Este protocolo tiene como objetivo describir una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca utilizando el registro de la matriz de microelectrodos de todo el tejido del ganglio sinoauricular para identificar defectos de marcapasos en ratones. Los agentes farmacológicos también se pueden introducir en este método para estudiar sus efectos sobre el marcapasos intrínseco.
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Artículo de método
Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
El nódulo sinoauricular (SAN), ubicado en la aurícula derecha, contiene las células marcapasos del corazón, y la disfunción de esta región puede causar taquicardia o bradicardia. La identificación confiable de los defectos cardíacos de marcapasos requiere la medición de las frecuencias cardíacas intrínsecas mediante la prevención en gran medida de la influencia del sistema nervioso autónomo, que puede enmascarar los déficits de tasa. Los métodos tradicionales para analizar la función intrínseca del marcapasos cardíaco incluyen bloqueo autónomo inducido por medicamentos para medir las frecuencias cardíacas in vivo, registros cardíacos aislados para medir las frecuencias cardíacas intrínsecas y registros de tira sinoauricular o pinza de parche de una sola célula de células de marcapasos sinoauriculares para medir las tasas de disparo potencial de acción espontánea. Sin embargo, estas técnicas más tradicionales pueden ser técnicamente desafiantes y difíciles de realizar. Aquí, presentamos una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca mediante la realización de registros de matriz de microelectrodos (MEA) de preparaciones de ganglios sinoauriculares de montaje completo de ratones. Los AMUMA están compuestos por múltiples microelectrodos dispuestos en un patrón similar a una cuadrícula para registrar potenciales de campo extracelular in vitro. El método descrito en este documento tiene la ventaja combinada de ser relativamente más rápido, más simple y más preciso que los enfoques anteriores para registrar las frecuencias cardíacas intrínsecas, al tiempo que permite un fácil interrogatorio farmacológico.
Introducción
El corazón es un órgano complejo gobernado por influencias cardíaco-intrínsecas y extrínsecas como las que se originan en el cerebro. El nódulo sinoauricular (SAN) es una región definida en el corazón que alberga las células marcapasos (también conocidas como células sinoauriculares o células SA) responsables de la iniciación y perpetuación de los latidos del corazón de los mamíferos1,2. La frecuencia cardíaca intrínseca es la velocidad impulsada por las células marcapasos sin influencia de otras influencias cardíacas o neuro-humorales, pero las medidas tradicionales de la frecuencia cardíaca en humanos y anim....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales descritos aquí se han llevado a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Metodista del Sur.
1. Recubrimiento de la matriz multielectrodo (MEA) para la grabación
- Haga un búfer de borato de 25 mM.
- Disolver 0,953 g de Na2B4O7·10 H2O en 80 mL de agua destilada.
- Ajuste el pH a 8.4 con HCl y luego agregue agua destilada a un volumen final de 100 ml.
- Haga una solución de poli....
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Resultados
Después de permitir que el tejido se aclimate en el plato durante 15 minutos, se registran 10 rastros de un minuto. Nuestro protocolo actual registra la actividad durante más de una hora, pero hemos registrado patrones de disparo estables durante ≥4 h en datos no publicados que no se muestran aquí. Si una preparación experimental es buena para la recopilación de datos, cada canal de grabación debe exhibir formas de onda recurrentes consistentes y espaciadas uniformemente (es decir, picos) de forma uniforme para un canal .......
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Discusión
Practicar y dominar el proceso de disección de SAN es imperativo ya que el tejido es frágil y el tejido sano es necesario para una grabación exitosa. Durante la disección san, la orientación correcta es esencial para obtener la región adecuada del tejido. Sin embargo, la orientación original del corazón puede perderse fácilmente durante el proceso de disección, lo que complica este esfuerzo. Por lo tanto, para garantizar la orientación adecuada de izquierda a derecha, las aurículas deben inspeccionarse visualmente. Típic.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, números de subvención R01NS100954 y R01NS099188.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopiridina | Sigma | A78403-25G | |
| aguja de jeringa de calibre 22 | Fisher Scientific | 14-826-5A | Se utiliza para la disección |
| aguja de jeringa de calibre 23 | Fisher Scientific | 14-826-6C | Se utiliza para la disección |
| Placas de Petri de 60 mm | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Botella Pyrex | Fisher Scientific | 06-414-1C | Se utiliza para almacenar soluciones |
| 1000 mL Botella de Pyrex | Fisher Scientific | 06-414-1D | Se utiliza para almacenar soluciones |
| Pinzas para huesos | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Cárbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Tijeras Castroviejo, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| PC | de adquisición de datosCPU: Intel Xeon o Intel Core i7, Memoria: 8 GB, HDD: 1 TB, Tarjeta gráfica: NVIDIA o integrada, Pantalla: 1920x1080 | ||
| Microscopio de disección | Jenco | ||
| Pines de disección | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Pinzas de laminectomía | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Pinzas | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Pinzas de Graefe Extra Finas | Herramientas de Ciencia Fina | 11152-10 | |
| Cámara de Vidrio | Grainger | 49WF30 | Utilizado para la eutanasia de ratones |
| Kit de anclaje de arpa | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | utilizado para el equilibrio del pH |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparina | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Microscopio invertido | Motic | AE2000 | |
| Isoflurano | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Cinta de laboratorio | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Luz para microscopio de disección | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Cloruro de magesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Amplificador | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Amplificador principal | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Tapón de perfusión | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Kit de soporte de tubo de perfusión | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 Termoconector | MED64 | MED-CP04 | |
| Malla | Warner Instruments | 640246 | |
| Matriz de microelectrodos (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Software específico para el MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | utilizado para el equilibrio del pH |
| Solución salina normal | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Pincel | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Bomba peristáltica | Gilson | F155009 | |
| Tubo de bomba peristáltica | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' diámetro interior |
| Polietileneimina | Sigma | P3143 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodio Bicarbonato | Sigma | S6297 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Kit de elastómero | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma | S6566 | |
| Tetraborato de sodio | Sigma | S9640 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Pipetas de transferencia (3mL graduadas) | Samco Scientific | 225 |
Referencias
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....
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Reimpresiones y permisos
