sido una tarea desafiante18,19. Hasta ahora, se han reportado cinco líneas celulares diferentes similares a los ameloblastos, incluida la línea celular de linaje de ameloblastos de ratón (ALC), la línea celular epitelial dental de rata (HAT-7), la línea celular LS8 de ratón 20, la línea celular porcina PABSo-E21 y la línea celular22 de SF2-24 de rata. Sin embargo, la mayoría de estas células han perdido su forma distintiva de células polarizadas en el cultivo 2D.

En el presente estudio hemos recurrido a un sistema de biorreactor de cultivo celular rotatorio (RCCS) para facilitar el crecimiento de células similares a ameloblastos a partir de epitelios de asa cervical cocultivados con progenitores mesenquimales y para superar los desafíos de los sistemas de cultivo 2D, incluido el flujo reducido de nutrientes y los cambios citoesqueléticos debido a la gravedad. Además, el RCCS ha proporcionado nuevas vías para el estudio de las interacciones célula/andamio relacionadas con la ingeniería del tejido periodontal y para examinar los efectos de los mediadores inflamatorios en los tejidos alveolares pulmonares in vitro. En conjunto, los resultados de estos estudios destacan los beneficios de los sistemas de cultivo rotatorio basados en microgravedad para la propagación de epitelios diferenciados y para la evaluación de los efectos ambientales en las células cultivadas in vitro, incluidas las interacciones célula/andamio y la respuesta tisular a las afecciones inflamatorias.

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Protocolo

Se obtuvo toda la aprobación institucional necesaria para garantizar que el estudio cumpliera con las pautas institucionales de cuidado animal de TAMU.

1. Montaje y esterilización del biorreactor

  1. Esterilice cuatro recipientes de alta relación de aspecto (HARV) para el biorreactor en un autoclave en el ciclo del instrumento de plástico durante 20 minutos a 121 °C según lo recomendado por el fabricante.
  2. Después de la esterilización, ensamble los recipientes en una campana de cultivo celular apretando los tornillos provistos con el biorreactor, después de lo cual los recipientes están listos para usar.

2. Andamios utilizados para el experimento de cocultivo del biorreactor

  1. Incubar los andamios junto con las células para proporcionar soporte para la unión celular necesaria para un mayor crecimiento.
  2. Elija entre andamios basados en PGA, andamios de hidroxiapatita, láminas de grafeno, discos de gelatina y andamios a base de colágeno para estudios de cocultivo.

3. Disección del asa cervical (CL) y preparación de una sola célula

  1. Sacrificar ratones por decapitación después de un paro respiratorio por sobredosis deCO2 .
    NOTA: Todos los estudios en animales cumplen con las pautas institucionales de cuidado animal de TAMU.
  2. Diseccionar los bucles cervicales de ratones postnatales (DPN) de 6 días siguiendo una versión modificada de un protocolo23 publicado previamente.
    NOTA: En nuestro estudio, se incluye la porción distal del asa cervical no mostrada en el protocolo publicado anteriormente (Figura 3).
    1. Lavar el tejido disecado con PBS estéril en frío antes de la digestión con colagenasa dispasa a 37 °C durante 30 minutos.
  3. Pasar la solución a través de un filtro de células estéril de 70 μm y centrifugar a 800 x g durante 10 minutos.
  4. Deseche el sobrenadante. Centrifugar el pellet y lavar dos veces con PBS frío a 800 x g. Deseche el sobrenadante.
  5. Contar las células con un hemocitómetro y añadir 1 X 105 células por vaso.

4. Cultivo celular de la pulpa dental y expansión de la línea celular

  1. Placas de células de la pulpa dental en una placa de cultivo tisular de 100 mm en el paso 4 a una concentración de 1 x 105.
  2. Preparar los medios para el cultivo que consiste en medios de glucosa alta en DMEM, suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibióticos/antimicóticos (P/S).
  3. Cuando las células alcancen el 85-90% de confluencia, aspire el medio y lave las placas dos veces con PBS precalentado.
  4. Después del lavado de PBS, agregue una solución precalentada de tripsina-EDTA al 0,25% a la placa e incube las placas que contienen células de la pulpa dental a 37 °C durante 3 minutos.
  5. Confirme el desprendimiento de células mediante inspección visual con un microscopio.
  6. Recoger el medio junto con las células de la placa de cultivo y transferir a través de una pipeta de 25 ml a un tubo cónico estéril de 50 ml.
  7. Centrifugar las células a 800 x g durante 8 minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en medios frescos y contar con un hemocitómetro.
  8. Para el cocultivo con células del asa cervical, sembrar las células de la pulpa dental en el biorreactor a una concentración de 1 x 104 por vaso.

5. Cocultivo de células del asa cervical/pulpa dental en un andamio dentro del biorreactor RCCS

  1. Agregue ambos tipos de células, el asa cervical y la pulpa dental al medio de cultivo que contiene medios SFM de queratinocitos con factores de crecimiento suplementados, proteínas de matriz extracelular y andamios.
    NOTA: Los factores de crecimiento se añaden a una concentración de 0,03 μg/ml de proteína morfogenética ósea 2 (BMP 2), 0,03 μg/ml de proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4), 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinantes humanos (hFGF) y 15 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (hEGF), mientras que los componentes de la ECM incluyeron 200 μg/ml de Matrigel, 5 μg/ml de laminina y 5 μg/ml de fibronectina.
  2. Recubra los andamios con una mezcla de 500 μL de gel de colágeno enriquecido con 1 mg de péptido LRAP (péptido de amelogenina rico en leucina), 1 mg de matriz de esmalte liofilizada en etapa temprana preparada a partir de dientes porcinos24, 5 μg / ml de laminina y 5 μg / ml de fibronectina.
    NOTA: Esto funcionó mejor para nuestros experimentos.
  3. Después del recubrimiento del andamio, agregue ambas células y el andamio al biorreactor y llene el biorreactor con 10 ml de medio por recipiente.
  4. Cierre la tapa del puerto de llenado del recipiente del biorreactor después de agregar medios, celdas y andamios.
  5. Conecte las válvulas estériles a los puertos de la jeringa al comienzo del experimento y manténgalas en su lugar con una cubierta hasta el final del experimento.
  6. Una vez que el recipiente esté lleno al 90% y las tapas del puerto de llenado estén cerradas y apretadas, abra las válvulas estériles.
  7. Use dos jeringas estériles (3 ml) cada vez que se requiera un cambio de medio. Llene una jeringa con medio fresco mientras la otra jeringa se deja vacía.
  8. Abra ambas válvulas de jeringa y maniobra suavemente las burbujas hacia el puerto vacío de la jeringa.
  9. Una vez que el medio fresco de la jeringa llena se inyecta cuidadosamente en el recipiente, retire las burbujas a través del puerto vacío de la jeringa.
    NOTA: Este procedimiento se realiza hasta que se eliminan todas las microburbujas de los vasos.
  10. Cierre los puertos de la jeringa con tapas y deseche las jeringas en un contenedor de residuos de objetos punzantes.
  11. Acople cada vaso a la base del rotador y coloque la base del rotador en una incubadora con un 5% deCO2 y una temperatura de 37 °C.
  12. Encienda la alimentación y ajuste la velocidad de rotación a 10,1 rpm.
    NOTA: Ajuste la velocidad para asegurarse de que los andamios estén en suspensión sin tocar la pared del recipiente.
  13. Para el cambio de medios, coloque los vasos en posición vertical para asegurarse de que las células se asienten en la parte inferior. Abra los puertos de la jeringa y conecte las jeringas estériles a los puertos.
  14. Siga el mismo procedimiento aspirando el 75% del medio agotado en nutrientes e inyectando medio fresco a través del otro puerto.

6. Preparación de órganos pulmonares y cultivo basado en biorreactores

NOTA: Se utilizaron crías de ratón de tipo salvaje E15 para la preparación de órganos pulmonares.

  1. Diseccionar el tejido pulmonar después de la eutanasia de una ratona hembra embarazada con asfixia porCO2 .
    1. Una vez confirmada la muerte tras asfixia por luxación cervical, utilizar un bisturí para exponer la cavidad torácica. A partir de entonces, retire a los cachorros del útero y eutanasia por decapitación.
  2. Después de la eutanasia, prepare la cavidad torácica abriéndola con un bisturí para localizar los pulmones. Lave pequeños segmentos de tejido pulmonar con PBS estéril y colóquelo en una membrana preesterilizada durante 2 horas con medio de cultivo de órganos en una incubadora que contenga 5% deCO2 y 37 °C de temperatura.
  3. Una vez que los tejidos pulmonares se adhieren a la membrana en una placa de cultivo de órganos 2D, transfiera las muestras al recipiente del biorreactor.
  4. Preparar los medios de comunicación para la cultura.
    NOTA: El medio de control DMEM de alta glucosa contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), solución antibiótica al 1% (P/S) (penicilina, 100 U/mL, estreptomicina, 50 μg/mL) y 100 μg/mL de ácido ascórbico (AA) y para la inducción de afecciones inflamatorias, el medio control se complementa con 5 ng/mL de proteína IL-6.
  5. Llevar a cabo el experimento de cultivo pulmonar durante 10 días con un cambio de medios cada 48 horas en el biorreactor como se describió anteriormente.

7. Andamio recubierto con cultivo celular del ligamento periodontal humano (hPDL)

  1. Cultivar células del ligamento periodontal humano.
    NOTA: Las células se aíslan y se cultivan en nuestro laboratorio según el protocolo publicado anteriormente25.
  2. Cubra los discos de andamio de colágeno con 30 μL de PBS para el grupo control y el neuropéptido galanina (GAL) a una concentración de 10-8 durante la noche.
  3. Sembrar células PDL humanas en el andamio de control y recubierto de GAL durante 2 horas a 37 °C en una placa de cultivo, y transferir los andamios sembrados de células a un recipiente de biorreactor como se mencionó anteriormente.
  4. Cultive los andamios sembrados por células durante 14 días en el biorreactor antes de cosechar los andamios para su análisis.

8. Limpieza y mantenimiento del biorreactor

  1. Después de que los andamios/células se hayan cosechado del biorreactor, retire los puertos de la jeringa del recipiente.
    NOTA: Los tornillos alrededor de los recipientes se retiran y el recipiente se lava suavemente con agua jabonosa.
  2. Enjuague los recipientes con agua limpia y apriete los tornillos una vez más.
  3. Guarde los recipientes después del autoclave hasta el próximo uso.

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Resultados

La cámara interior del biorreactor proporciona un entorno para que las células proliferen y se diferencien, se adhieran a un andamio o se congreguen para formar tejidos como ensamblajes. Cada vaso HARV contiene hasta 10 ml de medio y facilita una circulación constante de nutrientes para que cada célula tenga una excelente oportunidad de sobrevivir. La Figura 1A ilustra la fijación de los puertos de la jeringa a la placa frontal del recipiente donde se conectan las válvulas estériles de una s...

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Discusión

Los pasos críticos del protocolo para el crecimiento de células en microgravedad incluyen el biorreactor, el andamio, las células utilizadas para el cultivo 3D y el recubrimiento de andamio como medio para inducir la diferenciación celular. El tipo de biorreactor utilizado en nuestros estudios comprende el biorreactor RCCS-4, una modificación reciente del dispositivo de cultivo de tejido cilíndrico giratorio original del Sistema de Cultivo de Células Rotativas (RCCS) desarrollado por la NASA para cultivar células en micr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los estudios fueron generosamente apoyados por subvenciones del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (UG3-DE028869 y R01-DE027930).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antibiótico-antimicóticoThermoFisher Scientfic15240096
Ácido ascórbicoSigma AldrichA4544
BGJb Fitton-Jackson Medios de modificaciónThermoFisher Scientfic12591
BIOST PGA andamioSyntheconCustomDisponible de la empresa a través de un pedido personalizado
BMP-2R& D Systems355-BM
BMP-4R& D Systems314-BP
DMEM MediaSigma AldrichD6429-500mL
FBSThermoFisher Scientfic 16140071
FibricolAdvanced Biomatrix5133-20mL
FibronectinaCorning 354008
GalaninaSigma AldrichG-0278
Disco de gelatinaAvanzado BiomatrixCytoForm 500
Láminas de grafenoAdvanced BiomatrixCytoForm 300
hEGFPeprotechAF-100-15
hFGFThermoFisher ScientficAA1-155
Disco de hidroxiapatitaAdvanced BiomatrixCytoForm 200
Il-6 proteínaPeproTech200-06
Medios SFM de queratinocitos (1X)ThermoFisher Scientfic17005042
LamininaCorning354259
Péptido LRAPPéptido 2.0Secuencia personalizada: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT
PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL
PLEAWPATDKTKREEVD
MatrigelCorning354234
Millipore Membrana de nitrocelulosaMerck Millipore
RCCS BiorreactorSyntheconRCCS 4HD
SpongeColAdvanced Biomatrix5135-25EA
Válvula de jeringa llave de paso unidireccional con bloqueo Luer macho giratorioSmiths MedicalMX5-61L
Jeringas con aguja 3ccMcKESSON16-SN3C211
Tripsina EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientfic
AABP0470025200056

Referencias

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