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Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones

DOI:

10.3791/62735

⸱

July 5th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo tiene como objetivo describir una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca utilizando el registro de la matriz de microelectrodos de todo el tejido del ganglio sinoauricular para identificar defectos de marcapasos en ratones. Los agentes farmacológicos también se pueden introducir en este método para estudiar sus efectos sobre el marcapasos intrínseco.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El nódulo sinoauricular (SAN), ubicado en la aurícula derecha, contiene las células marcapasos del corazón, y la disfunción de esta región puede causar taquicardia o bradicardia. La identificación confiable de los defectos cardíacos de marcapasos requiere la medición de las frecuencias cardíacas intrínsecas mediante la prevención en gran medida de la influencia del sistema nervioso autónomo, que puede enmascarar los déficits de tasa. Los métodos tradicionales para analizar la función intrínseca del marcapasos cardíaco incluyen bloqueo autónomo inducido por medicamentos para medir las frecuencias cardíacas in vivo, registros cardíacos aislados para medir las frecuencias cardíacas intrínsecas y registros de tira sinoauricular o pinza de parche de una sola célula de células de marcapasos sinoauriculares para medir las tasas de disparo potencial de acción espontánea. Sin embargo, estas técnicas más tradicionales pueden ser técnicamente desafiantes y difíciles de realizar. Aquí, presentamos una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca mediante la realización de registros de matriz de microelectrodos (MEA) de preparaciones de ganglios sinoauriculares de montaje completo de ratones. Los AMUMA están compuestos por múltiples microelectrodos dispuestos en un patrón similar a una cuadrícula para registrar potenciales de campo extracelular in vitro. El método descrito en este documento tiene la ventaja combinada de ser relativamente más rápido, más simple y más preciso que los enfoques anteriores para registrar las frecuencias cardíacas intrínsecas, al tiempo que permite un fácil interrogatorio farmacológico.

Introduction

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El corazón es un órgano complejo gobernado por influencias cardíaco-intrínsecas y extrínsecas como las que se originan en el cerebro. El nódulo sinoauricular (SAN) es una región definida en el corazón que alberga las células marcapasos (también conocidas como células sinoauriculares o células SA) responsables de la iniciación y perpetuación de los latidos del corazón de los mamíferos1,2. La frecuencia cardíaca intrínseca es la velocidad impulsada por las células marcapasos sin influencia de otras influencias cardíacas o neuro-humorales, pero las medidas tradicionales de la frecuencia cardíaca en humanos y anim....

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Protocol

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Todos los procedimientos experimentales descritos aquí se han llevado a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Metodista del Sur.

1. Recubrimiento de la matriz multielectrodo (MEA) para la grabación

  1. Haga un búfer de borato de 25 mM.
    1. Disolver 0,953 g de Na2B4O7·10 H2O en 80 mL de agua destilada.
    2. Ajuste el pH a 8.4 con HCl y luego agregue agua destilada a un volumen final de 100 ml.
  2. Haga una solución de poli....

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Results

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Después de permitir que el tejido se aclimate en el plato durante 15 minutos, se registran 10 rastros de un minuto. Nuestro protocolo actual registra la actividad durante más de una hora, pero hemos registrado patrones de disparo estables durante ≥4 h en datos no publicados que no se muestran aquí. Si una preparación experimental es buena para la recopilación de datos, cada canal de grabación debe exhibir formas de onda recurrentes consistentes y espaciadas uniformemente (es decir, picos) de forma uniforme para un canal .......

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Discussion

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Practicar y dominar el proceso de disección de SAN es imperativo ya que el tejido es frágil y el tejido sano es necesario para una grabación exitosa. Durante la disección san, la orientación correcta es esencial para obtener la región adecuada del tejido. Sin embargo, la orientación original del corazón puede perderse fácilmente durante el proceso de disección, lo que complica este esfuerzo. Por lo tanto, para garantizar la orientación adecuada de izquierda a derecha, las aurículas deben inspeccionarse visualmente. Típic.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, números de subvención R01NS100954 y R01NS099188.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopiridinaSigmaA78403-25G
aguja de jeringa de calibre 22Fisher Scientific14-826-5ASe utiliza para la disección
aguja de jeringa de calibre 23Fisher Scientific14-826-6CSe utiliza para la disección
Placas de Petri de 60 mmGenesee Scientific32-105G
500mL Botella PyrexFisher Scientific06-414-1CSe utiliza para almacenar soluciones
1000 mL Botella de PyrexFisher Scientific06-414-1DSe utiliza para almacenar soluciones
Pinzas para huesosFine Science Tools16060-11
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Cárbogen (95% O2, 5% CO2)
Tijeras Castroviejo, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG7021-1KG
PCde adquisición de datosCPU: Intel Xeon o Intel Core i7, Memoria: 8 GB, HDD: 1 TB, Tarjeta gráfica: NVIDIA o integrada, Pantalla: 1920x1080
Microscopio de disecciónJenco
Pines de disecciónFine Science Tools26002-20
Dumont #2 Pinzas de laminectomíaFine Science Tools11223-20
Dumont #55 PinzasFine Science Tools11295-51
  Pinzas de Graefe Extra FinasHerramientas de Ciencia Fina11152-10
Cámara de VidrioGrainger49WF30Utilizado para la eutanasia de ratones
Kit de anclaje de arpaWarner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4utilizado para el equilibrio del pH
HemostatFine Science Tools13013-14
HeparinaAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Microscopio invertidoMoticAE2000
IsofluranoPatterson Veterinary07-893-1389
Cinta de laboratorioFisher Scientific15-950
Luz para microscopio de disecciónDolan-JennerMI150DG 660000391014
Cloruro de magesio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 AmplificadorMED64MED-A64HE1S
MED64 Amplificador principalMED64MED-A64MD1A
MED64 Tapón de perfusiónMED64MED-KCAP01
MED64 Kit de soporte de tubo de perfusiónMED64MED-KPK02
MED64 TermoconectorMED64MED-CP04
Malla  Warner Instruments640246
Matriz de microelectrodos (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Software específico para el MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500utilizado para el equilibrio del pH
Solución salina normalUltigieneNDC 50989-885-17
PincelFisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
Bomba peristálticaGilsonF155009
Tubo de bomba peristálticaFisher Scientific14-171-2981/8'' diámetro interior
PolietileneiminaSigmaP3143
Cloruro de potasio (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Sodio BicarbonatoSigmaS6297
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sylgruard Kit de elastómeroDow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fosfato de sodio monobásicoSigmaS6566
Tetraborato de sodioSigmaS9640
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools14074-09
Pipetas de transferencia (3mL graduadas)Samco Scientific225
principal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....

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