Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones

El corazón es un órgano complejo gobernado por influencias cardíaco-intrínsecas y extrínsecas como las que se originan en el cerebro. El nódulo sinoauricular (SAN) es una región definida en el corazón que alberga las células marcapasos (también conocidas como células sinoauriculares o células SA) responsables de la iniciación y perpetuación de los latidos del corazón de los mamíferos^1,2. La frecuencia cardíaca intrínseca es la velocidad impulsada por las células marcapasos sin influencia de otras influencias cardíacas o neuro-humorales, pero las medidas tradicionales de la frecuencia cardíaca en humanos y animales vivos, como los electrocardiogramas, reflejan tanto el marcapasos como las influencias neuronales en el corazón. La influencia neuronal más notable en las células SA es del sistema nervioso autónomo, que modula constantemente los patrones de disparo para satisfacer los requisitos fisiológicos del cuerpo³. Apoyando esta idea, se pueden encontrar proyecciones simpáticas y parasimpáticas cerca del SAN^4. El sistema nervioso cardíaco intrínseco (ICNS) es otra influencia neuronal importante donde los plexios ganglionados, específicamente en las aurículas derechas, inervan y regulan la actividad del SAN^5,6.

Comprender los déficits de marcapasos es clínicamente importante, ya que la disfunción puede ser la base de muchos trastornos cardíacos, así como contribuir al riesgo de otras complicaciones. El síndrome del seno enfermo (SSS) es una categoría de enfermedades caracterizadas por la disfunción del nódulo sinoauricular que impide el marcapasos adecuado^7,8. El SSS puede presentarse con bradicardia sinusal, pausas sinusales, paro sinusal, bloqueo de la salida sinoauricular y bradiaritmias y taquiarritmias alternas⁹ y puede conducir a complicaciones que incluyen un mayor riesgo de accidente cerebrovascular embólico y muerte súbita^8,10. Las personas con síndrome de Brugada, un trastorno cardíaco marcado por fibrilación ventricular con un mayor riesgo de muerte súbita cardíaca, tienen un mayor riesgo de eventos arritmogénicos si también tienen disfunción SAN comórbida^11,12. La disfunción sinoauricular también puede tener consecuencias fisiológicas más allá del corazón. Por ejemplo, se ha observado que el SSS desencadena convulsiones en un paciente debido a la hipoperfusión cerebral¹³.

Para identificar los déficits de marcapasos sinoauriculares, las frecuencias cardíacas intrínsecas deben determinarse midiendo la actividad de la SAN sin la influencia del sistema nervioso autónomo o los factores humorales. Clínicamente, esto puede ser aproximado por bloqueo autonómico farmacológico^14,pero esta misma técnica también puede ser aplicada en modelos de mamíferos para estudiar la función cardíaca intrínseca^15,16. Si bien este enfoque bloquea una gran parte de las influencias neuronales que contribuyen y permite el examen cardíaco in vivo, no elimina por completo todas las influencias extrínsecas en el corazón. Otra técnica de investigación utilizada para estudiar la función cardíaca intrínseca en modelos animales son los registros cardíacos aislados utilizando corazones perfundidos por Langendorff, que generalmente implican mediciones utilizando electrogramas, estimulación o matrices de multielectrodos epicárdicos^17,18,19,20. Si bien esta técnica es más específica para la función cardíaca, ya que implica la eliminación del corazón del cuerpo, las mediciones aún pueden estar influenciadas por mecanismos autorreguladores mecano-eléctricos que podrían influir en las mediciones intrínsecas de la frecuencia cardíaca²¹. Las grabaciones cardíacas aisladas también pueden estar influenciadas por la regulación autonómica a través del^{CIE 5,6,22,23.} Además, mantener una temperatura fisiológicamente relevante del corazón, que es crítica para las mediciones de la función cardíaca, puede ser difícil en aproximaciones cardíacas aisladas²⁰. Un método más directo para estudiar la función de SAN es aislar específicamente el tejido SAN y medir su actividad. Esto se puede lograr a través de tiras san (tejido SAN aislado) o células de marcapasos SAN aisladas^24,25. Ambos requieren un alto grado de capacitación técnica, ya que el SAN es una región muy pequeña y altamente definida, y el aislamiento celular plantea un desafío aún mayor, ya que la disociación puede dañar la salud general de la célula si no se realiza correctamente. Además, estas técnicas requieren habilidades electrofisiológicas expertas para registrar con éxito desde el tejido o las células utilizando microelectrodos de registro individuales.

En este protocolo, describimos una técnica para registrar el SAN in vitro mediante el uso de una matriz de microelectrodos (MEA) para obtener mediciones intrínsecas de la frecuencia cardíaca. Este enfoque tiene la ventaja de hacer que los registros electrofisiológicos altamente específicos sean accesibles para los investigadores que carecen de habilidades electrofisiológicas intensivas. Los AMUMA se han utilizado previamente para estudiar la función de los cardiomiocitos en cultivos de cardiomiocitos primarios^{26,27,28,29,30,31,32,}hojas cardíacas^{33,34,35,36,37,38,39}y montajes de tejido entero^{40, 41,42,43,44,45,46,47}. También se han realizado trabajos previos para examinar los potenciales de campo en el tejido SAN^41,42. Aquí, proporcionamos una metodología para usar el MEA para registrar y analizar las tasas de disparo de SAN intrínsecas murinas. También describimos cómo esta técnica se puede utilizar para probar los efectos farmacológicos de los fármacos sobre las tasas de disparo intrínsecas de SAN proporcionando un experimento de muestra que muestra los efectos de la 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador de canales K⁺ controlado por voltaje. Utilizando puntos de referencia anatómicos definidos, podemos registrar con precisión el SAN sin tener que realizar las extensas disecciones de tejido o aislamientos celulares requeridos en otros métodos. Si bien el MEA puede ser prohibitivo, las grabaciones proporcionan medidas altamente específicas y confiables de marcapasos que se pueden usar en una amplia gama de aplicaciones de investigación clínica y fisiológica.

Todos los procedimientos experimentales descritos aquí se han llevado a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Metodista del Sur.

1. Recubrimiento de la matriz multielectrodo (MEA) para la grabación

1. Haga un búfer de borato de 25 mM.
   1. Disolver 0,953 g de Na₂B₄O₇·10 H₂O en 80 mL de agua destilada.
   2. Ajuste el pH a 8.4 con HCl y luego agregue agua destilada a un volumen final de 100 ml.
2. Haga una solución de polietilenoima (PEI) al 0,1%.
   1. Agregue 100 μL de PEI al 50% (p/v) a 4,9 ml de agua destilada para hacer una solución de PEI al 1%.
   2. Diluya la solución de PEI al 1% al 0,1% en el tampón de borato agregando 1 ml de la solución de PEI al 1% a 9 ml del tampón de borato de 25 mM.
3. Pipetear ~ 1 ml de la solución de PEI al 0,1% en el plato de matriz de microelectrodos (MEA) para que los electrodos estén completamente cubiertos(Figura 1A y 1B).
   NOTA: Los microelectrodos del MEA están típicamente compuestos de negro platino o nanotubo de carbono y aislados con poliimida (o acrílico); ambos materiales son hidrófobos. Al recubrir el MEA con un polímero catiónico como pei, la superficie hidrofóbica de MEA se hace más hidrófila, lo que permite que las muestras de tejido entren mejor en contacto con la superficie de MEA(Figura 1A1).
4. Cubra el plato MEA con película termoplástica para reducir la evaporación y deje el MEA durante la noche a temperatura ambiente (Figura 1C).
5. Aspire la solución de PEI del plato MEA usando una pipeta, teniendo cuidado de no tocar la rejilla del electrodo que puede dañar los electrodos, y luego enjuague ≥4 veces con agua destilada (Figura 1D).
6. Guarde el MEA recubierto de PEI bajo 1-2 ml de agua ultrapura y sellado con película termoplástica a 4 °C hasta que sea necesario. Alternativamente, guarde el MEA recubierto sumergiéndolo en un beaker lleno de agua ultrapura(Figura 1E).
   NOTA: El proceso de recubrimiento pei solo debe realizarse una vez para el MEA antes de su primer uso, y después de cada sesión de grabación, el MEA debe almacenarse sumergido en agua ultrapura.

2. Preparación de la solución completa de Tyrode para la disección de tejidos

1. Hacer 1,000 ml de solución completa de Tyrode para disección; primero, agregue 8.1816 g de NaCl a 800 ml de agua ultrapura.
2. Agregue la siguiente cantidad de productos químicos a la solución: 0.4025 g de KCl; 0,1633 g de KH₂PO₄; 1,1915 g de HEPES; 0,9999 g de glucosa; 0,0952 g de MgCl₂; 0,2646 g de CaCl₂·2H₂O.
3. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH y luego agregue agua ultrapura hasta que el volumen total sea de 1,000 ml.
   NOTA: La composición final de la solución de Tyrode completo será la siguiente (en mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH₂PO_4,5 HEPES, 5.55 glucosa, 1 MgCl_2,1.8 CaCl₂.

3. Preparación de la solución oxigenada de Tyrode para la grabación

1. Hacer 500 ml de la solución de Tyrode; añadir 4.003 g de NaCl a 400 mL de agua ultrapura.
2. Añadir las siguientes cantidades de productos químicos a la solución: 0,651 g de NaHCO₃; 0,042 g de NaH₂PO₄; 0,132 g de CaCl₂·2H₂O; 0,149 g de KCl; 0,0476 g de MgCl₂; 0,999 g de glucosa.
3. Ajuste el pH a 7.4 con HCl y luego agregue agua ultrapura hasta que el volumen total sea de 500 ml.
4. Oxigenar la solución con carbógeno durante al menos 30 min a temperatura ambiente antes de iniciar el registro.
   NOTA: La composición final de la solución de Tyrode será la siguiente (en mM): 137 NaCl, 15.5 NaHCO₃, 0.7 NaH₂PO₄, 1.8 CaCl₂, 4 KCl, 1 MgCl₂, 11.1 glucosa. Esta solución de Tyrode tiene una composición ligeramente diferente de la solución de Tyrode completa utilizada para la disección.

4. Preparación de la solución de 4-aminopiridina (4-AP) para la modulación farmacológica

1. Hacer una solución de trabajo de 1 mM de 4-AP; agregue 18,82 mg de 4-AP a 200 ml de la solución de Tyrode a partir del paso 3.
2. Oxigenar la solución de 4-AP durante al menos 30 minutos antes del experimento.

5. Preparación de la placa de Petri para la disección

1. Mezcle los componentes del elastómero de silicona en una proporción de 10:1 (en peso) de la base al agente de curado.
2. Vierta ~ 15 ml de mezcla de elastómero de silicona en una placa de Petri de 60 mm de diámetro.
3. Deje que el elastómero se cure a temperatura ambiente durante 48 h antes de su uso.
   NOTA: La placa de Petri siliconada se puede reutilizar para futuras disecciones.

6. Disección del nódulo sinoauricular (SAN)

1. Preparar la solución heparinizada de Complete Tyrode para la disección de SAN.
   1. Añadir 400 μL de heparina (1.000 USP/mL) a 40 ml de solución completa de Tyrode y calentar en un baño de agua a 37 °C.
2. Inyecte al ratón por vía intraperitoneal con 200-300 μL de heparina (1000 USP/mL) y deje que el animal se siente durante 10 min.
3. Sacrificar al ratón heparinizado por sobredosis de isoflurano.
   1. Coloque el ratón en una pequeña cámara de vidrio que contenga vapores de isoflurano generados al agregar 200-300 μL de isoflurano líquido a un papel de filtro dentro de un tubo de plástico perforado.
      NOTA: Debido a que el isoflurano puede causar irritación de la piel y también puede ser absorbido a través de la piel, el líquido no debe contactar directamente con el ratón. Por lo tanto, la toallita empapada en isoflurano se coloca en un tubo perforado para su administración.
   2. Verificar la muerte por cese del movimiento y esfuerzo respiratorio y por la ausencia de un reflejo de pellizco en el dedo del pie. La muerte generalmente toma alrededor de 1-2 minutos después de la colocación en la cámara.
      NOTA: La muerte generalmente se acompaña de micción.
4. Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla de disección con las patas extendidas y fije las patas a la tabla con agujas de jeringa de calibre 23 de 1 pulgada de largo. Luego retire el pelaje en las cercanías del fondo de la caja torácica usando tijeras quirúrgicas y cortando el pelaje en las raíces.
   NOTA: Para una placa de disección, se pueden usar tapas de enfriador de poliestireno.
5. Mientras sostiene la piel con un hemostático, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal en la piel justo debajo de la parte inferior de la caja torácica desde aproximadamente el arco costal izquierdo hasta el arco costal derecho(Figura 3A).
6. Cortar el peritoneo con tijeras quirúrgicas y separar cuidadosamente el hígado del diafragma, teniendo cuidado de no cortar el hígado, lo que provocará sangrado excesivo(Figura 3B). Incise el diafragma a lo largo del tórax para exponer la cavidad torácica (Figura 3C-D).
7. Usando tijeras quirúrgicas, corte las paredes laterales de la caja torácica desde los bordes de los arcos costales hasta las clavículas para exponer el corazón, teniendo cuidado de evitar dañar el corazón (Figura 3D). Luego use una aguja de jeringa de calibre 23 para fijar la caja torácica sobre el hombro, manteniéndola en su lugar y fuera del camino del campo quirúrgico.
8. Use una pipeta de transferencia para gotear la solución heparinizada de Tyrode completa caliente (37 °C) sobre el corazón para mantenerlo húmedo.
   NOTA: No permita que el corazón se seque.
9. Retire los pulmones sosteniéndolos con fórceps Graefe extra finos y ándole la tráquea con tijeras quirúrgicas (Figura 3E).
10. Sostenga el ápice del corazón con pórceps Graefe extra finos y retírelo cortando la aorta y las venas cavas con tijeras quirúrgicas. Transfiera el corazón a una placa de Petri que contenga elastómero de silicona curado (Figura 4A) y use una pipeta de transferencia para bañar el corazón con 2-3 ml de solución heparinizada tibia (37 ° C) de Tyrode completo.
    NOTA: Tenga cuidado de no dañar la delicada pared posterior de las aurículas derechas, que contiene la SAN, y las venas auriculares derechas conectadas. Bañar el corazón con la solución de Tyrode completo evita que el corazón se seque, pero no sumerja completamente el corazón en solución, ya que afectará la visibilidad durante la disección.
11. Oriente el corazón con la aurícula derecha a la derecha del experimentador y la aurícula izquierda a la izquierda del experimentador.
    NOTA: La disección del tejido SAN debe hacerse rápidamente para prevenir lesiones relacionadas con la isquemia.
12. Conecte el ápice del corazón al plato con un pasador de disección. Luego, mientras sostiene la vena cava inferior con fórceps de laminectomía #2 Dumont, inserte una aguja de jeringa de 22 G a través de la vena cava inferior y superior para ubicar su posición en la aurícula derecha, que también identifica la posición aproximada de la SAN (ubicada en el parche de tejido entre la vena cava inferior y superior (Figura 4B).
13. Usando pequeños alfileres de disección, fije los apéndices auriculares izquierdo y derecho al plato.
    1. Mientras sostiene el apéndice auricular izquierdo con Dumont #2 las pinzas de laminectomía, coloque un pasador de disección a través del apéndice auricular izquierdo para mantenerlo en su lugar.
    2. Mientras sostiene el apéndice auricular derecho con Dumont #55 los pinzas, coloque un pasador de disección a través del apéndice auricular derecho para mantenerlo en su lugar.
       NOTA: Se puede usar el mismo tipo de pórceps para sostener los apéndices auriculares izquierdo y derecho si se desea.
14. Retire la aguja de la jeringa que atraviesa las venas cavas.
15. Para liberar sangre del corazón, use tijeras Castroviejo para eliminar el ápice del corazón (es decir, la mitad inferior) haciendo una incisión transversal a través de los ventrículos(Figura 4C). Luego, lave el corazón agregando la solución heparinizada de Tyrode Completa tibia (37 ° C) con una pipeta de transferencia.
16. Use tijeras Castroviejo para cortar a lo largo del tabique auriculoventricular manteniendo la incisión más cerca del ventrículo que de las aurículas. Continúe cortando a lo largo del tabique auriculoventricular hasta que las aurículas se separen de los ventrículos.
17. Corte a lo largo del tabique interauricular para extirpar la aurícula izquierda.
18. Coloque alfileres de disección en la periferia de la aurícula derecha para que que quede plana (Figura 4D). Retire cualquier resto de grasa, vasos o tejido de la aurícula con las tijeras Castroviejo.
19. Localice el SAN en la aurícula derecha, que en esta orientación está aproximadamente bordeado por la vena cava superior (en la parte superior), la vena cava inferior (en la parte inferior) y la cristae terminalis (a la izquierda) (Figura 4D).
    NOTA: La crista terminalis aparece como una cresta muscular oscura entre el apéndice auricular derecho y el SAN. A menudo, la arteria SAN también se puede ver corriendo a través de la SAN(Figura 4D).

7. Preparación del sistema MEA para la grabación

1. Agregue la solución de Tyrode (del paso 3) a la botella de solución de entrada(Figura 5C)y oxigenarla activando el flujo de gas carbógeno(Figura 5A)al sistema.
   NOTA: La solución de Tyrode utilizada para la grabación es ligeramente diferente en composición de la solución de Tyrode completa utilizada para la disección.
2. Verificar el flujo de carbógeno observando burbujas en el matraz cónico, que se utiliza para humidificar el gas (Figura 5B), y la botella de solución de entrada (Figura 5C).
3. Inserte el tubo de entrada de la bomba peristáltica (Figura 5D) en la solución de grabación del Tyrode (Figura 5C). A continuación, inserte el tubo de salida de la bomba peristáltica en la botella de recogida (Figura 5I).
4. Fije la bomba peristáltica a 25 rpm, lo que da un caudal de 2 ml / min y arranque la bomba. Compruebe el sistema para detectar cualquier fuga o desbordamiento del búfer.
5. Ajuste el controlador de temperatura a 37 °C, la temperatura fisiológica de los ratones (Figura 5E).

8. Colocación del tejido cardíaco en la rejilla MEA

1. Transfiera el tejido SAN diseccionado con la ayuda de un pincel (Figura 6A) de la placa de Petri de disección a la rejilla MEA (Figura 1A1).
   1. Mientras mira bajo un microscopio invertido, coloque suavemente el tejido con un pincel suave para que la región SAN superponga la rejilla del electrodo.
   2. Vuelva a colocar el tejido según sea necesario para asegurarse de que se coloque plano en la rejilla del electrodo, haciendo un buen contacto con los electrodos.
      NOTA: Se requiere un pincel suave para mover el tejido para evitar dañar la rejilla del electrodo.
2. Una vez que el tejido esté correctamente posicionado, use fórceps óseos (o cualquier fórceps curvo) para colocar la malla sobre el tejido (Figura 6A). Luego use las fórceps óseas para colocar el anclaje del arpa(Figura 6A)en la malla para mantener todo en su lugar(Figura 6B).
3. Tome una foto del posicionamiento del tejido en el MEA para que la actividad de los electrodos individuales pueda correlacionarse con su ubicación anatómica durante el registro. Esto se puede hacer sosteniendo un teléfono inteligente hasta el objetivo del microscopio invertido o utilizando una cámara de microscopio conectada.
   NOTA: Si la orientación del MEA no cambia después de tomar la foto, el electrodo superior izquierdo aparecerá como el primer canal (Ch1) durante la grabación.
4. Coloque el plato MEA en la placa conectora (Figura 5F y 6C) y coloque cuidadosamente la tapa de perfusión (Figura 6C) en el plato MEA sin perturbar el anclaje de la rodaja de arpa. La tapa de perfusión se puede asegurar aún más utilizando un trozo de cinta de laboratorio(Figura 6C).
   NOTA: Además de tener tuberías de entrada y salida de solución ajustables, la tapa también tiene un puerto para la entrega de gas(Figura 6C). Además, el anillo de electrodo de referencia atraviesa la tapa(Figura 6C).
5. Permita que el tejido se recupere de la manipulación y se aclimate a la cámara durante 15-20 minutos antes de la grabación.

9. Configuración del protocolo de adquisición de datos para el registro

NOTA: Los siguientes pasos describen la apertura del protocolo de software para la grabación espontánea de ritmos y la definición de las condiciones de grabación. Los detalles de estos pasos pueden variar según el software específico que se utilice, pero el esquema general debe seguir siendo el mismo.

1. Encienda el amplificador (Figura 5G )y configure un flujo de trabajo para la grabación en el software de la computadora (Figura 5H).
   1. Abra el software y haga clic en flujo de trabajo.
   2. Seleccione Abrir nueva carpeta.
   3. Abra la carpeta Desde plantillas.
   4. Seleccione 64MD1-1920X1080 (dependiendo de la resolución de su escritorio).
   5. Abra la carpeta QT.
   6. Abra la carpeta Grabación espontánea.
   7. Seleccione Beat_recording.moflo y ábrala (Figura 7A).
2. Establezca los parámetros de registro para especificar el número de trazas, la duración de la traza, el intervalo de traza, la tensión de entrada, la frecuencia de muestreo, etc., de acuerdo con las condiciones de grabación deseadas(Figura 7B).
   NOTA: Para la frecuencia de latido y la adquisición de datos entre circuitos, normalmente utilice un voltaje de rango de entrada de 2,9 mV, un filtro de paso alto de 1 Hz, un filtro de paso bajo de 1000 Hz y una frecuencia de muestreo de 20 kHz.
3. Para marcar diferentes fases o condiciones del experimento, como antes y después de la administración del fármaco, haga clic en la pestaña Anotaciones para agregar las notaciones deseadas(Figura 7C).
4. Para especificar el destino del archivo para los datos que se van a recopilar, seleccione el cuadro Habilitar almacenamiento e introduzca el nombre de archivo deseado en el cuadro Modificador de nombre de archivo.

10. Realización del registro y recopilación de datos

1. Haga clic en el botón Grabar y reproducir en la barra de menú superior del software de adquisición para iniciar la grabación. Adquiera datos para 10 trazas de 1 min de duración con intervalos de 2 min entre trazas.
2. A partir de estos rastros iniciales, verifique que las formas de onda registradas sean consistentes con una preparación de tejido sana y de alta calidad confirmando que la mayoría de los canales de grabación exhiben amplitudes de señal de ≥ 0.5 mV e intervalos interespágulos idénticos(Figura 8).
   NOTA: Se puede realizar una evaluación inicial de la actividad y las formas de onda de los microelectrodos individuales correspondientes a sus ubicaciones anatómicas haciendo referencia a la imagen adquirida después de posicionar el tejido en el MEA.
3. Para medir los efectos de los medicamentos en el tejido, detenga la grabación después de adquirir los datos iniciales de referencia haciendo clic en el botón de pausa en la barra de menú superior.
   NOTA: La fase de respuesta al fármaco del experimento se puede anotar en la grabación haciendo clic en la pestaña Anotaciones y agregando la notación deseada como se describe anteriormente(Figura 7C).
4. Detenga la bomba y cambie el tubo de entrada de la bomba de la solución de grabación normal a la solución de Tyrode que contiene el medicamento deseado de su elección.
   NOTA: En el experimento de ejemplo, la solución de Tyrode se utilizó con 1 mM de 4-aminopiridina (4-AP).
5. Reinicie la bomba y desen pausar la grabación para comenzar a recopilar datos nuevamente.
6. Una vez que la solución de Tyrode con infusión de fármaco haya llegado al tejido, registre 10 trazas de la misma manera que se hizo anteriormente para los registros de referencia.
   NOTA: Los rastros tardarán algún tiempo en estabilizarse a medida que el medicamento se infunde en la cámara de grabación. El mecanismo de acción de la droga también puede afectar la estabilidad del registro. Para los medicamentos que tienen mecanismos de acción reversibles, también se debe registrar un período de lavado para confirmar la restauración de la actividad a los niveles basales, que es un indicador de tejido sano.
7. Haga clic en Detener para concluir las grabaciones.
8. Tome una imagen final del posicionamiento del tejido en el MEA bajo el microscopio en caso de que el tejido se haya desplazado después del procedimiento de configuración de registro inicial.

11. Limpieza de la configuración después de la grabación

1. Limpie el MEA.
   1. Después de terminar la grabación, retire suavemente la solución de grabación del plato MEA con una micropipeta de 1 ml.
      NOTA: Tenga cuidado de no contactar con los electrodos MEA que pueden dañarlos.
   2. Retire la malla y el anclaje del arpa con fórceps de hueso (o cualquier fórceps curvo). Luego use un pincel para desalojar el tejido de la superficie MEA siempre teniendo cuidado de no tocar los microelectrodos individuales.
   3. Usando una botella de lavado, enjuague suavemente el plato MEA con agua ultrapura aproximadamente de 3 a 4 veces.
   4. Guarde el MEA limpio sumergido en agua ultrapura a 4 °C.
2. Enjuague el tubo del sistema haciendo pasar agua ultrapura a través de él durante al menos 5 minutos utilizando el ajuste de velocidad máxima en la bomba peristáltica.
   NOTA: Para prevenir el crecimiento de hongos, no se debe dejar agua ni solución tampón dentro del tubo después de la limpieza.

12. Análisis de las grabaciones MEA para medir la frecuencia de latido san

1. Abra el archivo de datos grabados guardados en la plantilla "Beat_frequency_analysis" del software de análisis (Figura 9).
2. Haga clic en el botón Reproducir y permita que se ejecute toda la grabación para visualizar el conjunto de datos y asignar los parámetros de análisis apropiados.
   1. Seleccione la ventana de binning para el formato de visualización deseado de los datos, ya sea que se muestre como un promedio por traza o promedio por tiempo (Figura 10A).
   2. Seleccione los canales que se incluirán en el análisis y establezca los valores máximos de amplitud o umbral de amplitud mínima deseados para la identificación automatizada de picos de forma de onda(Figura 10B).
      NOTA: Se puede seleccionar un canal individual, una combinación de canales o los 64 canales para su análisis en este paso(Figura 9). Si los valores umbral seleccionados están demasiado cerca de los valores máximos y mínimos de la forma de onda, es posible que el software de análisis no identifique algunos picos de forma de onda.
   3. Establezca la cantidad de tiempo previo y posterior al pico que se incluirá en el análisis.
      NOTA: Los ajustes de 50 ms antes del pico y 100 ms después del pico generalmente funcionan bien(Figura 10B).
3. Después de establecer las condiciones de análisis, haga clic en el botón Reproducir nuevamente para volver a ejecutar el conjunto de datos y confirmar que los parámetros de análisis son apropiados para la extracción de picos.
4. Para el análisis, identifique las tres trazas consecutivas más estables que exhiben una tasa de latido estable para cada traza en la mayoría de los canales tanto durante el período de referencia del experimento como otras tres trazas estables consecutivas durante el período de exposición al fármaco(Figura 10A).
5. Especifique las trazas de inicio y finalización para el análisis e introduzca la duración temporal de cada traza que se analizará (Figura 9).
6. Antes de comenzar el análisis, seleccione las casillas de habilitación tanto para Guardar latido por minuto como para Guardar intervalo entre intercalaciones (Figura 10B).
7. Escriba el nombre de archivo deseado en el cuadro Modificador de nombre de archivo ( Figura10B). Los datos analizados para la frecuencia de latido y el intervalo entre intervalos se guardarán en forma de formato ASCII (texto).
   NOTA: Para analizar diferentes condiciones (como la línea de base y la respuesta al fármaco), el análisis debe ejecutarse por separado para cada afección.
8. Haga clic en el botón Reproducir y grabar en la barra de pestañas superior para iniciar el análisis.
9. Para exportar los datos de otras aplicaciones, seleccione las casillas Guardar latido por minuto y Guardar intervalo entre intervalos (Figura 10B). Introduzca el nombre de archivo deseado en el cuadro Modificador de nombre de archivo ( Figura10B) y haga clic en Guardar para guardar los datos analizados en formato de texto ASCII en la carpeta seleccionada.

Después de permitir que el tejido se aclimate en el plato durante 15 minutos, se registran 10 rastros de un minuto. Nuestro protocolo actual registra la actividad durante más de una hora, pero hemos registrado patrones de disparo estables durante ≥4 h en datos no publicados que no se muestran aquí. Si una preparación experimental es buena para la recopilación de datos, cada canal de grabación debe exhibir formas de onda recurrentes consistentes y espaciadas uniformemente (es decir, picos) de forma uniforme para un canal dado(Figura 11D). Estas formas de onda corresponden a latidos cardíacos individuales que reflejan la actividad intrínseca de marcapasos cardíaco. Los intervalos entre canales deben ser los mismos para todos los canales, incluso si no están perfectamente alineados entre canales debido a pequeñas diferencias en su ubicación en relación con el sitio de iniciación de la despolarización(Figura 8). Aunque la forma de las formas de onda para un canal dado debe ser consistente, la forma de las formas de onda variará a través de los canales dependiendo de la ubicación del electrodo en el tejido (Figura 8). El grado de contacto del tejido con el electrodo también puede influir en las características de la forma de onda, como la amplitud. Sin embargo, los máximos de amplitud deben ser de al menos 0,5 mV para la mayoría de los canales si la preparación es satisfactoria. De los 10 rastros registrados, se eligieron los tres canales consecutivos que mejor cumplen con los criterios de calidad descritos anteriormente para un análisis más detallado que se describe a continuación. La Figura 10A muestra una muestra de frecuencia de latido estable (panel superior) e intervalo entre intercalaciones (panel central) para tres trazas consecutivas. El tejido que no cumple con estos criterios no debe registrarse, ya que es probable que haya daños tisulares que dificulten la recopilación de datos precisos. La Figura 11 muestra ejemplos de malos patrones de picos extraídos que están ausentes (A), influenciados por el ruido (B) o inestables (C).

Los datos de la muestra que se muestran en las figuras se recolectaron de un ratón macho de 45 días de edad, de tipo salvaje negro suizo (Tac: N: NIHS-BC). El procedimiento de análisis descrito en la Figura 9 y la Figura 10 se utilizó para extraer la velocidad de disparo intrínseca y mostrar los picos de referencia que se pueden ver en la Figura 12A. La tasa de disparo es la tasa promedio a través de 60,000 ms de cada uno de los tres rastros, pero el patrón de pico en la Figura 12A muestra 5 s de pico representativo de un solo rastro. Utilizando un software de análisis automatizado, se encontró que la velocidad de disparo intrínseca (es decir, la frecuencia de latido) de los tres rastros seleccionados en los 64 canales era de aproximadamente 320 lpm en nuestros datos de muestra(Figura 12A). En general, observamos un rango de valores de aproximadamente 290-340 lpm en nuestros registros para ratones de tipo salvaje. La velocidad de cocción también se puede utilizar como un método secundario para evaluar la calidad de la preparación. Las tasas que son inestables o significativamente más bajas que 300 lpm tienen menos probabilidades de ser buenas para el análisis. Estos valores son comparables tanto a los registros aislados del corazón como a los registros de células individuales que informan frecuencias cardíacas intrínsecas en el rango de aproximadamente 300-500 lpm25,48,49. Por lo tanto, la técnica de registro MEA es capaz de generar medidas confiables y precisas de la frecuencia cardíaca intrínseca.

Una ventaja del sistema MEA es que permite una fácil aplicación de agentes farmacológicos para probar los efectos farmacológicos. En el experimento de muestra, probamos los efectos de 1 mM 4-AP sobre la velocidad de disparo, lo que debería ralentizar la actividad de SAN ya que se sabe que el bloqueo de los canales K+ controlados por voltaje perjudica la repolarización del potencial de acción en las células SA24,50. La Figura 12B muestra que la introducción de 4-AP aumentó los intervalos entre intervalos como se esperaba. Este intervalo de pico prolongado correspondió a una disminución en la frecuencia de latido de 320 lpm a 210 bpm. Esta velocidad de disparo después de la administración de 4-AP es similar a un estudio anterior que examinó los efectos de 4-AP en la velocidad de disparo de SAN utilizando registros de un solo electrodo de tejido aislado. Ese estudio midió una tasa de disparo de aproximadamente 190 lpm en presencia de 4-AP50. Por lo tanto, el sistema MEA se puede utilizar como una herramienta conveniente y valiosa para probar los efectos farmacológicos de las intervenciones farmacológicas sobre la función cardíaca intrínseca.

Figura 1: Recubrimiento de la matriz demicroelectrodos (MEA) antes de su uso. (A) El MEA se compone de un pequeño plato de plástico con una matriz de rejilla de 64 microelectrodos en el centro (como se muestra en el panel A1) y cuatro electrodos de referencia alrededor de la periferia en un patrón cuadrado. (B) Adición de 1 ml de tampón PEI para recubrir el MEA. (C) Cubrir el plato MEA con película termoplástica para incubar durante la noche a temperatura ambiente. (D) Aspiración del tampón PEI del plato MEA, seguido de al menos cuatro enjuagues con agua destilada. (E) Almacenamiento de la sonda MEA recubierta bajo agua ultrapura para evitar que se seque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Herramientas utilizadas para la disección del ganglio sinoauricular (SAN). Durante la parte de disección del protocolo se utilizan las siguientes herramientas: (i) placa de Petri con elastómero de silicona y pequeños pasadores de disección; ii) Pipeta de transferencia de plástico; (iii) Tijera Castroviejo, talla 4"; iv) Tijeras quirúrgicas (rectas) para procedimientos de corte; v) Fórceps de laminectomía #2 dumont; vi) Fórceps de #55 Dumont; vii) Fórceps Graefe extra finos; (viii) Hemostáticos (curvos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Extracción del corazón. (A) Incisión transversal en la piel justo debajo de la parte inferior de la caja torácica desde aproximadamente el arco costal izquierdo hasta el arco costal derecho. (B) Incisión peritoneal. (C,D) Incisión del diafragma a lo largo del tórax para exponer la cavidad torácica. (E) Extirpación del corazón después de la escisión de los pulmones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Disección del nódulo sinoauricular (SAN). (A) La apariencia del corazón en la placa de Petri después de la extracción del cuerpo. (B) Inserción de la aguja de la jeringa a través de la vena cava inferior (IVC) y la vena cava superior (SVC) de la aurícula derecha. También se muestra el alfiler en el ápice del corazón. (C) Escisión del ápice (es decir, la mitad inferior) del corazón para liberar la sangre. También se muestran los alfileres en los apéndices auriculares. (D) La apariencia final de la región SAN de la aurícula derecha al final de la disección. La región en caja corresponde a la ubicación aproximada del SAN. La arteria SAN también se puede ver débilmente corriendo a través de la SAN en una orientación vertical. Las abreviaturas: AO, aorta; TC crista terminalis; IVC: vena cava inferior; LA, aurícula izquierda; AR: aurícula derecha; RAA: apéndice auricular derecho; SAN: nódulo sinoauricular; SVC, vena cava superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Esquema de la configuración del sistema de grabación de la matriz de microelectrodos (MEA). Los siguientes componentes componen el sistema: (A) cilindro de gas (carbógeno: 95% O2/ 5% CO2); B)matraz cónico con agua destilada para humidificar el gas; (C) registrar la botella de solución de Tyrode que proporciona entrada al plato MEA; (D) bomba peristáltica para bombear la solución hacia y desde el plato MEA; (E) regulador de temperatura; (F) Placa conectora MEA que recibe señales del plato MEA; (G) amplificador; (H)computadora; (I) botella de recogida para la solución de residuos usada del plato MEA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Posicionamiento del tejido ganglionar SA en MEA. (A) Herramientas utilizadas en el posicionamiento del tejido: (i) Malla con tamaño de rejilla de 1,5 mm, (ii) anclaje de arpa, (iii) pinzas de hueso, (iv) pincel. (B) Posicionamiento del tejido en el MEA. El cuadro amarillo indica el área aproximada de la región del nódulo sinoauricular debajo de la malla y el anclaje en el plato MEA. ( C) Disposición del plato MEA con tejido encerrado en la placa conectora para el registro del potencial de campo: (i) entrada para la solución de grabación; ii) entrada de gas (carbógeno); iii) salida para la solución; iv) placa conectora de microelectrodos; v) tapón de perfusión; vi) anillo de electrodo de referencia unido a la tapa; vii) cinta adhesiva para sujetar la tapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Configuración del protocolo de adquisición de datos en el software. (A) Un ejemplo de plantilla de grabación que muestra la disposición de los 64 canales. (B) Un ejemplo de las propiedades de entrada de software para las condiciones de grabación. (C) Un ejemplo del menú Anotaciones que muestra cómo agregar una nueva fase durante la grabación, por ejemplo, para medir los efectos de las drogas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Diferentes regiones de los tejidos que muestran diferentes formas de onda de actividad. Ejemplo de captura de pantalla que muestra formas de onda con diferentes formas y amplitudes en diferentes canales. Sin embargo, todos los canales muestran intervalos entre canales y frecuencias de disparo idénticos. Los canales dentro de la caja roja corresponden aproximadamente a los electrodos colocados dentro de la región SAN del tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Plantilla de análisis de frecuencia de latidos. Plantilla de ejemplo que muestra la disposición de los 64 canales en la plantilla de análisis de frecuencia de latido. El recuadro Reproducir archivo de datos sin procesar muestra un ejemplo de las propiedades de entrada de la ventana de análisis. En este ejemplo, se han seleccionado las trazas 5 a 7 para el análisis y la duración del análisis para cada traza se ha designado como 60.000 ms. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Definición de parámetros de análisis para la extracción de picos. (A) Resultados representativos de la plantilla de análisis para 3 trazas seleccionadas de un solo canal. El panel superior muestra la frecuencia de latido para las tres trazas seleccionadas (tres agrupaciones definidas de puntos de datos), y cada punto representa un promedio de 10 s para la frecuencia de latido durante la traza específica. El panel central muestra el intervalo entre picos para los tres seguimientos seleccionados (tres agrupaciones definidas de puntos de datos), y cada punto de datos representa el intervalo entre picos entre picos consecutivos. El panel inferior izquierdo muestra picos extraídos representativos seleccionados para las últimas 5 s de la tercera traza, mientras que el panel inferior derecho muestra una forma de onda extraída derivada del grupo 5-s de picos extraídos en el panel inferior izquierdo. (B) Vista ampliada de la ventana de análisis que muestra los parámetros utilizados en el análisis de la frecuencia de latido para las 3 trazas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Figura representativa que muestra la extracción de datos buenos frente a malos para un canal en particular. Mala extracción de datos: (A) Ausencia de picos extraídos; (B) Picos extraídos con señales de ruido; (C) Picos extraídos inestables. (D) Buenos datos que muestran picos extraídos estables sin señales de ruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Registros al inicio y después de la administración de 1mM 4-Aminopiridina (4-AP). (A) El registro de línea de base de un solo microelectrodo muestra formas de onda con una frecuencia de disparo estable de 320 lpm en un corazón WT. (B) Después de la administración de 4-AP, la frecuencia de disparo disminuye a una velocidad estable de 210 lpm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.