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Artículo de método

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

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DOI:

10.3791/62709

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31 de mayo de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

En este artículo

Resumen

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Resumen

Las lesiones cerebrales traumáticas por fuerza contundente (LCT) son la forma más común de traumatismo craneal, que abarca una variedad de gravedades y da como resultado efectos secundarios complejos y heterogéneos. Si bien no existe un mecanismo para reemplazar o regenerar las neuronas perdidas después de una lesión cerebral traumática en humanos, el pez cebra posee la capacidad de regenerar neuronas en todo su cuerpo, incluido el cerebro. Para examinar la amplitud de las patologías exhibidas en el pez cebra después de una LCT de fuerza contundente y estudiar los mecanismos subyacentes a la respuesta regenerativa neuronal posterior, modificamos la caída de peso de Marmarou en roedores de uso común para el uso en peces cebra adultos. Nuestro modelo de LCT de fuerza contundente simple es escalable, induciendo una LCT leve, moderada o grave, y recapitula muchos de los fenotipos observados después de la LCT humana, como convulsiones de contacto y postraumáticas, edema, hematomas subdurales e intracerebrales y deficiencias cognitivas, cada una de las cuales se muestra de una manera dependiente de la gravedad de la lesión. Las secuelas de LCT, que comienzan a aparecer a los pocos minutos de la lesión, desaparecen y vuelven a niveles de control casi intactos dentro de los 7 días posteriores a la lesión. El proceso regenerativo comienza tan pronto como 48 horas después de la lesión (hpi), con el pico de proliferación celular observado por 60 hpi. Por lo tanto, nuestro modelo de LCT de fuerza contundente del pez cebra produce patologías características de LCT de lesión primaria y secundaria similares a la LCT humana, lo que permite investigar el inicio y la progresión de la enfermedad, junto con los mecanismos de regeneración neuronal que son exclusivos del pez cebra.

Introducción

Las lesiones cerebrales traumáticas (LCT) son una crisis de salud mundial y una de las principales causas de muerte y discapacidad. En los Estados Unidos, aproximadamente 2.9 millones de personas experimentan una LCT cada año, y entre 2006-2014 la mortalidad debido a una LCT o secuelas de LCT aumentó en más del 50%1. Sin embargo, las LCT varían en su etiología, patología y presentación clínica debido en gran parte al mecanismo de lesión (MOI), que también influye en las estrategias de tratamiento y el pronóstico previsto2. Aunque las LCT pueden ser el resultado de varios MOI, son predominantemente el resultado de un trauma penetrante o de fuerza contundente. Los traumatismos penetrantes representan un pequeño porcentaje de LCT y generan una lesión grave y focal que se localiza en las regiones cerebrales empaladas inmediatas y circundantes3. Por el contrario, las LCT de fuerza contundente son más comunes en la población general, abarcan una variedad de gravedades (leve, moderada y grave) y producen una lesión difusa, heterogénea y global que afecta a múltiples regiones cerebrales1,4,5.

El pez cebra (Danio rerio) se ha utilizado para examinar una amplia gama de insultos neurológicos que abarcan el sistema nervioso central (SNC)6,7,8,9. El pez cebra también posee, a diferencia de los mamíferos, una respuesta regenerativa innata y robusta para reparar el daño del SNC10. Los modelos actuales de trauma del pez cebra utilizan varios métodos de lesión, incluyendo penetración, escisión, insulto químico u ondas de presión11,12,13,14,15,16. Sin embargo, cada uno de estos métodos utiliza un MOI que rara vez es experimentado por la población humana, no es escalable en una variedad de gravedades de lesiones y no aborda la heterogeneidad o las secuelas de TBI dependientes de la gravedad reportadas después de una TBI de fuerza contundente. Estos factores limitan el uso del modelo de pez cebra para comprender los mecanismos subyacentes de las patologías asociadas con la forma más común de LCT en la población humana (lesiones leves por fuerza contundente).

Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de pez cebra TBI de fuerza contundente rápido y escalable que proporcione vías para investigar la patología de la lesión, la progresión de las secuelas de TBI y la respuesta regenerativa innata. Modificamos la caída de peso del roedor de uso común Marmarou17 y la aplicamos al pez cebra adulto. Este modelo produce un rango reproducible de severidades que van desde leves, moderadas a graves. Este modelo también recapitula múltiples facetas de la patología de TBI humana, de una manera dependiente de la gravedad, incluidas convulsiones, edema, hematomas subdurales e intracerebrales, muerte celular neuronal y déficits cognitivos, como el deterioro del aprendizaje y la memoria. Días después de la lesión, las patologías y los déficits se disipan, volviendo a niveles similares a los controles no dañados. Además, este modelo de pez cebra muestra una respuesta robusta de proliferación y regeneración neuronal a través del neuroeje con respecto a la gravedad de la lesión.

Aquí, proporcionamos detalles sobre la configuración e inducción del trauma por fuerza contundente, la puntuación de las convulsiones postraumáticas, la evaluación de las lesiones vasculares, las instrucciones sobre la preparación de las secciones cerebrales, los enfoques para cuantificar el edema y la comprensión de la respuesta proliferativa después de la lesión.

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Protocolo

El pez cebra se crió y mantuvo en las instalaciones de Notre Dame Zebrafish en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Notre Dame.

1. Paradigma de la lesión cerebral traumática

  1. Agregue 1 ml de 2-fenoxietanol a 1 L de agua del sistema (60 mg de Instant Ocean en 1 L de agua ro desionizada).
  2. Prepare un tanque de recuperación aireado que contenga 2 L de agua del sistema a temperatura ambiente.
  3. Seleccione el peso deseado del rodamiento de bolas y la longitud y el diámetro deseados de los tubos de acero / plástico y determine la energía y la fuerza de impacto.
    NOTA: El tubo debe tener un diámetro interior que permita el paso del rodamiento de bolas sin cambiar su trayectoria o velocidad de movimiento.
    1. Determinar la energía cinética tras el impacto:
      figure-protocol-1
      Donde, KE = energía cinética, m = masa (en kg), g = fuerza gravitacional, h = altura (en m) desde el punto de caída hasta el pez.
      NOTA: Esto proporciona energía cinética en J. Multiplique el valor por 1,000 para determinar mJ. KE se basa en un objeto de aceleración, que ocurre cuando el rodamiento de bolas se deja caer desde una posición estacionaria.
    2. Genere una LCT suave (miTBI) utilizando tubos de acero/plástico de 7,62 cm de largo que terminan a 1,5 cm por encima de la placa en el cráneo del pez cebra (distancia total de 9,1 cm) y un rodamiento de bolas de 1,5 g (6,4 mm de diámetro). Estos producen una energía cinética de 1,33 mJ. Este daño se decidió empíricamente que era equivalente a un miTBI basado en marcadores clave de TBI fisiopatológicos, como lesión vascular, formación de hematomas subdurales / intracerebrales, muerte celular neuronal y deficiencias cognitivas que recapitularon en gran medida lo que se informó en la población humana de una manera dependiente de la gravedad.
    3. Calcular la energía cinética miTBI = figure-protocol-2
    4. Genere un TBI moderado (moTBI) utilizando tubos de acero /plástico de 12,7 cm de largo que terminan a 1,5 cm por encima de la placa en el cráneo del pez cebra (distancia total 14,2 cm) y un rodamiento de bolas de 1,5 g (6,4 mm de diámetro) que produce una energía cinética de 2,08 mJ.
    5. Calcular la energía cinética moTBI = figure-protocol-3
    6. Genere una LCT severa (sTBI) utilizando tubos de acero /plástico de 7,62 cm de largo que terminan a 1,5 cm por encima de la placa en el cráneo del pez cebra (distancia total de 9,1 cm) y un rodamiento de bolas de 3,3 g (8,38 mm de diámetro) que produce una energía cinética de 2,94 mJ.
    7. Calcular la energía cinética sTBI = figure-protocol-4
  4. Llene una placa de Petri con arcilla de modelado (Figura 1, paso 1) y use un instrumento contundente (es decir, la parte posterior de un par de pinzas) para crear una plataforma elevada (5 cm x 1,5 cm) con arcilla de modelado adicional (Figura 1, paso 2).
    1. Use una hoja de afeitar para dividir la plataforma elevada longitudinalmente en dos mitades aproximadamente iguales (Figura 1, paso 3, línea discontinua roja). Forme las dos mitades en un canal que se adapte a la longitud de un pez adulto (Figura 1, paso 4). Use arcilla adicional para construir paredes que aseguren ~ 2/3 del cuerpo del pez, dejando la cabeza expuesta.
    2. Moldee un pequeño soporte en la región de la cabeza expuesta perpendicular a las paredes para apoyar la cabeza para evitar la rotación o retroceso de la cabeza en caso de lesión (Figura 1, paso 4).
      NOTA: El canal debe ser lo suficientemente profundo como para soportar a los peces en una posición dorsal hacia arriba, pero aún así debe permitir que la cabeza descanse por encima de la arcilla circundante. Además, el soporte de la cabeza debe seguir la curvatura natural de los peces, apoyando la mandíbula inferior y las branquias.
    3. Asegúrese de que el peso caído no se vea obstaculizado por los lados del canal (Figura 1, paso 4).
  5. Cree un disco de acero de 3 mm de diámetro utilizando un mini taladro y un parpadeo de acero de 22 g. Cada disco se puede utilizar varias veces.
  6. Anestesiar un pez colocándolo en un vaso de precipitados con 50-100 mL de 1:1000 (1 mL/1 L, 0.1%) 2-fenoxietanol hasta que no responda al pellizco de la cola.
  7. Coloque el pez, dorsal hacia arriba, sobre el molde de arcilla dentro del canal para que el cuerpo esté asegurado a los lados y coloque un disco de acero de 3 mm y 22 g en la cabeza, centrado sobre el punto de impacto deseado (Figura 1, paso 5).
    1. Asegúrese de que el pez esté alineado lo más perpendicularmente posible para evitar que su cabeza se incline hacia un lado, lo que podría causar un impacto desigual.
  8. Asegure el tubo de acero / plástico, utilizando un soporte de anillo estándar y una abrazadera de brazo, de modo que la parte inferior del tubo esté a 1,5 cm por encima de la cabeza del pez cebra (Figura 1, paso 6). Asegúrese de que el tubo esté recto.
    1. Mire hacia abajo en el tubo y asegúrese de que el tubo esté alineado por encima de la placa de acero.
  9. Deje caer el rodamiento de bolas (1,5 g para LCT leve y moderada, y 3,3 g para LCT grave) desde una altura predeterminada (descrita en los pasos 1.3.3-1.3.5) por el tubo sobre la placa de acero ubicada sobre la región neuroanatómica de interés deseada (por ejemplo, cerebelo, Figura 1, paso 5) para producir la LCT de fuerza contundente para la gravedad deseada de la lesión. Coloque a los peces heridos en un tanque de recuperación para ser monitoreados.
    NOTA: Dependiendo de la gravedad de la lesión, puede ocurrir mortalidad o convulsiones tónico-clónicas. Si los peces no responden durante un período prolongado de tiempo después de la LCT, use una pipeta de transferencia o fórceps para administrar un pellizco de cola y evaluar una respuesta al dolor.

2. Puntuación de las convulsiones post-LCT en el pez cebra adulto

  1. Anestesiar y lesionar a los peces de acuerdo con el protocolo de lesiones descrito en la sección 1 y colocar los peces heridos en un tanque de recuperación aireado de 2 L de agua del sistema.
  2. Observe a los peces en busca de signos de convulsiones postraumáticas que comiencen inmediatamente después de ser colocados en el tanque de recuperación. Establezca un tiempo de observación (es decir, 1 h) y registre toda la actividad convulsiva, incluida la puntuación de las convulsiones (que se describe a continuación), la duración de cada convulsión y el porcentaje de peces que experimentaron convulsiones (Figura 2A).
    NOTA: Las convulsiones pueden ocurrir inmediatamente después de la lesión, así como horas o días después de una LCT. Las convulsiones pueden persistir a largo plazo y un solo pez puede tener múltiples convulsiones. Establecer un tiempo de observación de 1 h o más producirá una buena representación de la tendencia general de las tasas de incautación.
  3. Puntúe a los peces utilizando las pautas de Mussulini18 para los fenotipos de convulsiones de pez cebra adulto.
    NOTA: Sin el uso del software de seguimiento, es difícil evaluar los puntajes de convulsiones por debajo de 3 de manera imparcial. Por lo tanto, solo se deben registrar los puntajes de incautación de 3 o más cuando la evaluación se realiza sin software.

3. Disección cerebral

  1. Sacrificar a los peces en una solución de 2-fenoxietanol 1:500 (2 ml/1 L, 0,2%), hasta que cesen los movimientos branquiales y no sean reactivos al pellizco de la aleta, en el punto final deseado.
  2. Llene una placa de Petri con arcilla de modelado y cree una pequeña cavidad para apoyar el cuerpo durante la disección.
  3. Coloque el pez, dorsal hacia arriba, en el molde de arcilla. Coloque un pasador de disección a través de la línea media hasta la mitad del cuerpo del pez y un segundo pasador ~ 5 mm detrás de la base de la cabeza.
  4. Bajo un microscopio de luz de disección, corte sin rodeos el nervio óptico con un par de fórceps Dumont # 5 y retire los ojos (Figura 2A).
  5. Orientar el pez para que el extremo rostral esté más lejos al mirar a través del microscopio (Figura 2B).
    NOTA: Los siguientes pasos son para personas diestras. Las personas zurdas pueden preferir realizar los siguientes pasos en una orientación reflejada.
  6. Use pinzas # 5 para colocar lentamente un extremo de las pinzas debajo de la placa parietal derecha, haciendo una acción deliberada de tijera moviéndose hacia el extremo rostral y retire las placas parietal y frontal derecha (Figura 2C).
    1. Mantenga los fórceps en un ángulo de 45 ° o menos para evitar penetrar en el cerebro durante la disección.
  7. Gire el pez 90° en el sentido de las agujas del reloj. Coloque un extremo de las pinzas # 5 debajo de la placa parietal izquierda y use el mismo movimiento de tijera para eliminar las placas parietal y frontal izquierda que exponen todo el aspecto dorsal del cerebro (Figura 2D, E).
  8. Transecte sin rodeos el maxilar con fórceps #5. Conservar los bulbos olfativos y no dañarlos si esta es la región de interés.
  9. Retire el opáculo derecho, el preopercle, el interopercle y el subópercle con fórceps #5 (Figura 2F).
  10. Reseque sin rodeos la musculatura en el extremo caudal de la abertura del calvario usando pinzas # 5, exponiendo la médula espinal.
  11. Transecte sin rodeos la médula espinal con fórceps # 5. Coloque cuidadosamente los fórceps debajo del cerebro y retire suavemente el cerebro del calvario.
    NOTA: Nunca pellizque el cerebro. Use fórceps para "acunar" el cerebro o resecar caudalmente y utilice la médula espinal expuesta como un punto de pellizco para maniobrar el cerebro.
  12. Fije los cerebros eliminados en 9 partes 100% etanol a 1 parte 37% formaldehído durante la noche a 4 ° C en una plataforma basculante.

4. Estudios de edema en el cerebro del pez cebra

  1. Anestesiar y lesionar a los peces de acuerdo con el protocolo de lesiones descrito en la sección 1 y permitir que los peces se recuperen en un tanque de recuperación hasta que comiencen a nadar libremente.
  2. Coloque el pescado de nuevo en las condiciones normales de alojamiento después de la lesión durante 1 día.
  3. Sacrificar los peces en 1:500 2-fenoxietanol, después de que haya transcurrido el tiempo.
  4. Diseccionar todo el cerebro o la región de interés de acuerdo con el protocolo descrito en la sección 3 y colocar el cerebro inmediatamente en un pequeño bote de pesaje.
    NOTA: Tenga cuidado al transferir el cerebro, usando fórceps finos para colocarlo suavemente en el bote de pesaje sin apuñalar o raspar el cerebro, lo que podría resultar en la pérdida de tejido.
  5. Etiqueta (con el grupo de lesiones y el número de cerebros) y tara un pequeño bote de pesaje de secado adicional en una báscula. Utilice una báscula con la capacidad de medir un mínimo de 0,001 g para obtener una medición precisa.
  6. Transfiera el cerebro al bote de pesaje de secado de alquitranes y registre el peso húmedo del cerebro. Oriente los cerebros para que se acuesten planos en el bote de pesaje con el lado dorsal hacia arriba.
  7. Coloque el bote de pesaje y el cerebro de secado en un horno de hibridación a 60 ° C durante 8 h.
  8. Después del secado, el cerebro puede adherirse al bote de pesaje de secado y puede ser difícil de quitar y transferir a un nuevo bote de pesaje pequeño alquitranado. Evite pellizcar el cerebro con fórceps, ya que esto podría provocar daños en el cerebro seco y pérdida de tejido. En su lugar, pellizque las pinzas finas juntas y, comenzando en el lado ventral del cerebro, tome una cuchara en un movimiento hacia arriba.
  9. Determinar el contenido de agua de cada cerebro utilizando la fórmula (Figura 4):
    figure-protocol-5

5. Etiquetado de la proliferación celular a través del neuroeje y preparación de tejido fijo.

  1. Preparar 10 mM 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) en 2 mL de ddH2O.
  2. Anestesiar de 3 a 4 peces a la vez en 50-100 mL de 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-fenoxietanol hasta que los peces no respondan al pellizco de la cola, en el punto de tiempo deseado después de la lesión (utilizando el protocolo descrito en la sección 1).
  3. Haga una incisión parcial en una esponja húmeda y coloque un pez a la vez en la abertura, con el lado ventral hacia arriba.
  4. Use una aguja de 30 G para inyectar ~ 40 μL de 10 mM EdU en el cuerpo del pez. Devuelva los peces a un tanque de retención lleno de agua del sistema.
    NOTA: Las inyecciones repetidas se pueden realizar en diferentes puntos de tiempo para etiquetar un mayor número de células proliferantes y pueden ser necesarias si se desea un período de persecución de más de 1 semana.
  5. Recoja los cerebros como se describe en la sección 3 y colóquelos como un grupo en un vial de vidrio de 5 ml que contenga 2 ml de 9 partes de etanol al 100% de etanol a 1 parte de formaldehído al 37%. Fije los cerebros a 4 °C en una plataforma basculante.
    NOTA: Una plataforma basculante o agitadora prohíbe que los cerebros descansen en la parte inferior y que el telencéfalo de cerebros enteros se enrosque.
  6. Rehidrate los cerebros, en el mismo vial de vidrio utilizado para fijar los cerebros, en lavados de series de etanol descendente, 75%, 50% y 25%, durante 15 minutos cada uno, seguido de un lavado de 1,5 h en sacarosa / PBS al 5% en un balancín a temperatura ambiente. Guarde los cerebros en un vial de vidrio durante la noche en sacarosa al 30% / PBS a 4 ° C en una plataforma basculante.
  7. Retire los cerebros del 30% de sacarosa / PBS y transfiéralos con fórceps a una placa de 12 pocillos (un grupo de tratamiento por pozo) con pocillos llenos de una solución 2: 1 que consiste en 2 partes de medio de congelación de tejido y 1 parte de sacarosa / PBS al 30%. Incubar los cerebros durante la noche a 4 °C en una plataforma basculante.
  8. Transfiera los cerebros a la siguiente fila de pozos dentro de la placa de 12 pocillos sumergiendo los cerebros en 100% TFM durante 2-24 h a 4 ° C.
  9. Use un mandril de criostato para incrustar los cerebros en TFM en la orientación deseada sobre hielo seco.
  10. Realice la crioseccionación (secciones de 16 μm de espesor) y recoja las secciones en diapositivas cargadas positivamente. Seque los portaobjetos en un portaobjetos más caliente durante 1 h y luego almacene a -80 °C o continúe con inmunohistoquímica.
  11. Prepare una barrera hidrofóbica en el portaobjetos alrededor de las secciones de tejido y deje secar en un calentador de diapositivas durante 20 minutos.
  12. Lave brevemente las diapositivas en PBS durante 5 min y luego dos veces en PBS-Tween 20 (0.05%) durante 10 min cada una.
  13. Realice la detección de EdU utilizando el kit de proliferación de células EdU y las instrucciones del fabricante.
  14. Analice las diapositivas y cuantifique las células fluorescentes marcadas con EdU utilizando un microscopio epifluorescente o un microscopio confocal. Se requerirá un mínimo de un objetivo 40x para distinguir claramente las células individuales.

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Resultados

La preparación de la plataforma de inducción de lesiones permite un medio rápido y simplista de entregar una LCT escalable de fuerza contundente al pez cebra adulto. La gravedad graduada del modelo de lesión proporciona varias métricas fácilmente identificables de una lesión exitosa, aunque la lesión vascular es una de las patologías más fáciles y prominentes (Figura 3). La cepa de pescado utilizada durante la lesión puede hacer que este indicador sea más fácil o más difícil de identificar. ...

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Discusión

Las investigaciones de neurotraumatismos y secuelas asociadas se han centrado durante mucho tiempo en modelos tradicionales de roedores no regenerativos20. Sólo recientemente los estudios han aplicado diversas formas de daño del SNC a modelos regenerativos9,11,13,14,21. Aunque perspicaces, estos modelos están limitados por el uso de un ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Hyde por sus discusiones reflexivas, a los técnicos del Centro de Ciencias de la Vida Freimann para el cuidado y la cría del pez cebra, y al Núcleo de Microscopía Óptica / NDIIF de la Universidad de Notre Dame por el uso de instrumentos y sus servicios. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación del Pez Cebra de la Universidad de Notre Dame, el Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa de la Universidad de Notre Dame, y subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de NIH R01-EY018417 (DRH), el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship de Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH), y la Beca Pat Tillman (JTH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-fenoxietanolSigma Alderich77699
#00 perdigonesRemingtonRMS237703,3 g de peso para perdigones sTBI
#3RemingtonRMS237761,5 g de peso para miTBI/moTBI
#5 Pinzas DumontWPI14098
5-etinil-2'-desoxiuridinaLife TechnologiesA10044EdU
Frasco de vidrio de 5 mlVWR66011-063
Click-iT EdU Kit de proliferaciónLife TechnologiesC10340
CytoOne Placa de 12 pocillosUSA ScientificCC7682-7512
Instant OceanInstant OceanSS15-10
Super frost Portaobjetos cargados postivamente BolígrafoVWR48311-703
Super PAP Bloqueador de líquidosTed Pella22309
Medio de congelación de tejidosVWR15148-031
celular

Referencias

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